Name: En vivo de imágenes y Seguimiento de tecnecio-99m Etiquetada células madre mesenquimales de médula ósea en Equinos tendinopatía (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Aprende a rastrear células madre mesenquimales de médula ósea en equinos con tendinopatía mediante gammagrafía. Este protocolo no invasivo permite evaluar la supervivencia celular y su distribución tisular en el tiempo.

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Los autores desean agradecer la financiación de la Junta de Impuestos sobre Carreras de Caballos del Reino Unido (subvención número 721) y VetCell BioScience Ltd, Reino Unido y de la Consejería de Innovación, Ciencia y Empresa, Junta de Andalucía, España.

Los casos descritos en este documento se realizaron siguiente permiso ético otorgado por el Comité de Ética Animal y el Bienestar del Colegio de Veterinarios de Málaga, España, y el Royal Veterinary College, North Mymms, Reino Unido Los procedimientos utilizados en los caballos se basan en los protocolos aprobados que son utilizado en la clínica en caballos que reciben terapias basadas en células madre, que incluye la sedación, la aspiración de médula ósea, la inyección intra-tendinosa, perfusión regional, la inyección intravenosa, la gestión y el tratamiento del dolor post-procedimiento y el seguimiento después de la implantación. 1. Disposiciones clave para hacerse con anticipación <ol><li> Busque ética institucional y la aprobación del bienestar animal y cumplir con los requisitos legales locales antes de comenzar el trabajo. </li><li> Buscar la aprobación institucional para trabajar con radiaciones ionizantes según lo dictado por las regulaciones locales y legales, incluyendo el nivel adecuado de protección del personal y el medio ambiente y la eliminación de contamresiduos inated. </li><li> Utilice los siguientes criterios de inclusión: caballos presentan con una lesión sobreesfuerzo no traumática (tendinopatía o desmopatía) al tendón digitales flexor superficial de la extremidad anterior y las lesiones resultantes de un defecto en el tendón y el defecto está rodeado de tendón y / o paratenon intacta . Nota: El examen y el diagnóstico de este tipo de lesiones y la preparación clínica de los caballos para la implantación de células se ha detallado en otra parte 6,15. Nota: El aislamiento y expansión en cultivo de BMMSC derivado de la médula ósea de los caballos se ha detallado previamente 6,16. El protocolo actual para inyectar BMMSC por lesiones TFDS en el caballo utiliza 10 millones de células por ml 4 de sobrenadante de médula ósea autólogo (BMS) 16. </li><li> Utilice células que han sufrido no más de 4 pasajes para la implantación in vivo para evitar la posible fenotipo celular o alteraciones genéticas asociadas con el número de alto pasaje cells. </li><li> Entregar el número requerido de células en el BMS (a menos de 24 hr en una caja de enfriamiento a las 4 - 8 ° C) a la clínica veterinaria, donde la implantación de células se va a realizar. Nota: El uso clínico de células madre mesenquimales en el sobrenadante de médula ósea es un procedimiento patentado propiedad de ReCellerate Inc (EE.UU.) y su uso puede requerir la autorización. Nota: Tc-99m es un emisor gamma (140 keV) con una vida media relativamente corta (6,0058 hr, por lo tanto, casi el 94% de los que se descompone a su forma estable de 99 Tc en 24 hr). La energía gamma hace que sea adecuado para la detección mediante cámaras gamma (gammagrafía) y los cortos resultados de vida media en el tiempo de exposición de radiación muy limitado tanto para el caballo y el personal de manejo de animales. Este protocolo describe el etiquetado in situ de células utilizando Tc-99m-HMPAO [HMPAO marcado con Tc-99m (como pertecnetato de sodio)]. </li><li> Pide el Tc-99m fresca del proveedor de tal manera que se entrega y se utiliza para etiquetar el ingenio de las célulashin 2 hr de elución del generador de Tc-99m. Asegúrese de que el Tc-99m se suministra como 1 GBq en (tampón estándar del proveedor) a 1 ml de solución. </li><li> Utilice todos los tampones a RT. Realice el procedimiento de etiquetado, la implantación de las células y de imagen (gammagrafía) en un ambiente de contención de isótopos con todo el equipo se limpia con toallitas con alcohol antes del inicio de los trabajos. </li></ol> 2. Preparación del Caballo y La ecografía de la extremidad anterior del tendón <ol><li> Ecografías Registro de primer ingreso por lesiones (cuando es aspirado de médula ósea) y luego en el punto de tiempo en que se inyectan células radiomarcados. </li><li> Realizar la ecografía y la implantación de las células con el caballo la carga de peso de manera uniforme en un puesto de pie y bajo sedación (en vez de la anestesia general). Administrar la sedación usando una mezcla de detomidina HCl y tartrato de butorfanol, cada uno a 0,01 a 0.02 mg / kg IV. Nota: La recuperación es rápida y post-quirúrgica de tratamiento no requiereConsideraciones Especiales. </li><li> Después de la anestesia perineural se aplica (paso 2.6) en el miembro afectado, mantener el caballo en la estación bajo sedación para reducir el movimiento del caballo durante el tratamiento. Compruebe visualmente el nivel adecuado de sedación juzgar por la posición de la cabeza baja y la actitud del caballo y que el caballo es cómodo durante la inyección de células y los movimientos de la cámara gamma durante la adquisición de imágenes gammagráficas. Nota: No es necesario aplicar ungüento veterinario en los ojos (para prevenir la sequedad) porque bajo sedación parpadeo no se ve afectada y el caballo es capaz de mantener la hidratación de los ojos. El seguimiento después de la implantación de las células no es invasivo (ecografía y gammagrafía gamma). </li><li> Clip de cerca el pelo que recubre el tendón (con cortar el pelo de caballo) y luego limpie el área recortada utilizando una combinación de un lavado quirúrgico clorhexidina y finalmente alcohol. </li><li> Aplicar gel de acoplamiento acústico al área yanalizar metódicamente para grabar las exploraciones de la región metacarpiana palmar completa, niveles secuencialmente marcadas 1 - 7 de 17, con un transductor lineal (12 MHz o similar) para obtener serie transversal en la incidencia y las imágenes longitudinales. Almacenar las imágenes digitalmente de modo que el área de sección transversal y la zona de lesión máxima 4 se pueden obtener con la ayuda de software de análisis de imagen. </li><li> Prepare el área que recubre los nervios palmares inmediatamente distal al carpo para inyección aséptica de anestésico local para garantizar la desensibilización completa de la piel que recubre el tendón y el tendón flexor digital superficial. Inyectar 2 ml de mepivicaine tanto por vía subcutánea y adyacente a los nervios palmares (en su localización sub-fascial) entre los tendones flexores y el ligamento suspensorio inmediatamente distal al carpo en ambos lados de la extremidad. </li><li> Una vez que la exploración preliminar se ha realizado preparar el sitio de implantación por la depuración del área con una clorhexidina s quirúrgicoscrub solución durante al menos 5 min y finalmente alcohol con una gasa empapada. Realice todos los pasos posteriores de una manera aséptica. </li></ol> 3. Tc-99m-etiquetado de las células madre mesenquimales Equina Nota: Los pasos de etiquetado de células se pueden realizar durante la ecografía de la extremidad anterior, ya que la decadencia de isótopos minimizará entre el etiquetado celular y la implantación de células marcadas en el tendón. <ol><li> Retire el BMS de las células ya que interfiere con la absorción de isótopo. Para ello, recuperar el vial de BMMSC (10 millones de células en 1 ml de BMS) de la caja de enfriamiento y sedimentar las células en una microcentrífuga a 350 xg durante 5 min a TA. Retire cuidadosamente el sobrenadante con una 18G o 19G aguja (unida a una jeringa 2 ml), dejando una pequeña gota (≤ 0,1 ml) en el tubo para ayudar a la resuspensión celular. Guardar el sobrenadante (BMS) en un tubo de microcentrífuga estéril y mantener en hielo para su reutilización posterior. </li><li> Resuspender las células en la gotita residual del sobrenadante por flIcking el tubo suavemente con los dedos (en lugar de vórtice) y dejar el tubo en una gradilla a TA. Asegúrese de que las células se volvieron a suspender por completo y que no existen grupos de células visibles. </li><li> Preparar el Tc-99m de la siguiente manera. Transferir 1 ml de pertecnetato de tecnecio en un vial de HMPAO usando una jeringa de 1 ml y una aguja. Mezclar suavemente pero a fondo y dejar actuar durante 5 minutos detrás de blindaje de plomo. Nota: Este paso se puede realizar mientras que las células están girando en el paso 2.1. </li><li> Añadir toda la mezcla de Tc-99m-HMPAO usando una jeringa de 1 ml y una aguja a las células y mezclar suavemente. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente detrás de blindaje de plomo. </li><li> Para los pasos siguientes, utilizar un fórceps (o un trozo de papel de seda) para abrir la tapa del tubo de microcentrífuga para minimizar la contaminación del isótopo (enguantada) pulgar y posteriormente otros equipos. Utilice una jeringa de 2 ml y 21 G aguja para añadir o eliminar tampón de lavado. Nota: Se recomienda el uso de un monitor de campo de isótopos para vigilar la contaminación de superficies y equipos. </li&gt; <li> Añadir 1 ml de PBS a la mezcla de células HMPAO Tc 99m, cerrar la tapa, mezclar suavemente y girar para sedimentar las células como en el paso 3.1. </li><li> Retire con cuidado la PBS a un nuevo tubo (guardar esta detrás de blindaje de plomo y la etiqueta como W1). Resuspender el sedimento celular en 1 ml de PBS fresco. Centrifugar el tubo y eliminar el sobrenadante que el anterior (salvo esto y etiqueta como W2). </li><li> Calcular la eficiencia del etiquetado mediante la medición de los recuentos en tubos de W1 y W2 y en el sedimento celular. Haga esto colocando cada tubos en una dosis de isótopos instrumento calibrador del pozo y de la grabación de la radiactividad como cuentas por minuto (CPM). Calcular la eficiencia de etiquetado (radiactividad como CPM de las células) / (La radiactividad de las células + sobrenadante) x 100. </li><li> Resuspender las células a fondo en el PBS residual y luego añadir el BMS salvó de paso 3.1. Las células están listas para la implantación intralesional. </li></ol> 4. implantación de células-99m-HMPAO marcados con Tc <ol><li> Implantación intralesionalen el tendón bajo guía ecográfica <ol><li> Introducir lentamente una pulgada 1,5 o 2 (50 mm) 20 G aguja en la zona de máxima lesión de la lesión en una orientación longitudinal con el transductor de ultrasonidos, cubierto en un campo estéril, en línea con la aguja de modo que la longitud de la aguja puede ser identificado por ecografía y la punta si la aguja está situado con precisión en el centro de la lesión. </li><li> El uso de protección adecuada, recoger las células en un 2 ml jeringa (Luer-lock, para minimizar el riesgo de contaminación externa y en una cubierta de la jeringa plomo blindado) utilizando una aguja de calibre 20. Deseche la aguja con cuidado de no perder el fluido. Ahora coloque la jeringa con las células marcadas en la aguja pre-ubicado en el tendón. </li><li> Coloque la sonda de ultrasonido debajo de la aguja de modo que el trayecto de la aguja en el tejido es claramente visible. Inyectar las células a un ritmo lento pero constante en la lesión. Asegúrese de que no hay resistencia a la inyección. Si esto se encontróreposicionar cuidadosamente la aguja bajo control ecográfico. Compruebe que la expulsión de fluido en la lesión es visible en la imagen de la ecografía como fluido anecoica que contiene burbujas de aire hiperecogénicas. </li><li> Retire la aguja y colocar inmediatamente presión sobre el orificio de la aguja para evitar la pérdida de las células inyectadas y para minimizar la propagación de isótopo sobre la superficie externa de la extremidad. Vestir Inmediatamente la extremidad con una capa de vendaje autoadhesivo. El caballo está ahora listo para gammagrafía. Realizar esto inmediatamente. Nota: Después de la inyección de las células en el tendón, adquirir un recuento de la jeringa vacía y la aguja para evaluar la posible pérdida directa de las células que pueden permanecer en la jeringa. </li></ol></li><li> Perfusión regional de las células-99m-HMPAO marcados con Tc <ol><li> Siga el paso 2.4. </li><li> Aplique una 100 mm vendaje torniquete de goma en el metacarpo proximal con de dos 100 mm rollo de algodón vendaje de gasa colocada medial y lateral. </li><li> Asépticamente preparar ªe la piel sobre la vena digitales palmares lateral a nivel del hueso sesamoideo proximal lateral por la depuración del área con una solución de lavado quirúrgico de clorhexidina durante al menos 5 min y finalmente con una gasa empapada en alcohol. Realice todos los pasos posteriores de una manera aséptica. </li><li> Preparar una extensión de 100 mm engastado con un 21 G x ¾ &quot;(0,8 x 19 mm) aguja de mariposa para la venopunción rellenando con solución salina estéril heparinizada y luego introducir la aguja en la vena digitales palmar lateral. Sangre Una vez introducida la vena se llene parcialmente el juego de extensión. En el conector de cierre Luer adjuntar una tapa de caucho de bloqueo Luer para facilitar la posterior inyección de células marcadas. </li><li> Diluir las MSCs en 19 ml de PBS mediante la recopilación de las células en una jeringa de 20 ml precargada con el PBS. Aplicar las células a través de la copa de goma utilizando un 18 G (1,2 x 40 mm) aguja hipodérmica a una velocidad lenta pero constante (30 - 40 seg). Lave el catéter con 1 ml de PBS precargados en un syringmi. </li><li> Retire la aguja e inmediatamente aplique presión en la piel sobre el agujero de la aguja con una capa de cinco 4 x 4 gasas de algodón. A continuación, coloque un vendaje ligero con adhesivo elástico sobre el área sesamoideo proximal y dejar el torniquete en el lugar durante 30 minutos después de la inyección. </li><li> Suelte el torniquete después de 30 minutos. El caballo está ahora listo para gammagrafía. Nota: Después de la inyección de las células, adquirir un recuento de la jeringa vacía y la aguja para evaluar la posible pérdida directa de las células que pueden permanecer en la jeringa. </li></ol></li></ol> 5. gammagrafía Gamma <ol><li> Imágenes gammagrafía <ol><li> Adquirir imágenes gammagrafía planar con una cámara gamma (fijado en 140 KeV pico fotoeléctrico utilizando una ventana simétrica 20%), equipado con una energía baja, colimador agujero paralelo. <ol><li> Obtener todas las imágenes después de la hora 0 en caballos sedados como en el paso 2.2 de pie. Después del tiempo de 0 gammagrafía, reemplace el vendaje luz sobre la si la implantaciónde TE con un vendaje acolchado. Eliminar este vendaje antes de cada examen de gammagrafía. </li><li> Adquirir imágenes estáticas durante 60 segundos cada uno (256 por 256 de la matriz), utilizando el software de procesamiento con el &quot;adquirir&quot; - &quot;la selección de estudios&quot; - opciones &quot;hueso estáticos&quot;. Es esencial que el caballo no se mueve durante el período de adquisición de la imagen porque la opción de modo estático no tiene un módulo para la corrección de movimiento. </li><li> Para la inyección intralesional, obtener imágenes laterales de la zona de la lesión del carpo de la extremidad distal, el área equivalente de la extremidad contralateral, el campo y el pulmón izquierdo tiroideo izquierdo. Durante la adquisición de imágenes extremidades anteriores, posicionar una pantalla de plomo entre las piernas para evitar la formación de imágenes del contralateral extremidad. Adquirir las imágenes en 5 min después de la inyección (tiempo 0), y después a 1, 3, 6, 12, 24, 36 y 48 hr. </li><li> Para la perfusión regional, obtener imágenes gamma laterales y dorsales que para 5.1.1.3. Obtener imágenes 5 min afliberación del torniquete ter. Este será el tiempo 0. Puede ser útil a la imagen de la extremidad inmediatamente después de la inyección de las células para evaluar los recuentos antes de la liberación del torniquete. Obtener imágenes gamma a 1, 3, 6, 12, 24, 36 y 48 h después de la administración de las células. </li></ol></li><li> Después de que las imágenes han sido adquiridos, procesar las imágenes de forma manual utilizando la opción de &quot;procesamiento&quot; del software con las opciones seleccionadas por el color &quot;Sokoloff&quot; y el color &quot;Invertir&quot;. A continuación, seleccione la &quot;región de interés&quot; (ROI) y &quot;elipse&quot; ya que esto permite la remodelación de la máscara de la selección y el movimiento sobre el área de la lesión. Obtener los recuentos sobre el retorno de la inversión por la elección de la opción &quot;añadir a las estadísticas&quot;. Asegurar que las regiones de tamaño idéntico de interés (ROI) se registran para cada animal en los diferentes puntos de tiempo. </li><li> A continuación, corregir los recuentos de la decadencia predicha del tecnecio en cada punto de tiempo. Utilice la siguiente ecuación para corregir la decadencia:A = A o E - (0.693t / T 1/2), donde A es o la actividad inicial del isótopo, A es la decadencia corrigió la radiactividad en el tiempo cero, t es el tiempo transcurrido y T es la media media -La vida del isótopo. Entonces expresar las cuentas corregidas en cada punto de tiempo como un porcentaje de la ROI en el tiempo 0 para calcular el porcentaje de células restantes, usando la siguiente fórmula: </li></ol></li></ol> % de células restante (T) = 100 - {[(descomposición predicho (t) - desintegración (t)) / decaimiento predijo (t)]} x 100 decaimiento (t) = ROI (t) / retorno de la inversión (0) x 100.

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JD y RKS son miembros del Consejo Asesor Científico de ReCellerate Inc.

Además de la médula ósea, las células madre aisladas a partir de fuentes tales como el tejido adiposo son adecuados para el etiquetado con este protocolo. Además, las células de un estado congelado pueden ser revividos y se expandieron en cultivo para los números deseados para los estudios de etiquetado 12. Un factor crítico que determina la eficiencia de marcaje del BMMSC es el tiempo entre la elución de la Tc-99m desde el generador de molibdeno en la radiofarmacia, la preparació...

Estrategias regenerativas para la reparación de los tejidos enfermos o dañados se basan en células madre multipotentes derivadas de una variedad de tejidos e implantado en la zona afectada. Los recientes avances en la aplicación de autóloga BMMSC para el tratamiento del tendón y lesiones de ligamentos en el caballo han demostrado la mejora de las medidas de resultado, tanto experimental 1-5 y estudios clínicos 6. El caballo es un modelo especialmente atractivo para la evaluación de la eficacia de las células madre tratamientos relacionados, ya que sufre de edad y sobreesfuerzo lesiones relacionadas a los tendones de la extremidad anterior distal, es un animal atlético, y es una recuperación grande, facilitando la médula ósea y implantación precisa. Lesiones del tendón de sanar de forma natural con la fibrosis, pero el tendón sanado es funcionalmente inferior 7 y tiene un alto riesgo de una nueva lesión 8. El tendón flexor digital superficial (TFDS) se ve afectado con mayor frecuencia, ya que ha evolucionado para actuar como una energía elásticatienda y experiencias de alta carga hincapié para lograr la eficiencia energética y la locomoción de alta velocidad. Restaurar la función después de la lesión tanto, es fundamental. Estas lesiones son similares a los que afectan el tendón de Aquiles en los seres humanos, que realiza una función similar 9. No hay buenas opciones de tratamiento para tratar o lograr buenas condiciones para este tipo de lesiones, por lo tanto, las estrategias de regeneración basada en células ofrecen una atractiva oportunidad para mejorar los resultados y reducir una nueva lesión. En la mayoría de estudios de 5 - 20 millones de BMMSC autólogo se inyectan directamente en la lesión que por lo general se produce dentro del núcleo del cuerpo del tendón que por lo tanto actúa como un receptáculo para las células. El destino de las células una vez inyectadas no es métodos claros y distintos etiquetado celular para rastrear las células se han descrito recientemente. Las células marcadas con una etiqueta de fluorescencia, se mostró a sobrevivir sólo en un número relativamente pequeño (&lt;10%) 10,11. Etiquetas de fluorescencia requierenla extracción de tejidos y seccionamiento para el análisis histológico, que es mucho tiempo y no facilita fácilmente análisis temporal en un modelo animal de gran tamaño o en casos clínicos. En un trabajo más reciente se ha utilizado el 99m Tc radioisótopos para etiquetar células y seguir su destino por gamma gammagrafía 1. Este método permite comparaciones rápidas que se hagan entre las diferentes vías de administración de células, incluyendo intralesional, intravenosa a través de la vena yugular 1 o perfusión regional vía intra-arteriales 12 o intravenosos 1,12 inyecciones. La persistencia y la distribución de células pueden obtenerse imágenes por escintigrafía gamma de varios órganos. Esto ha demostrado que sólo el 24% de las células inyectadas intralesional permaneció en la lesión por 24 hr 1 y esto se apoya en otro estudio usando lesiones experimentalmente creados y utilizando el mismo marcador radiactivo 5. Además, las células muestran una capacidad limitada para el hogar en las lesiones del tendón cuando delivered por perfusión regional o por vía intravenosa, pero se dispersan en los pulmones por los últimos 4 rutas. BMMSC marcado con nanopartículas de hierro es un método alternativo para realizar un seguimiento de las células implantadas en los tendones de las extremidades anteriores 13. Aunque las células marcadas de nanopartículas de hierro permiten el seguimiento de células in vivo por resonancia magnética, los estudios temporales en un animal grande están limitadas por el número de veces que la anestesia se pueden administrar en cada punto de tiempo para la realización de las exploraciones de MRI. Además, las nanopartículas de hierro son hipointensa en la RM que limita la información sobre la migración de células marcadas en el cuerpo del tendón. Otros radioisótopos que se pueden utilizar incluyen indio-111, pero esto tiene la desventaja de una semivida más larga que Tc-99m (2,8 días vs 6,0 hr) y mayor energía de emisión de rayos gamma. Además, la viabilidad celular se ha informado de que se reduce cuando marcado con indio-111 14. Tc-99m, por otro lado, se utiliza rutinariamente en tanto nuclear equina y humanamedicina para marcar las células mononucleares de sangre periférica y sigue su distribución in vivo mediante gammagrafía. Puede ser relativamente fácil captado por las células utilizando HMPAO como una molécula de enlazador para unir el tecnecio, como Tc-99m-HMPAO, a las células. Tc-99m-HMPAO etiquetado BMMSC mostrar buena viabilidad y puede proliferar in vitro 4. Este protocolo se detalla el etiquetado y el seguimiento de BMMSC autólogo equina implantado en las lesiones que ocurren naturalmente en el TFDS extremidad anterior. Es importante tener en cuenta que el protocolo está solamente destinado a ser utilizado como una herramienta de investigación. Su uso como una modalidad terapéutica clínica no se recomienda como el efecto de la radiomarcador en el fenotipo celular no ha sido totalmente dilucidado.

<table><tbody><tr><td>Tecnecio99m&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Consulte con el proveedor local de radiación de ionización de acuerdo con los requisitos legales. El isótopo debe usarse dentro de las 2 horas posteriores a la elución del generador de molibdeno-99</td></tr><tr><td>Ceretec - Oxima de hexametilpropilenamina (HMPAO)&nbsp;</td><td>GE HealthCare</td><td></td><td>Consulte directamente con GE HealthCare</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfuge, Minispin/Minispin Plus</td><td>Ependorf</td><td>22620100</td><td></td></tr><tr><td>agujas de 18 g y 19 g</td><td>Terumo Medical</td><td>NN-1838R (18 G); &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; NN1938R (19 g)</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas de 1 ml y 2 ml</td><td>Scientific Laboratory Supplies Ltd</td><td>SYR6200 (1 ml); SYR6003 (2 ml)</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga 1,5 ml</td><td>Greiner Bio-One Ltd</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>PBS - Solución salina tamponada con fosfato</td><td>LifeTechnologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Hisopos de gasa estéril</td><td>Shermond Ltd</td><td>UNG602</td><td></td></tr><tr><td>CoflexVet vendaje autoadhesivo</td><td>Andover Healthcare, Inc.</td><td>3540RB-018</td><td></td></tr><tr><td>Software de imágenes de ultrasonido</td><td>Scion Image, Scion Corporation, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicasXplus software de procesamiento de scintigramas</td><td>Bartec Technologies Ltd</td><td></td><td>http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html</td></tr><tr><td>Contador de isótopos de campo para el monitoreo de isótopos</td><td>John Caunt Reino Unido</td><td>GMS1800a</td><td>http://www.johncaunt.com/</td></tr> <tr><td>Contador de pocillos para mediciones de isótopos, calibrador de dosis</td><td>Capintec Southern Scientific</td><td>CRC-25R</td><td></td></tr></tbody></table>

en vivo de imágenes y seguimiento de tecnecio-99m etiquetada células madre mesenquimales de médula ósea en equinos tendinopatía

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

Los recientes avances en la aplicación de las células madre mesenquimales de la médula ósea (BMMSC) para el tratamiento de las lesiones del tendón y ligamento en el caballo sugieren mejoraron las medidas de resultado en los dos estudios experimentales y clínicos. Aunque el BMMSC se implantan en la lesión del tendón en grandes cantidades (generalmente 10 - 20 millones de células), sólo un número relativamente pequeño sobrevivir (&lt;10%), aunque estos pueden persistir por hasta 5 meses después de la implantación. Esto parece ser una observación común en otras especies donde BMMSC se han implantado en otros tejidos y es importante para entender cuando se produce esta pérdida, cuántos sobreviven el proceso de implantación inicial y si las células se borran en otros órganos. El seguimiento del destino de las células se puede lograr mediante la radiomarcación de BMMSC antes de la implantación que permite no invasiva de imágenes in vivo de la localización celular y cuantificación del número de células. Este protocolo describe un labeli celularng procedimiento que utiliza tecnecio-99m (Tc-99m), y el seguimiento de estas células después de la implantación en tendones flexores heridos en caballos. Tc-99m es un (t 1/2 de 6,01 hr) de isótopos de corta duración que emite rayos gamma y puede ser internalizada por las células en presencia de la oxima hexametilpropilenamina compuesto lipófilo (HMPAO). Estas propiedades lo hacen ideal para su uso en las clínicas de medicina nuclear para el diagnóstico de muchas enfermedades diferentes. El destino de las células marcadas se puede seguir en el corto plazo (hasta 36 hr) por escintigrafía gamma para cuantificar tanto el número de células retenidas en la lesión y la distribución de las células en los pulmones, tiroides y otros órganos. Esta técnica es una adaptación del etiquetado de los leucocitos de la sangre y podría ser utilizado para BMMSC imagen implantado en otros órganos.

Tc-99m-HMPAO incorporación en BMMSs no afecta negativamente a su capacidad de adherirse al plástico de cultivo de tejidos y mientras ellos demuestran la capacidad de proliferación para formar monocapas (Figura 1) que no tienen plenamente determinado si las tasas de proliferación u otros fenotipos celulares se ven afectados. Su morfología es similar a las células no marcadas con una forma típica de husillo. La eficiencia de marcaje celular (es decir., La absorción de la etiqueta) varía típicamen...

Este protocolo describe el radiomarcaje de células madre mesenquimales equinas y su implantación en lesiones tendinosas en el caballo con el fin de determinar la supervivencia celular y la distribución de tejidos mediante gammagammagrafía.

En vivo de imágenes y Seguimiento de tecnecio-99m Etiquetada células madre mesenquimales de médula ósea en Equinos tendinopatía

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

El objetivo general de este protocolo es seguir de forma no invasiva la distribución y el destino de las células madre mesenquimales de la médula ósea marcadas después de su inyección mediante gammagrafía. El destino de las células madre tras la inyección no se comprende bien. Las principales ventajas de esta técnica son que permite el seguimiento no invasivo de las células madre en múltiples órganos tras su administración, y que la corta semivida del A osteo garantiza su eliminación en 48 horas.Aunque esto ha proporcionado información sobre el uso de células madre en la terapia de tendinopatías de origen natural, también podría utilizarse para la investigación de terapias para enfermedades óseas y cardíacas. En general, los desafíos para quienes son nuevos en este método son la coordinación de las células y el instrumental para la etiquetación y la preparación del paciente. Para la aplicación inmediata de las cél游戏副本Tras la administración del anestésico local, limpie el sitio de implante con una solución antiséptica quirúrgica de clorhexidina durante al menos cinco minutos, seguido de una pasada con gasa empapada en etanol. En primer lugar, póngase un par de guantes cuando el animal haya sido preparado, y peletee una alícuota de células madre mesenquimatosas de médula ósea equivalente a una vez 10 a la séptima en un mililitro del sobrenadante de médula ósea mediante centrifugación. A continuación, aspire el sobrenadante con una jeringa de dos mililitros, equipada con una aguja de calibre 18 o 19, dejando aproximadamente 100 microlitros de solución en el tubo.Transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga sobre hielo y luego use golpecitos suaves para resuspender las células en los 100 microlitros residuales de sobrenadante. Asegúrese de que las células se resuspendan completamente y de que no haya grumos visibles de tejido. A continuación, deje las células a temperatura ambiente.Ahora mezcle un mililitro del Protec nutate marcado con tecnecio en un vial de H-M-P-A-O. Después de cinco minutos, utilice una jeringa y aguja de un mililitro para tratar las células madre mesenquimales con la alícuota completa de TECNECIO 99 M-H-M-P-A-O. A continuación, tape el tubo, mezcle las células con golpes suaves e introduzca el tubo a temperatura ambiente detrás de un blindaje de plomo.Después de 30 minutos, abra el tubo con una pinza y use una jeringa de tubo de un mililitro equipada con una aguja de calibre 21 para agregar un mililitro de PBS a las células. Tape el tubo y mezcle las células. A continuación, centrifugue las células y use la jeringa de dos mililitros para transferir cuidadosamente el sobrenadante a un tubo supuestamente protegido etiquetado como lavado uno.Luego, lave el sedimento con otro mililitro de PBS tal como se acaba de demostrar. Transfiera el segundo lavado al tubo etiquetado como W2 después del segundo lavado. Resuspenda las células completamente en el PBS residual y en la alícuota de sobrenadante de médula ósea frío con hielo, manteniendo el transductor en paralelo con la aguja.Introduzca lentamente una aguja de calibre 20 de 1,5 o dos pulgadas en la zona de mayor lesión, en el centro de la lesión, en orientación longitudinal. A continuación, utilizando el blindaje adecuado, aspire las células hacia una jeringa de dos mililitros con sistema de bloqueo y aguja de calibre 20, deseche la aguja teniendo cuidado de no perder ningún líquido. Después de conectar la jeringa a la aguja previamente colocada en el tendón, coloque el transductor de ultrasonido debajo de la aguja de manera que la trayectoria de la aguja en el tejido sea claramente visible e inyecte las células a un ritmo lento pero constante dentro de la lesión.Confirme que el líquido que se expulsa hacia la lesión sea visible en la imagen de ultrasonido como líquido quístico que contiene microburbujas hiperecogénicas una vez que se hayan administrado todas las células, luego retire la aguja. Utilice las opciones de selección de estudio y estática ósea en el software de procesamiento para adquirir imágenes estáticas durante 60 segundos cada una. A continuación, obtenga imágenes laterales del área de la lesión, desde el carpo hasta la extremidad distal, el área equivalente de la extremidad contralateral, el campo pulmonar izquierdo y la glándula tiroides izquierda en los momentos indicados.Luego, seleccione las herramientas de región de interés y elipse, y remodelar la máscara de selección sobre el área de la lesión según sea apropiado. Finalmente, elija la opción de agregar dos estadísticas para obtener los conteos en la región de interés. Asegurándose de que se registren regiones de interés de tamaño idéntico para cada animal en los diferentes puntos de tiempo.Después de la administración intralesional, las células se observarán como una zona focal de señal con una dispersión limitada de las células hacia el tejido tendinoso circundante a lo largo del tiempo. En contraste, cuando las células se administran mediante perfusión regional a través de la vena palmar digital, se observa una reducción gradual de la señal en el sitio de inyección. Con el tiempo, los campos pulmonares suelen ser negativos tras la inyección intralesional, aunque ocasionalmente puede detectarse una señal muy focal en los puntos temporales iniciales, que con el tiempo se vuelve más generalizada.La tiroides permanece negativa también por esta vía de administración. La perfusión regional también demuestra una señal focal en los pulmones, que con el tiempo se vuelve más difusa, aunque la señal es significativamente más intensa en comparación con la observada mediante la vía intralesional. Con una tiroides que a menudo también presenta una señal focal, el recuento total inicial de radioisótopos de las células en el momento cero previo a la inyección, y los recuentos del primer gammagrama en la región de interés.En tiempos cero posteriores a la inyección, se puede utilizar este valor para calcular el porcentaje de disminución en las cuentas en cada punto de tiempo posterior a la inyección, con el fin de determinar la descomposición predicha del TC 99 M a partir de las cuentas iniciales. Luego también se puede calcular la persistencia de las células que permanecen en el sitio de inyección en cada momento posterior a la inyección. Siguiendo este procedimiento, se pueden aplicar otras vías de menstruación celular para responder preguntas adicionales sobre la capacidad de homing de las células madre mesenquimales tras su desarrollo.Esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores en el campo de la medicina regional exploren métodos destinados a mejorar la retención celular en lesiones tendinosas. Tras ver este video, usted debería tener una buena comprensión de cómo etiquetar células y registrar su distribución y concentración en diferentes sistemas orgánicos. No olvide que trabajar con radiación ionizante puede ser extremadamente peligroso y que son esenciales precauciones como el equipo de protección personal, los monitores de radiación, el blindaje con plomo y la eliminación adecuada de desechos contaminados durante la realización de este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Seguimiento de Dinámica de injerto muscular en pequeños animales por En Vivo Fluorescente de imágenes

Un modelo experimental de ratón de las metástasis óseas se estableció después de la entrega intracardíaca de luciferasa que expresan las células del tumor mamario. El desarrollo de tumores y dio lugar a lesión osteolítica fueron controlados longitudinalmente con bioluminiscencia y micro TC.

Monitoreo metástasis tumorales y lesiones osteolíticas con bioluminiscencia y Micro Imágenes de TC

La medición cuantitativa de la función de progenitores de médula en la curación de la fractura requiere alta resolución tecnología de imágenes en serie. Aquí, se proporcionan protocolos para el uso de microscopía intravital y seguimiento osteo-linaje secuencialmente imagen y cuantificar la migración, proliferación y diferenciación de osteogénicas células madre / progenitoras endógenas en el proceso de reparación de fractura ósea.

Secuencial<em&gt; En vivo</em&gt; Imagen de células madre / progenitoras osteogénicas durante la reparación de la fractura

La naturaleza de las interacciones entre las células madre hematopoyéticas y progenitoras (hspCs) y nichos de la médula ósea es poco conocido. Modificaciones de hardware personalizados y un protocolo de adquisición de múltiples pasos permiten el uso de dos fotones y microscopía confocal a la imagen ex vivo HSPCs etiquetados alojados dentro de las áreas de la médula ósea, las interacciones de seguimiento y el movimiento.

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Los monocitos son reguladores clave de la inmunidad innata y desempeñan un papel crítico en la renovación del sistema fagocítico mononuclear periférico y en caso de inflamación. Este manuscrito describe el procedimiento de obtención de imágenes en tiempo real de la médula ósea calvaria del ratón para estudiar el mecanismo de movilización de monocitos.

Seguimiento de médula ósea de ratón monocitos<em&gt; En Vivo</em

El protocolo describe un novedoso modelo de cámara de ventana de fémur murino que se puede utilizar para rastrear el movimiento de las células en la médula ósea femoral in vivo. La microscopía de fluorescencia multifotónica intravital se utiliza para obtener imágenes de tres componentes de la médula ósea femoral (vasculatura, matriz de colágeno y neutrófilos) a lo largo del tiempo.

Fémur Window Cámara Modelo de<em&gt; En Vivo</em&gt; Seguimiento de la célula de la médula ósea murina

Este protocolo describe un medio eficaz para controlar la persistencia de la célula y la biodistribución de humanas derivados del adiposo células madre mesenquimales (haMSCs) por far-red de la fluorescencia de etiquetado en un modelo de ratas rodilla osteoartritis (KOA) mediante inyección intra-articular (IA).

En Vivo Seguimiento de humanos derivados del adiposo células madre mesenquimales en un modelo de artrosis de rodilla de ratas con tinte fluorescente membrana lipofílica

Aquí utilizamos bioluminiscente, rayos x y emisión de positrones la tomografía/computado tomografía la proyección de imagen para estudiar cómo inhibidor mTOR actividad impactos tumores mieloma engrafted de médula ósea en un modelo de xenoinjerto. Esto permite fisiológicamente relevantes, no invasivo y multimodales análisis del efecto anti-mieloma de tratamientos contra tumores mieloma médula engrafted en vivo.

Proyección de imagen de tomografía multimodal bioluminiscente y emisión positrónica tomografía/computacional de xenoinjertos de médula ósea del mieloma múltiple en ratones NOG

Aquí se presenta un protocolo para la entrega y seguimiento de células madre mesenquimales no invasivas (MSC) en un modelo de ratón de lesión cerebral traumática. Las nanopartículas de óxido de hierro superparamagnético se emplean como una sonda de resonancia magnética (RM) para el etiquetado de MSC y el seguimiento in vivo no invasivo después de la administración intranasal mediante RMN en tiempo real.

Seguimiento de células madre mesenquimales con etiqueta de óxido de hierro superparamagnético mediante RMN después de la entrega intranasal en un modelo de murino de lesión cerebral traumática

Este protocolo describe la detección de la migración de células madre esqueléticas periósticas mediada por CCL5 en tiempo real utilizando microscopía intravital de animales vivos.

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Aprende a rastrear células madre mesenquimales de médula ósea en equinos con tendinopatía mediante gammagrafía. Este protocolo no invasivo permite evaluar la supervivencia celular y su distribución tisular en el tiempo.

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