Name: Evaluación de la eficacia de la H. pylori Proteína HP-PAN como herramienta terapéutica para el tratamiento de cáncer de vejiga en un modelo murino ortotópico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Aprende a establecer un modelo ortotópico de cáncer de vejiga en ratones para evaluar la eficacia terapéutica de la proteína HP-NAP. Este método permite analizar histológicamente la respuesta antitumoral.

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Este trabajo fue apoyado por Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro, el Ministerio italiano de la Universidad e Investigación, proyectos Prin y Progetti di Ricerca di Ateneo, conceder N ° CPDA137871, Fondazione Cariplo, concede N ° 2011 hasta 0485 a los BMD, y por Finanziamento Giovani studiosi, Universidad de Padua, a Gaia Codolo.

Todos los procedimientos de manipulación de los animales han sido aprobados por el Ministerio italiano de Salud (204/2011-B DM). 1. Los animales <ol><li> Crecer ratones hembras C57BL6 / J a 8 semanas de edad en jaulas ventiladas individualmente con filtros microaislamiento. Se prefieren las hembras porque la conformación anatómica de su aparato uro-genital externa hace que el cateterismo más fácil que en los hombres: Nota. </li></ol> 2. Cultivo Celular <ol><li> Mantener la urotelial ratón línea celular de carcinoma MB49 en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor y 50 mg / ml de gentamicina a 37 ° C en humidificado 5% CO 2. </li><li> Crecer células MB49 en matraces T-75 a 80% de confluencia. Trypsinize y resuspender en el 0,5 × 10 5 a 0,5 × 10 6 células por 150 l de PBS antes de la implantación en ratones. </li></ol> 3. intravesical tumor Implante <ol><li> Anestesiar ratones utilizando una mezcla de la Zoletil anestésicos y xylor (33 mg / kg y 20 mg / kg, respectivamente), inyectado por vía intraperitoneal. </li><li> Coloque los animales en posición supina y fijar las patas traseras a la plataforma con cinta scotch. Patas tienen que ser separados suficientemente para hacer que el meato uretral bien visible y fácilmente accesible para la inserción del catéter. </li><li> Nota: Para el cateterismo, un catéter venoso pediátrico 24 G es adecuado para ratones 8 a 10 semanas de edad. La elección del catéter es muy importante con el fin de evitar fugas de líquido entre la pared uretral y el catéter. Catéteres de calibre más grandes deben ser utilizados para los ratones más grandes o más. </li><li> Utilizando una pequeña pinza, apriete uno de los bordes de la parte externa de la uretra y girar suavemente hacia la &quot;cabecera&quot; de los ratones. Esta acción expone el meato uretral. </li><li> Retire la aguja interna del catéter e insertar este último en la uretra en un ángulo de 45 °, orientado ligeramentehacia la &quot;cola&quot; de los ratones. No fuerce la entrada del catéter; en caso de resistencia, simplemente gire el catéter con mucha suavidad, hasta que se desliza dentro de la uretra. Cuando aproximadamente 0,5-0,8 cm del catéter es en la uretra, colocar cuidadosamente el catéter paralelo a la cola de los ratones y se inserte completamente. </li><li> Usando una jeringa de 1 ml, la aguja de los cuales tiene que ser insertado en el catéter, lavar la vejiga de la orina residual mediante la inyección de 200-300 l de PBS estéril y aspirar todo el líquido de la vejiga. </li><li> Nota: Cuando la inyección de PBS, la vejiga se llenará y una hinchazón será visible entre las patas traseras de los ratones; esto confirma que el cateterismo es la correcta. La mayoría de los catéteres tienen un volumen muerto que debe ser considerado en el cálculo del volumen de inyección. </li><li> Usando una jeringa de 1 ml estéril, inyectar 200 l de HCl 0,1 N. Llene la vejiga para quemar toda su pared. Después de 10 segundos, retire todo el ácido y neutrali inmediatamenteze mediante la inyección de 200 l de NaOH 0,1 N con una jeringa estéril. En el caso de la inyección del mayor número de células (0,5 × 10 6), no se requiere la etapa de acidificación. </li><li> Aspire todo el líquido residual e inmediatamente echar la cavidad con 300 l de PBS estéril. </li><li> Vaciar la vejiga por aspiración, e inyectar 150 l de PBS que contienen células MB49 (rango de 0,5 × 10 5 a 0,5 × 10 6) en la vejiga. Deje la jeringa montada en el catéter para evitar la fuga de células. Es mejor para asegurar la jeringa fijándolo a la plataforma con cinta scotch. </li><li> Después de 1 hora, extraer suavemente el catéter de la uretra, y colocar los ratones en la jaula, bajo una lámpara incandescente hasta que despiertan: esto ocurre generalmente entre 1 y 2 horas después del final del tratamiento. </li></ol> 4. Entrega intravesical de HP-PAN <ol><li> Nota: Por lo menos 3 días después de la instilación de células, es posible comenzar latratamiento. </li><li> Cateterizarse como se describe en los pasos 3.1 a 3.4. En esta etapa, no es necesario para quemar la pared de la vejiga con HCl. </li><li> Usando una jeringa de 1 ml, lavar la vejiga de la orina residual mediante la inyección de 200-300 l de PBS estéril y aspirar todo el líquido de la vejiga. </li><li> Inyectar 50 g de HP-PAN por 150 l de PBS en la vejiga. Deje la jeringa conectada al catéter para evitar la fuga de la solución de proteína. Asegure la jeringa fijándolo a la plataforma con cinta scotch. </li><li> Después de 1 hora, extraer suavemente el catéter de la uretra y colocar los ratones en la jaula, bajo una lámpara incandescente, hasta que se despiertan. </li></ol> 5. tumor explantes y el análisis histológico <ol><li> Al final del tratamiento, sacrificar a los animales, colocarlos en posición supina y fijar las patas traseras a la plataforma con cinta scotch. </li><li> El uso de un bisturí quirúrgico, hacer una incisión vertical sobre 1,52 cm de largo a través de la piel y elperitoneo, empezando justo por encima de los genitales externos de la &quot;cabecera&quot; de los ratones. Para minimizar el riesgo de dañar la vejiga, prestar especial atención a la profundidad del corte. </li><li> La vejiga se colocará en el centro-izquierda de la corte y el tumor será visible como una masa de color rosa / violeta oscuro. Tras su escisión, coloque toda la vejiga en una jaula histológico y fijar en el 10% formalina tamponada antes de la incrustación en parafina. </li><li> Para análisis histológico e histoquímico inmune, preparar secciones en serie de la vejiga (46 micras de espesor) usando un microtomo estándar. </li><li> Tinción de las secciones con hematoxilina / eosina y proceder con el cálculo del tamaño del tumor (D xd 2) y determinar el porcentaje de necrosis por área de sección transversal usando un analizador de imagen asistida por ordenador. </li><li> Para el conteo buque, proceder por la tinción de las secciones para el marcador endotelial CD31 / PECAM, utilizando una técnica de inmunoperoxidasa estándar. Analiza las secciones de unt baja potencia (4 ×) para identificar el área de mayor densidad vascular. Dentro de esta región, cuente microvasos individuales en cinco campos aleatorios independientes a alta potencia (20 ×). </li></ol>

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<li>Horiguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+orthotopic+mouse+superficial+bladder+tumor+model+for+studies+on+intravesical+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Cell%22%5BJournal%5D)">Establishment of orthotopic mouse superficial bladder tumor model for studies on intravesical treatments.</a> Hum Cell. 21, 57-63 (2008).</li>
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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

La mayoría de los avances en el tratamiento del cáncer requiere pruebas en modelos animales antes de comenzar los ensayos clínicos. La posibilidad de estudiar la biología del tumor in vivo, aprovechando modelos animales, representa una herramienta fundamental para los investigadores que investigan la patogénesis del cáncer, lo que permite la evaluación de los diferentes enfoques terapéuticos. Modelos ortotópico siguen siendo el estándar de oro 14-15, tanto debido a la enorme cantidad de líneas celula...

El cáncer de vejiga es uno de los cánceres más comunes del tracto urogenital, con cerca de 75.000 nuevos casos cada año en los EE.UU. 1. Las altas tasas de recurrencia requieren seguimiento de por vida, lo que hace que el cáncer de vejiga uno de los cánceres más costosas de tratar. El tratamiento estándar de oro para el alto grado CVNMI es la resección transuretral, seguida de inmunoterapia intravesical con BCG. Aunque el mecanismo exacto de la actividad anti-tumor de BCG aún no se ha aclarado completamente, se acepta que la activación de una respuesta inmune mediada por células enriquecido en T helper (Th) 1 y T citotóxicas (Tc) de las células 1 es crucial para el éxito de la terapia 2. A pesar de que la BCG sigue siendo el tratamiento de elección para CVNMI, una alta proporción de los pacientes no responden a la terapia; por otra parte, puede causar una serie de efectos secundarios: alrededor del 70% de los tumores tratados se repita después de algún tiempo y ~ 15% de avance a la forma del músculo invasivo de laenfermedad. Otros efectos secundarios asociados con el tratamiento con BCG incluyen disuria, cistitis y la infección renal 3-6. El desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas debe tomar en consideración el uso de modelos preclínicos, tras la evaluación inicial in vitro; esto es particularmente relevante en tumores cuya microambiente puede influir significativamente en su desarrollo y la capacidad de respuesta al tratamiento. Durante la última década, hemos abordado varios aspectos de la actividad inmunomoduladora de HP-PAN, una proteína producida por la bacteria Helicobacter pylori, identificado inicialmente como capaz de promover la adhesión endotelial de las células polimorfonucleares (PMN) 7. Estructuralmente, HP-PAN pertenece a la proteína DNA-protector en condiciones de hambre (AD) de la familia 8 y consta de 12 subunidades idénticas dispuestas en una cáscara dodecameric. Hemos demostrado que HP-NAP esun receptor Toll-like (TLR) 2 agonista, con una fuerte actividad inmuno-modulación responsable de impulsar la diferenciación de los linfocitos T hacia el fenotipo Th1, tanto in vitro como in vivo 9-10. En virtud de esta actividad, HP-PAN es capaz de redirigir la respuesta inmune Th2 en la respuesta más beneficiosa Th1 en un modelo murino de asma alérgica 11. Para evaluar el potencial antitumoral Th1 dependiente de HP-PAN, nos aprovechamos de un modelo de ratón de cáncer de vejiga desarrollado hace varios años por O&#39;Donnel y sus colegas 12 para evaluar el impacto de la administración de BCG. Con este protocolo, nos demuestran que HP-PAN tiene un fuerte potencial antitumoral contra el cáncer de vejiga y que la eficacia de la administración de HP-PAN es paralela a la acumulación significativa, dentro del tumor y los ganglios linfáticos regionales, tanto de Th1 y Tc1 linfocitos que producen interferón ( IFN) -γ 13 </sup&gt;. Los tumores aislados a partir de ratones tratados con HP-NAP mostraron necrosis más y menos vascularización que la contraparte no tratada. El presente informe proporciona un protocolo stepbystep, que detalla la preparación de los animales, su cateterismo uretral, la quema químico requerido para la unión de las células a la mucosa de la vejiga, y la inyección de las células tumorales. También describimos la administración tópica de HP-NAP que se puede considerar como un prototipo de cualesquiera agentes terapéuticos desarrollados para el tratamiento de cáncer de vejiga. La evidencia obtenida mediante la comparación de los tumores aislados de control y HP-PAN-animales tratados enfatiza no sólo el hecho de que HP-PAN podría ser un buen candidato para la inmunoterapia del cáncer de vejiga, sino también la eficacia general del montaje experimental.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materiales</td></tr><tr><td>Ratones hembra C57BL/6J</td><td>Harlan Italy (Udine, Italia)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células</td><td></td><td></td> MB49 <td>obtenidas del Prof. O'Donnel, Facultad de Medicina Carver de la Universidad de Iowa, Iowa, EE. UU</td></tr><tr>.<td>RPMI</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, EE. UU.)</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td>10X, para diluir en agua apirógena</td></tr><tr><td>Matraz</td><td>Becton Dickinson (Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE. UU.)</td> <td>353135</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa 1 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>301358</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Life Technologies (Waltham, Massachusetts, EE. UU.)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Life Technologies</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>Xilor</td><td>Bio 98 s.r.l. (Milán, Italia)</td><td></td><td>2% Xilacina</td></tr><tr><td>Zoletil</td><td>Virbac (Carros, Francia)</td><td>359713301992</td><td>5% Zolazepam + 5% Tiletamina</td></tr><tr><td>Catéter 24G</td><td>Terumo (Roma, Italia)</td><td>SR+DM2419PX</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Reactivos Carlo Erba (Milán, Italia)</td><td>403871</td><td>NaOH líquido</td></tr><tr><td></td><td>JT Baker (Center Valley, Pensilvania, EE. UU.)</td> <td>10095011</td><td>Polvo</td></tr><tr><td colspan="4">Equipo</td></tr><tr><td>Bisturí quirúrgico</td><td>Albion Surgical Limited (Sheffield, Inglaterra)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>Leica Microsystem ( Wetzlar, Alemania)</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>VWR International (Radnor, Pensilvania, EE. UU.)</td><td>631-0108</td><td></td></tr><tr><td>Analizador de imágenes</td><td>Zeiss (Jena, Alemania)</td><td>Sistema</td><td></td> Cyres</tr></tbody></table>

evaluación de la eficacia de la<em&gt; h. pylori</em&gt; proteína hp-pan como herramienta terapéutica para el tratamiento de cáncer de vejiga en un modelo murino ortotópico

Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

El cáncer de vejiga es una de las neoplasias malignas más comunes del tracto urogenital. La inyección intravesical de bacilo de Calmette-Guérin (BCG) es el tratamiento de referencia para el cáncer de vejiga no músculo invasivo de alto grado (NMIBC). Sin embargo, dado que los efectos secundarios relacionados con el tratamiento son relevantes, se necesitan nuevos modificadores de la respuesta biológica con una mejor relación beneficio/efectos secundarios.
El microambiente tumoral puede influir tanto en el desarrollo del tumor como en la eficacia de la terapia. Para obtener un buen modelo, es conveniente implantar células tumorales en el órgano del que se origina el cáncer.
En este protocolo, describimos un método para establecer un tumor en la cavidad vesical de ratones hembra y la posterior administración de agentes terapéuticos; estos últimos se ejemplifican con nuestro uso de la proteína activadora de neutrófilos Helicobacter pylori (HP-NAP). Una quemadura química preliminar de la mucosa, seguida de la inyección de la línea celular de carcinoma urotelial de ratón MB49 mediante cateterismo uretral, permite que las células se adhieran a la mucosa vesical. Después de un período, necesario para permitir una proliferación inicial de las células, los ratones son tratados con HP-NAP, administrado de nuevo mediante cateterismo. La actividad antitumoral de HP-NAP se evalúa comparando el volumen tumoral, la extensión de la necrosis y el grado de vascularización entre los animales tratados con vehículo y HP-NAP.

La Figura 1 muestra la técnica de cateterismo; el ratón se cateterizó y inculca con 0,5 × 10 6 células MB49. El tratamiento con HP-NAP se inicia 3 días después de la inyección de las células tumorales, para que puedan adherirse a la pared de la vejiga y proliferar. Todos los animales pertenecientes al grupo de control se desarrollan el tumor; algunos de ellos pueden morir antes del final del período de 13 días debido a la oclusión de la uretra. Después de la prime...

Aquí se describe el método para establecer un modelo de ratón singénico de tumor ortotópico de vejiga para evaluar la eficacia antitumoral de la proteína bacteriana HP-NAP.

Evaluación de la eficacia de la<em&gt; H. pylori</em&gt; Proteína HP-PAN como herramienta terapéutica para el tratamiento de cáncer de vejiga en un modelo murino ortotópico

Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is the gold ...

El objetivo general de este procedimiento es establecer un tumor en la cavidad de la vejiga de ratones hembra y posteriormente administrar agentes terapéuticos. Esto se logra primero cosechando células tumorales de un cultivo y resuspendiéndolas en PBS. A continuación, los ratones son cateterizados y las células tumorales se inyectan en la cavidad de la vejiga.Tres días después de la implantación del tumor, se inyectan terapéuticos en los ratones y las inyecciones se repiten cada tres días durante un total de 13 días. Finalmente, se extrae la vejiga y se realiza un análisis histológico. En última instancia, se utilizan análisis histológico e inmunohistoquímico para verificar la eficacia de los terapéuticos inyectados.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como los modelos de tumores intraperitoneales o subcutáneos es que el modelo ortotópico imita el entorno natural en el que se produce el tumor. No. Después de criar ratones hembras C57BL/6J hasta las ocho semanas de edad, según el protocolo descrito, cultive las células MB49 en medio RPMI 1640 suplementado con FBS y gentamicina hasta alcanzar una confluencia del 80 %. En matraces T75, tripsinice las célul

evaluation-efficacy-h-pylori-protein-hp-nap-as-therapeutic-tool-for

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Investigación

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Vejiga ratón inyección de pared es un enfoque útil para el estudio de células de vejiga ortotópicamente madre y la biología del cáncer. Este método de microcirugía delicada se puede dominar con una técnica cuidadosa y práctica.

Vejiga ratón pared de inyección

Los tumores de vejiga se establecen en las hembras de una forma mínimamente invasiva a través de cateterismo, la cauterización local, y posterior adhesión de las células cancerosas a los sitios de quema.

Un modelo ortotópico de cáncer de vejiga murino

El establecimiento de un modelo de tumor de vejiga ortotópica para evaluar los efectos antitumorales de SARNA intravesical entrega y el control del crecimiento tumoral mediante ecografía y bioluminiscente.

Un modelo de tumor vesical ortotópica y la Evaluación de tratamiento intravesical SARNA

En este video, describimos el procedimiento intravesical de administrar células cancerosas en la vejiga de un modelo de ratón. Este procedimiento ayuda a generar un modelo ortotópico de tumor vesical que se puede utilizar para desarrollar estrategias terapéuticas.

Modelado de tumor ortotópico de vejiga en modelo de ratón: un procedimiento para la administración intravesical de células cancerosas en la vejiga murina

Este video muestra una técnica para evaluar la actividad antitumoral de la proteína activadora de neutrófilos Helicobacter pylori, o HP-NAP, en un modelo de cáncer de vejiga de ratón. HP-NAP interactúa con los neutrófilos de las células tumorales para producir citocinas proinflamatorias, induciendo la diferenciación de las células T vírgenes en fenotipos de células T auxiliares de tipo 1 (Th1) y citotóxicas de tipo 1 (Tc1). Las células Th1 y Tc1 secretan interferón gamma, inhibiendo la...

Evaluación de la eficacia antitumoral de una proteína inmunomoduladora bacteriana en un modelo murino

Implantación de células de cáncer en el órgano de origen puede servir como un modelo preclínico útil para evaluar nuevas terapias. Células de carcinoma de vejiga MB49 se pueden cultivar dentro de la vejiga después de la instilación intravesical. Este protocolo demuestra la cateterización de la vejiga de ratón para el propósito de la implantación del tumor y la entrega adenoviral.

Un modelo ortotópico de cáncer de vejiga de Estudios de liberación de genes

Una N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina inducida modelo de cáncer de vejiga fue desarrollado en mucina humana 1 (MUC1) ratones transgénicos para el propósito de las pruebas de MUC1-inmunoterapia dirigida. Después de la administración de una vacuna de péptido MUC1-específica, una respuesta de linfocitos T citotóxicos para MUC1 se confirmó mediante la medición de los niveles séricos de citocinas y la actividad de células T específicas.

La inducción de la transición de vejiga invasivo Carcinoma en inmune intacto humanos MUC1 Ratones Transgénicos: Un Modelo para el Desarrollo Inmunoterapia

Un método de alto rendimiento para la purificación negativa de un solo paso de Helicobacter pylori recombinante proteína activadora de neutrófilos (HP-PAN) sobreexpresado en Escherichia coli mediante el uso de resinas de dietilaminoetilo en modo batch se describe. HP-PAN purificado por este método es beneficioso para el desarrollo de vacunas, medicamentos o diagnósticos para H. pylori -asociado enfermedades.

De un solo paso negativo Purificación cromatográfica de<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; La proteína activadora de neutrófilos sobreexpresa en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En modo batch

Este protocolo describe la generación de tumores de vejiga ortotópico murino en ratones C57BL / 6J hembra y el seguimiento del crecimiento del tumor.

Un Modelo de tumor y el tumor murino ortotópico de vejiga Sistema de Detección

Se demuestra un modelo de ratón de inoculación transuretral uropatógena de E. coli (UPEC) para establecer reservorios latentes de vejiga intracelular y posterior exposición vesical a G. vaginalis para inducir itunica urinaria RECURRENTE de UPEC. También se ha demostrado la enumeración de bacterias, la citología de orina y la fijación y procesamiento de la vejiga in situ para la microscopía electrónica de barrido.

Infección recurrente del tracto urinario por Escherichia coli desencadenada por la exposición de la vejiga de Gardnerella vaginalis en ratones

Aprende a establecer un modelo ortotópico de cáncer de vejiga en ratones para evaluar la eficacia terapéutica de la proteína HP-NAP. Este método permite analizar histológicamente la respuesta antitumoral.

Evaluación de la eficacia de la H. pylori Proteína HP-PAN como herramienta terapéutica para el tratamiento de cáncer de vejiga en un modelo murino ortotópico (Video) | JoVE Journal

Evaluación de la eficacia de la

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