En vivo de imágenes y Seguimiento de tecnecio-99m Etiquetada células madre mesenquimales de médula ósea en Equinos tendinopatía

El objetivo general de este protocolo es seguir de forma no invasiva la distribución y el destino de las células madre mesenquimales de médula ósea marcadas después de su inyección mediante gammagammagrafía. El destino de las células madre después de la inyección es poco conocido. Las principales ventajas de esta técnica son que permite el seguimiento no invasivo de las células madre a múltiples órganos después de la administración, y que la corta vida media del A osteo asegura su aclaramiento a las 48 horas.

Aunque esto ha proporcionado información sobre el uso de células madre en la terapia de las tendinopatías que ocurren naturalmente, también podría usarse para la investigación de terapias para enfermedades óseas y cardíacas. En general, los desafíos para las personas nuevas en este método son la coordinación de las células y el conjunto para el etiquetado y la configuración del paciente. Para la aplicación inmediata de las celdas, comience por aplicar gel de acoplamiento acústico a la extremidad recortada y utilice un transductor lineal para escanear metódicamente la región metacarpiana completa de Palmer para obtener una serie de incidentes transversales en imágenes longitudinales para identificar la zona de lesión máxima.

Después de la administración de anestésico local, frote el sitio de implantación con una solución quirúrgica de clorhexidina durante al menos cinco minutos, seguido de una toallita con una gasa empapada en etanol. Primer amanecer, un par de guantes cuando el animal ha sido preparado, pellet a uno por 10 de la séptima alícuota celular de células madre mesenquimales de médula ósea en un mililitro de médula ósea sobrenadante por centrifugación. A continuación, aspire el sobrenadante con una jeringa de dos mililitros, equipada con una aguja de calibre 18 o 19, dejando aproximadamente 100 microlitros de solución en el tubo.

Transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga en hielo y luego use un movimiento suave para resuspender las células en los 100 microlitros residuales de sobrenadante. Cuidando que las células estén completamente resuspendidas y que no haya grumos de tejido visibles. A continuación, ajuste las celdas a temperatura ambiente.

Ahora mezcle un mililitro de nutato de tecnecio Protec en un vial de H-M-P-A-O. Después de cinco minutos, use una jeringa de un mililitro y una aguja para tratar las células madre mesenquimales con toda la alícuota del TECHNETIUM 99 M-H-M-P-A-O. A continuación, tape el tubo, mezcle las células con un suave movimiento y coloque el tubo a temperatura ambiente detrás de un protector de plomo.

Después de 30 minutos, abra el tubo con una pinza y use una jeringa de tubo de mililitros equipada con una aguja de calibre 21 para agregar un mililitro de PBS a las células. Vuelva a tapar el tubo y mezcle las celdas. A continuación, centrifuga las células y usa la jeringa de dos mililitros para transferir cuidadosamente el sobrenadante a un supuesto tubo blindado etiquetado como wash one.

A continuación, lave el pellet en otro mililitro de PBS como se acaba de demostrar. Transferir el segundo lavado al supuesto tubo blindado etiquetado como W2 después del segundo lavado. Resus suspende completamente las células en el PBS residual y en la alícuota del sobrenadante de médula ósea helada, sosteniendo el transductor en paralelo con la aguja.

Introduzca lentamente una aguja de calibre 20 de 1.5 o 2 pulgadas en la zona de lesión máxima en el centro de la lesión en una orientación longitudinal. A continuación, utilizando el blindaje adecuado, aspire las células en un señuelo de dos mililitros, bloquee la jeringa equipada con una aguja de calibre 20 y deseche la aguja, teniendo cuidado de no perder ningún líquido. Después de conectar la jeringa a la aguja previamente colocada en el tendón, coloque la sonda de ultrasonido debajo de la aguja de modo que la aguja rastreada en el tejido sea claramente visible e inyecte las células a un ritmo lento pero constante en la lesión.

Confirme que el líquido que se expulsa en la lesión es visible en la imagen de ultrasonido como líquido koico que contiene burbujas de aire hiperecogénicas cuando se han administrado todas las células, retire la aguja. Utilice las opciones de adquisición de selección de estudio y estática ósea del software de procesamiento para adquirir imágenes estáticas durante 60 segundos cada una. A continuación, obtener imágenes laterales de la zona de la lesión, desde el carpo hasta la extremidad distal, el área equivalente de la extremidad contralateral, el campo pulmonar izquierdo y la tiroides izquierda en los tiempos indicados.

A continuación, seleccione las herramientas de región de interés y elipse y cambie la forma de la máscara de selección sobre el área de la lesión, según corresponda. Por último, elija la opción agregar dos estadísticas para obtener los recuentos de la región de interés. Teniendo en cuenta que se registran regiones de interés de tamaño idéntico para cada animal en los diferentes puntos de tiempo.

Después de la administración intralesional, las células se observarán como un área focal de señal con una dispersión limitada de las células en el tejido tendinoso circundante a lo largo del tiempo. Por el contrario, cuando las células se administran por perfusión regional a través de la vena de Palmer digital, se observa una reducción gradual de la señal en el lugar de la inyección. Con el tiempo, los campos pulmonares suelen ser negativos después de la inyección intralesional, pero ocasionalmente se puede detectar una señal muy focal que se generaliza con el tiempo en puntos temporales tempranos.

La tiroides también permanece negativa por esta administración. La perfusión regional también muestra una señal focal en los pulmones, que se vuelve más difusa con el tiempo, aunque la señal es significativamente más intensa en comparación con la observada con la raíz intralesional. Con una tiroides que a menudo también exhibe una señal focal, el recuento inicial total de radioisótopos de las células a veces cero antes de la inyección, y los recuentos del gramo gamma inicial en la región de interés.

A veces, el cero posterior a la inyección se puede utilizar para calcular la disminución porcentual en los recuentos en cada punto de tiempo después de la inyección para determinar el decaimiento previsto del TC 99 M a partir de los recuentos iniciales. También se puede calcular la persistencia de las células que permanecen en el lugar de la inyección en cada momento después de la inyección. Siguiendo este procedimiento, se pueden aplicar otras rutas de menstruación celular para responder preguntas adicionales sobre la capacidad de localización de las células madre mesenquimales después de su desarrollo.

Esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores en el campo de la medicina regional exploren métodos para mejorar la retención celular dentro de las lesiones tensas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo etiquetar las células y registrar su distribución y concentración en diferentes sistemas de órganos. No olvide que trabajar con radiación ionizante puede ser extremadamente peligroso y las precauciones como el equipo de protección personal, los monitores de radiación y el blindaje de plomo y la eliminación adecuada de los desechos contaminados son esenciales al realizar este procedimiento.