Name: Aislamiento de macrófagos peritoneales murinos para llevar a cabo análisis de expresión génica Al Toll-like Receptores Estimulación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Aprende a aislar macrófagos peritoneales murinos para análisis de expresión génica tras estimulación de receptores Toll-like. Este protocolo optimiza el rendimiento celular mediante migración de monocitos.

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Este trabajo fue apoyado por una beca de Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC, conceder ninguna 298.515-2011). AL es el destinatario de un Ph.D. beca de Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC) y MS fue apoyado por una subvención de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR, subvención no. MOP123246).

Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales directrices después de la aprobación por el Comité institucional Cuidado de Animales del Centre de recherche du Centre Hospitalier de la Universidad de Montreal (CRCHUM). 1. El aislamiento, identificación, y Cultura de Murino macrófagos peritoneales <ol><li> Preparar medio tioglicolato 3,8% de cerveza. Para ello, suspender 38 g de tioglicolato medio en 1000 ml de agua destilada. Llevar a hervir solución para disolver completamente el medio. Esterilizar en autoclave a 121 ° C durante 15 minutos. Almacene hasta 3 meses en la oscuridad, a temperatura ambiente 18. NOTA: Desechar si la turbidez se desarrolla lo que indica una contaminación bacteriana. La solución puede conservarse durante un máximo de un año en la oscuridad si se mantiene estéril. </li><li> Uso de 1 ml jeringas unidas a agujas 23 G, inyectar 1 ml de 3,8% de tioglicolato de Brewer medio en la cavidad peritoneal de cada mouse y esperar durante 3 días. Use nueva jeringa y la aguja para cada ratón. </li><li> Anestesiar los ratones por inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (100 mg / kg) y la eutanasia a los ratones por dislocación cervical. Confirmar anestesia adecuada marcando la frecuencia respiratoria. Por lo general, las respiraciones rápidas indican que el ratón no está profundamente anestesiado. </li><li> Lavar el abdomen de cada ratón con etanol al 70%. Usando una tijera, realizar una incisión lateral a lo largo de la línea media inferior de la peritoneo. </li><li> Usando unas pinzas, tire hacia atrás la piel del abdomen para exponer la piel peritoneal transparente. Uso de 5 ml jeringas unidas a agujas 20 G, inyectar 5 ml de DPBS frío en la cavidad peritoneal de cada ratón. </li><li> Realizar un masaje suave en la cavidad peritoneal y luego aspirar el líquido cuidadosamente sin perforar cualquier órgano. Retire la aguja y dispensar el líquido peritoneal en 50 ml tubos de centrífuga cónicos. </li><li> Centrifugar durante 10 min a 400 xg en una centrífuga refrigerada.Las células deben mantenerse frío durante todo el procedimiento. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células en medio RPMI 1640. </li><li> Utilizando un hemocitómetro, contar las células y adaptarse a la densidad de células a 1 x 10 6 células / ml. </li><li> Caracterizar el fenotipo de células aisladas por citometría de flujo utilizando 1 x 10 6 células por ratón y antibodie contra F4 / 80 (un antígeno de superficie expresada en macrófagos). </li></ol> 2. Tratamientos Celulares <ol><li> Directamente, después del aislamiento, agregue 1 x 10 6 células en cada pocillo. Deje los macrófagos peritoneales murinos para adherirse a las placas de 6 pocillos cultivándolas durante 1 a 2 horas a 37 ° C. Retire las células no adherentes lavando suavemente 3 veces con PBS caliente. </li><li> Posteriormente, las células de cultivo de 900 l DMEM libre de suero durante 24 horas en la presencia de los siguientes ligandos TLR: (Pam3CSK4-TLR1 / 2 (0,5 mg / ml); Poly (I: C) -TLR3 (10 mg / ml) ; LPS-TLR4 (100 ng / ml); flagelina-TLR5 (100 ng / ml); FSL1-TLR6 / 2 (100 ng / ml); ssRNA40-TLR7 (1 mg / ml); ODN1826-TLR9 (1 M). NOTA: Prepararse para cada ligando una solución 10x. Añadir 100 l de este último a cada pocillo, realizando así una dilución de 10 veces. </li></ol> 3. Aislamiento de ARN <ol><li> Eliminar todas las células medianas y lisan directamente en las placas de seis pocillos mediante la adición de 1 ml de TRIzol a cada pocillo y el lisado celular que pasa varias veces a través de una pipeta. Incubar las muestras homogeneizadas durante 5 a 10 min a TA, para permitir la disociación completa de los complejos de nucleoproteína. </li><li> Traslado lisado en 1,5 ml RNasa y tubos de microcentrífuga-DNasa libre. Añadir 0,2 ml de cloroformo por TRIzol 1 ml. Agitar los tubos vigorosamente a mano durante 15 segundos e incubar ellos a TA durante 5 a 10 min. Centrifugar a 12000 xg durante 15 min a 4 ° C. Observar la mezcla se separa en una fase roja (fenol-cloroformo) inferior, una interfase y una fase acuosa superior incoloro. ARN permanece exclusivamente en la fase acuosa. </li><li> TranSfer cuidadosamente la fase acuosa superior a un tubo nuevo sin perturbar la interfase. Precipitar el RNA de ella por la mezcla con 0,5 ml de alcohol isopropílico. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 10 min y se centrifuga a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C. El ARN precipitados de la formación de un sedimento blanco en el lado y la parte inferior del tubo. </li><li> Eliminar el sobrenadante. Lavar el pellet de ARN una vez con 1 ml de etanol al 75%. Mezclar las muestras mediante vórtex y centrifugar a 7500 xg durante 5 min a 4 ° C. Brevemente secar el ARN (secar al aire durante 10 min). Disolver ARN en 0,1 ml de DEPC (RNasa libre de agua) y se incuba durante 10 minutos a 55 ° C. </li><li> Cuantificar ARN usando un espectrofotómetro. Para ello, diluir las muestras 100 veces en agua DEPC y leer en longitudes de onda de 260 nm. La concentración de ARN será entonces: OD 260 x 40 / ul x factor de dilución ng. </li><li> Igualar las concentraciones de ARN y síntesis de ADNc según las instrucciones del fabricante utilizando RT-PCR System para Kit primer capítulo de síntesis de cDNA. Comosegún las instrucciones del fabricante, medir los niveles de ARNm de genes por PCR en tiempo real (45 ciclos) en un sistema de detección de ADN en tiempo real. Normalizar los niveles de expresión de genes con genes de dos de limpieza, por ejemplo, β-actina y GAPDH. NOTA: Normalizar la concentración de ARN a 500 mg / ml y 0,5 mg usar para la síntesis de ADNc. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.

Los macrófagos son cruciales para la supervivencia y proporcionan un objetivo tentador para manipular el anfitrión de objetivos inmunológicos. El descubrimiento de TLRs y otras moléculas de reconocimiento han llevado a cabo los macrófagos para el centro de debate inmunológica. Los macrófagos responden a una variedad de estímulos, incluyendo citoquinas, moléculas de daño asociado moleculares patrón (20) amortigua y moléculas asociadas con grupos de patógenos (PAMPs) 21. Estas respuestas diferentes e...

El sistema reticuloendotelial fagocítica se compone de células en diversos tejidos y órganos tales como la médula ósea, la sangre, el hígado y el bazo. Los macrófagos se distribuyen ampliamente en todo el cuerpo, donde principalmente participan en innata y adaptativa la respuesta inmune para controlar las infecciones y claros. Además de su papel en la defensa del huésped, los macrófagos también juegan un papel importante en la cicatrización de heridas y en el mantenimiento de la homeostasis del tejido 1,2. Además, los macrófagos no sólo son importantes para la función inmune, pero también participan activamente en la homeostasis del hierro 3. En el cuerpo, aproximadamente 80% de hierro está presente en la hemoglobina dentro de los eritrocitos, que cuando senescentes son fagocitadas por los macrófagos 4. Todos los días, estos macrófagos reciclan 25 mg de hierro eritrocitos derivados y proporcionar su transporte en el plasma 5. Por otra parte, durante la infección y la inflamación, los macrófagos pro-inflamatorias secuestran hierro sérico para reducir DISPONIBIL hierrodad a los patógenos, tanto a nivel sistémico y local 6-8. Además, los estudios han demostrado que los macrófagos y principalmente los hepatocitos producen un péptido antimicrobiano llamado hepcidina que es considerado el maestro regulador del metabolismo del hierro 9, 10. La hepcidina se incrementa principalmente por estímulos inflamatorios y es parcialmente responsable de secuestro de hierro en los macrófagos en inflamación crónica 11-13. Como expresión de hepcidina en los macrófagos no se entiende muy bien, hemos estudiado el posible papel de los receptores tipo Toll (TLR) en este reglamento. Los TLRs se encuentran principalmente en los macrófagos y juegan un papel central en su activación. Además, LPS expresión de hepcidina inducida en el hígado es dependiente de TLR4 13. Por lo tanto, para ejecutar nuestro estudio, hemos utilizado un método basado en el aislamiento de macrófagos peritoneales murinos. Líneas celulares de macrófagos se utilizan ampliamente en espárrago macrófagoss; no obstante, la cultura extendida puede provocar la pérdida de genes y la disminución de las funciones inmunes en estas líneas celulares. Por lo tanto, el aislamiento de los macrófagos de la cavidad peritoneal es crucial. La cavidad peritoneal de ratón presenta un sitio ideal para cosechar los macrófagos 13-15. Macrófagos peritoneales murinos aislados son convenientes para varios estudios con respecto a su función inmunológica. Sin embargo, el número de macrófagos en el peritoneo es insuficiente para estudios extensos y se estima alrededor de 1 x 10 6 macrófagos por ratón. Por lo tanto, para aumentar la producción de macrófagos, un agente de provocar estéril tal como tioglicolato se inyectó en la cavidad peritoneal anterior a la cosecha de células. Después de la inyección de tioglicolato, el rendimiento de los macrófagos por ratón se incrementó en 10 veces. A pesar del aumento en los macrófagos rendimiento, tioglicolato actos medianas de cerveza como un irritante que induce una respuesta inflamatoria, lo que resulta en el reclutamiento de macrófagos, que may pero no es necesario afectar a la expresión génica. Por lo tanto, un grupo de control que consiste en macrófagos no tratados debe ser incluido en cada experimento. En nuestras manos, la expresión de hepcidina que está muy estimulada por la inflamación no se detectó en tioglicolato no tratado provocada macrófagos peritoneales. Por otra parte, los estudios han demostrado que tioglicolato de Brewer recluta numerosos macrófagos, pero no activa ellos 16. Por otro lado, tioglicolato de Brewer suscitó macrófagos mostraron un aumento en la enzima lisosomal, pero una disminución en matar microorganismos ingeridos 17. Sin embargo, la capacidad fagocítica no se vio afectada en comparación con los macrófagos no-suscitó 16. Una vez cultivadas en platos, los macrófagos peritoneales se convierten adherente, por lo tanto permitiendo su separación de otro tipo de células aisladas de la cavidad peritoneal. Posteriormente, los macrófagos aislados fueron desafiados con diferentes agonistas de TLR.Finalmente, el ARNm se extrajo de las células cultivadas y la expresión génica se analizó mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (QRT-PCR).

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 ratones</td><td>Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, EE. UU.)</td><td>475</td><td></td></tr><tr><td>Tioglicolato</td><td>Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO)</td><td>19032-500G</td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% pentobarbital sódico (utilizado para la anestesia en ratones (80 mg/kg, i.p.))</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s solución salina tamponada con fosfato (DPBS), colocada en hielo y servirá para recolectar macrófagos</td><td>WISENT INC Canada (QC)</td><td>311-425-CL</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium 1640 (Suplemento con penicilina, estreptomicina, L-glutamina y 10 % de suero fetal de ternero).</td><td>WISENT INC Canadá (QC)</td><td>350-000-CL</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas de 1 y 5 ml</td><td>BD USA (NJ)</td><td></td><td></td></tr>309659 <tr><td>placas de 6 pocillos</td><td>Corning Incorporated (NY, EE. UU.)</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Lipoproteína bacteriana Pam3CSK4 (0,5 mg/ml)</td><td>InvivoGen (San Diego, EE. UU.)</td><td>TLRL-PM25</td><td></td></tr><tr><td>Poliionosina&ndash; ácido policitidílico (Poly(I:C)) (10 mg/ml)</td><td>InvivoGen (San Diego, EE. UU.)</td><td>TLRL-PIC</td><td></td></tr><tr><td>LPS de Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml)</td><td>InvivoGen (San Diego, EE. UU.)</td><td>L2880</td><td></td></tr><tr><td>Flagelina purificada de Salmonella typhimurium (100 ng/ml)</td><td>InvivoGen (San Diego, EE. UU.)</td><td>TLR-FLIC-10</td><td></td></tr><tr><td>Lipoproteína sintética FSL1 (100 ng/ml)</td><td>InvivoGen (San Diego, EE. UU.)</td><td>TLR-FSL</td><td></td></tr><tr><td>ssRNA derivado de la repetición terminal larga del VIH-1 ssRNA40 (1 &mu; g/ml)</td><td>InvivoGen (San Diego, EE. UU.)</td><td>TLR-LRNA-40</td><td></td></tr><tr><td>Tipo B CpG oligonucleótido ODN1826 (1 &mu; M)</td><td>InvivoGen (San Diego, EE. UU.)</td><td>11B16-MM</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen, (Burlington, ON, Canadá)</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Agujas de 20 G y 23 G</td><td>BD USA (NJ)</td><td></td><td></td></tr>305175 <tr><td>Pinzas</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>tijera</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml tubos cónicos colocados en hielo</td><td>Sarstedt (Newton, MA, EE. UU.)</td><td>62.547.205</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lisis de glóbulos rojos</td><td>Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO)</td><td>R7757-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td><td></td>refrigerada</tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>F4/80 anticuerpo</td><td>BIO-RAD ( CA, EE. UU.)</td><td></td><td></td></tr>MCA497APC <tr><td>Anticuerpos CD16/CD32</td><td>Pharmingen, {Mississauga, ON, CA)</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Citómetro</td> <td>de flujoMostrador Coulter Epics Elite, Coulter, (Hialeah, FL, EE. UU.)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1,5 ml Tubos Eppendorf</td><td>Axygen Scietific (CA, EE. UU.)</td> <td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Fisher Scientific (ON, Canadá)</td><td>UN1888</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol isopropílico</td><td>JT Baker (PA, EE. UU.)</td><td>70566</td><td></td></tr><tr><td>Etanol al 75% (en agua tratada con DPC)</td><td>Commercial Alchohols (QC, Canadá)</td><td>17394</td><td></td></tr><tr><td>0.01% de agua tratada con pirocarbonato de dietilo (DEPC) (dejar reposar durante la noche y autoclave)</td><td>Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO)</td><td>216.542.8</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de RT-PCR Omniscript</td><td>Qiagen, (Mississauga, ON, Canadá)</td><td>205113</td><td></td></tr><tr><td>Rotor Gene 3000</td><td>Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canadá)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kits de PCR QuantiTect SYBR Green I</td><td>Qiagen, (Mississauga, ON, Canadá)</td><td>204141</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de macrófagos peritoneales murinos para llevar a cabo análisis de expresión génica al toll-like receptores estimulación

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

Durante la infección y la inflamación, los monocitos circulantes abandonan el torrente sanguíneo y migran hacia los tejidos, donde se diferencian en macrófagos. Los macrófagos expresan receptores de superficie de tipo Toll (TLRs), que reconocen patrones moleculares conservados a través de la evolución en una amplia gama de microorganismos. TLRs jugar un papel central en la activación de macrófagos que generalmente se asocia con la alteración de la expresión génica. Los macrófagos son críticos en muchas enfermedades y se han convertido en objetivos atractivos para la terapia. En el siguiente protocolo, se describe un procedimiento para aislar los macrófagos peritoneales murinos utilizando medio de tioglicolato de Brewer. Este último será impulsar la migración de monocitos en el peritoneo, en consecuencia esto elevará el rendimiento de los macrófagos por 10 veces. Varios estudios se han llevado a cabo utilizando la médula ósea, el bazo o peritoneales macrófagos derivados. Sin embargo, los macrófagos peritoneales se mostró a ser más maduro tras el aislamiento y son más estables en su funcionaldad y fenotipo. Por lo tanto, los macrófagos aislados de la cavidad peritoneal murino presentan una importante población de células que pueden servir en diferentes estudios inmunológicos y metabólicos. Una vez aislado, los macrófagos fueron estimulados con diferentes ligandos de TLR y en consecuencia se evaluó la expresión génica.

En primer lugar, caracterizamos los macrófagos peritoneales murinos aislados por citometría de flujo. Para ello, hemos utilizado (F4 / 80) anticuerpos que reconocen específicamente marcadores única expresadas por los macrófagos. Se requiere esta caracterización para determinar el porcentaje de aislado de macrófagos y distinguirlos entre células obtenidas durante el proceso de aislamiento. Como se muestra en la (Figura 1), el porcentaje de células que expresan el antígeno F4 / 80 fue encontrado consisten...

Describimos aquí un protocolo sencillo para aislar macrófagos peritoneales murinos. A este procedimiento le sigue la extracción de ARN para llevar a cabo el análisis de la expresión génica tras la estimulación de los receptores tipo Toll.

Aislamiento de macrófagos peritoneales murinos para llevar a cabo análisis de expresión génica Al Toll-like Receptores Estimulación

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar macrófagos peritoneales de ratón y realizar un análisis de expresión génica tras la estimulación de los receptores tipo toll. Esto se logra primero inyectando un 3,8 % de medio de Brewer thioglicolato en la cavidad peritoneal del ratón para aumentar la migración de monocitos hacia el peritoneo y, por tanto, incrementar el rendimiento de macrófagos tras tres días. Luego se sacrifica al ratón e inyecta solución salina tampón fosfato fría de ECCOs en la cavidad peritoneal para recolectar las células.Tras un suave masaje en la cavidad peritoneal, se aspira cuidadosamente el líquido peritoneal. A continuación, se cultivan las células obtenidas y los macrófagos peritoneales elicidos se caracterizan mediante citometría de flujo. El paso final consiste en estimular estos macrófagos con diferentes ligandos de receptores tipo toll o TLR y aislar el ARN de las muestras.Finalmente, se utiliza la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa para medir la expresión del gen de interés. El objetivo del siguiente procedimiento es aislar macrófagos peritoneales mediante el uso de medio de Brewer con TIO de glicol. Este medio aumentará la migración de monocitos hacia el peritoneo y, por lo tanto, incrementará el rendimiento de macrófagos.Una vez aislados, los macrófagos serán estimulados con diferentes ligandos de receptores tipo toll para estudiar la regulación molecular de la hepcidina como nuestro gen de interés. Para comenzar, prepare el medio de Brewer's Bio Glyco 8 al 3,8 % según se describe en el protocolo del texto, utilizando jeringas de un mililitro conectadas a agujas de calibre 23. Inyecte un mililitro del medio de Brewer's Bio Glycol 8 al 3,8 % en la cavidad peritoneal de cada ratón y espere tres días.Utilice una jeringa y aguja nuevas para cada ratón tras la anestesia y eutanasia del ratón según se describe en el protocolo escrito; empape el abdomen de cada ratón con etanol al 70 %. Realice una incisión lateral a lo largo de la línea media inferior del peritoneo con tijeras. Utilice pinzas para retirar la piel abdominal y exponer la piel peritoneal transparente.Luego, inyecte cinco mililitros de solución salina tamponada con fosfato ECCOs fría en la cavidad peritoneal de cada ratón mediante jeringas de cinco mililitros acopladas a agujas de calibre 20. Realice un masaje suave sobre la cavidad peritoneal y luego aspire cuidadosamente el líquido sin perforar ningún órgano. Retire la aguja y vierta el líquido peritoneal en tubos cónicos para centrífuga de 50 mililitros.A continuación, centrifugue el líquido peritoneal recolectado durante 10 minutos a 400 × g o 1500 RPM en una centrífuga refrigerada; las células deben mantenerse frías durante todo el procedimiento. Deseche el sobrenadante y re suspenda el botón celular en medio RPMI 1640. Utilizando un hemocitómetro, cuente las células y ajuste las muestras a una densidad celular de 1 millón de células por mililitro.Caracterice el fenotipo de las células aisladas mediante citometría de flujo para confirmar el enriquecimiento de macrófagos. Utilice 1 millón de células por ratón y anticuerpos contra F four 80, que es un antígeno de superficie expresado en macrófagos directamente. Después del aislamiento, agregue 1 millón de células en cada pocillo de una seis.Placa de cultivo. Deje que los macrófagos peritoneales murinos se adhieran a los pocillos cultivándolos durante una a dos horas a 37 grados Celsius. Tras la incubación, elimine las células no adherentes lavando suavemente tres veces con solución salina tamponada con fosfato tibia.Luego, agregue 900 microlitros de DMEM sin suero a las células. Prepare soluciones stock 10 x de cada ligando del receptor tipo toll o TLR según se indica en el protocolo del texto. A continuación, agregue 100 microlitros de las soluciones stock a cada pocillo, realizando así un cultivo con dilución diez veces.Las células durante 24 horas en presencia de los ligandos de TLR. Para realizar el aislamiento de ARN primero, retire todo el medio y licee las células directamente en las placas de seis pocillos. Añadiendo un mililitro de reactivo triol a cada pocillo y pasando el lisado celular varias veces a través de una pipeta.Luego, incubar las muestras homogenizadas durante cinco a 10 minutos a temperatura ambiente para permitir la disociación completa de los complejos de proteínas nucleares. Tras la incubación, transferir el lisado a tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros para ARN y ADN spree, y añadir 0,2 mililitros de cloroformo por cada mililitro de reactivo triol. Agitar los tubos enérgicamente a mano durante 15 segundos antes de incubarlos a temperatura ambiente durante cinco a 10 minutos.Luego, centrifugue a 12.000 × g durante 15 minutos a cuatro grados Celsius. Observe la separación de la mezcla en una fase inferior roja de fenol-cloroformo, una fase intermedia y una fase acuosa superior incolora. El ARN permanece exclusivamente en la fase acuosa.Transfiera cuidadosamente la fase acuosa superior a un tubo nuevo sin perturbar la fase intermedia. Precipite el ARN de esta mezclándolo con 0,5 mililitros de alcohol isopropílico tras incubar las muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos. Centrifugue a 12.000 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.Los precipitados de ARN forman un pellet blanco en la pared y el fondo del tubo. Retire el sobrenadante y lave el pellet de ARN una vez con un mililitro de etanol al 75%. Mezcle las muestras mediante vortex y luego centrifugue a 7.500 ×g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.Tras eliminar el sobrenadante, seque brevemente el ARN al aire durante 10 minutos. Luego, disuelva el ARN en 100 microlitros de agua libre de ARN e incube durante 10 minutos a 55 grados Celsius. A continuación, cuantifique el ARN utilizando un espectrofotómetro para ello.Diluya las muestras 100 veces en agua libre de ARN y lea a longitudes de onda de 260 nanómetros para igualizar las concentraciones de ARN y sintetice ADNc según las instrucciones del fabricante. Utilice el sistema de RT-PCR para el kit de síntesis de la primera cadena de ADNc. Luego, mida los niveles de ARNm génicos mediante PCR en tiempo real en un sistema de detección de ADN en tiempo real, normalizando los niveles de expresión génica con dos genes de referencia.Los macrófagos peritoneales de espejo aislados fueron caracterizados mediante citometría de flujo para determinar el porcentaje de macrófagos aislados y para distinguirlos entre las células obtenidas durante el proceso de aislamiento. Se encontró consistentemente que el porcentaje de células que expresaban el antígeno F cuatro 80 era superior al 95%. A continuación, las células aisladas fueron tratadas con varios ligandos de TLR y ARNm. Los niveles de hepcidina fueron medidos mediante R-T-P-C-R para el receptor tipo Toll uno y dos, y el receptor tipo Toll cuatro.Un receptor olfativo seis y dos ligandos fueron capaces de estimular el ARNm de hepcidina en macrófagos peritoneales. En conjunto, estos resultados demuestran la utilidad de este protocolo para aislar con éxito macrófagos peritoneales y para investigar con precisión la regulación molecular de la expresión génica. Después de ver este video, usted tendrá una buena comprensión de cómo aislar, identificar y cultivar macrófagos peritoneales.

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Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

La cavidad peritoneal de los mamíferos contiene diferentes poblaciones de células inmunes crucial para la respuesta inmune innata. Un método eficaz aislamiento es necesario para los análisis bioquímicos y funcionales de estas células. Aquí le ofrecemos un método integral para el aislamiento de las células en la cavidad peritoneal del ratón.

Aislamiento de células de ratón cavidad peritoneal

Este video muestra la activación de los macrófagos peritoneales de un ratón utilizando inmunoglobulina intravenosa y lipopolisacárido bacteriano. La coestimulación activa los macrófagos peritoneales en macrófagos antiinflamatorios que poseen actividad inmunorreguladora.

Activación in vivo de macrófagos peritoneales en respuesta a anticuerpos en un modelo murino

Este video muestra un procedimiento para analizar la eferocitosis mediada por macrófagos peritoneales de timocitos apoptóticos de ratón mediante microscopía de fluorescencia.

Análisis de la eferocitosis de timocitos apoptóticos por macrófagos peritoneales

En este protocolo, describimos métodos para transfectar eficientemente líneas celulares de macrófagos murinos con siRNAs utilizando el sistema de lanzadera Amaxa Nucleofector de 96 pocillos, estimular los macrófagos con lipopolisacáridos y monitorear los efectos sobre la producción de citoquinas inflamatorias.

El uso de ARN de interferencia para Investigar la respuesta inmune innata en macrófagos de ratón

Se presenta un protocolo simple y eficiente para la generación de macrófagos humanos. Buffy abrigos son procesados ​​por doble centrifugación en gradiente de densidad y monocitos aislados se diferencian a continuación, a los macrófagos en bolsas de cultivo de células de teflón. Esto maximiza el rendimiento de los macrófagos y facilita la recolección de células para los experimentos posteriores.

Aislamiento de monocitos humanos por doble centrifugación en gradiente y su diferenciación a macrófagos en Bolsos Cultivo Celular recubiertos de teflón

Los macrófagos son células plásticas del sistema hematopoyético que tienen un papel crucial en la inmunidad protectora y la homeostasis. En este informe se describen las técnicas in vitro optimizadas para caracterizar fenotípicamente y funcionalmente los macrófagos reguladores infiltrantes del injerto que se acumulan en el órgano trasplantado bajo condiciones tolerógenas.

Caracterización funcional de macrófagos reguladores que inhiben la inmunidad reactiva al injerto

Medicamentos a base de anticuerpos han revolucionado el tratamiento de enfermedades inflamatorias. Además de tener efectos directos sobre objetivos específicos, anticuerpos pueden activar macrófagos a ser antiinflamatorias. Este protocolo describe cómo antiinflamatorio macrófago activación puede ser evaluado in vitro, utilizando los macrófagos de la médula ósea de ratón y en vivo, con los macrófagos peritoneales.

Evaluación de los efectos de drogas basados en anticuerpos en médula ósea murina y activación de los macrófagos peritoneales

Aquí presentamos un protocolo para preparar los timocitos apopónticos y los macrófagos peritoneal y analizar la eficiencia de la efervocitosis y el bloqueo específico por inhibidores de los timocitos apopónticos. Este protocolo tiene una amplia aplicación en el aclaramiento mediado por células de otras partículas, incluyendo granos artificiales y bacterias.

Análisis experimental del engulfment de thymocyte Apopético por los macrófagos

Aquí, presentamos un método utilizando soportes de membrana permeables para facilitar el estudio de la señalización paracrina sin contacto utilizada por las células tumorales para suprimir la respuesta inmune. El sistema es susceptible de estudiar el papel de los factores secretos por tumores en la desactivación de los macrófagos de amortiguación.

Estudio de los efectos de los ligandos paracrinos secretos de tumor en la activación de macrófagos utilizando co-cultivo con soportes de membrana permeable

El presente protocolo describe el aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea de ratones.

Aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea a partir de ratones

Demostramos un protocolo paso a paso para la investigación de la función génica en macrófagos residentes en tejido peritoneal in vivo, utilizando vectores lentivirales.

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Aprende a aislar macrófagos peritoneales murinos para análisis de expresión génica tras estimulación de receptores Toll-like. Este protocolo optimiza el rendimiento celular mediante migración de monocitos.

Aislamiento de macrófagos peritoneales murinos para llevar a cabo análisis de expresión génica Al Toll-like Receptores Estimulación (Video) | JoVE Journal

Aislamiento de macrófagos peritoneales murinos para llevar a cabo análisis de expresión génica Al Toll-like Receptores Estimulación

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