Name: La detección de la enfermedad asociada-α-sinucleína por ELISA mejorada en el cerebro de ratones transgénicos que sobreexpresan A53T humano mutado α-sinucleína (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Aprende a cuantificar α-sinucleína asociada a enfermedad mediante ELISA en ratones transgénicos M83. Este método permite monitorear la acumulación proteica en regiones cerebrales caudales como mesencéfalo y tronco encefálico.

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Los autores desean agradecer a Damien Gaillard para inoculaciones y el seguimiento de los experimentos con animales. Este trabajo fue apoyado por la ANSES (Agencia Francesa para la Alimentación, Medio Ambiente y Salud Ocupacional y Seguridad) y por una beca de la Fundación France Parkinson.

Todos los procedimientos y protocolos con animales estaban en conformidad con la Directiva 86/609 / CEE del Consejo y ratificado por venir, el Comité Nacional Francés para la consideración de la ética en la experimentación animal (protocolo de 11 a 0043) de la CE. Los animales fueron alojados y atendidos en ANSES aprobada de instalaciones experimentales en Lyon (aprobación B 69387 0801). 1. Preparación de ratones <ol><li> La eutanasia a los ratones mediante una inyección intraperitoneal de dosis letal de pentobarbital de sodio. </li><li> Recuperar todo el cerebro del cráneo del ratón y colocarlo en un 35 mm placa Petri de plástico en el hielo hasta la extracción. </li><li> Se extrae la médula espinal cervical. NOTA: aS Extraer ya sea desde una de las mitades del cerebro después de la sección sagital o de cerebros de ratón disecados, disponible después de los experimentos enumerados en la Tabla 1. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Experiment </td><td> Ratones Inóculo (cerebro equivalente) </td><td> Período de supervivencia (Dpi) </td><td> La mediana / supervivencia máxima (días de edad) </td><td> aS d detección por ELISA / BM / IHC </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Los ratones inoculados </td><td> 441 ± 166 </td><td> 419/736 </td><td> 8/8 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Ratones inoculados (0,2 mg) </td><td> 150 ± 52 </td><td> 140/241 </td><td> 9/9 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Lista de experimentos realizados en ratones M83. Las inoculaciones se realizaron a las 6 semanas para el experimento 2 en la zona cortical-estriado con 20 l de un homogeneizado de cerebro de un ratón enfermo (1% peso / vol en glucosa al 5%), después de anestesia de 6 semanas de edad ratones homocigotos M83 en un 3% la inhalación de isoflurano. dpi: días después inoculación. 2. aS Extracción de Brain Mitades <ol><li> Sagitalmente cortó el cerebro para obtener dos mitades. Pesar cada mitad en un tubo que contiene ribolysis bolas de molienda. </li><li> Preparar elevado de sal (HS) tampón que contiene 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 750 mM, EDTA 5 mM, DTT 1 mM, 1% de fosfatasa inhibidores de la proteasa y cócteles. Añadir tampón elevado de sal a las mitades del cerebro para obtener 20% (peso / volumen) homogeneizados. </li><li> Preparar las muestras de las mitades del cerebro utilizando un homogeneizador mecánico a 6,0 m / s para 23 seg dos veces. Después de la primera homogeneización 23 seg, colocar los tubos que contienen los homogeneizados en hielo durante 2 minutos antes de que el segundo ciclo de 23 seg. </li><li> Centrifugar las muestras a 1000 xg durante 5 min para eliminar fragmentos cerebrales no molidos. Recuperar los sobrenadantes, se dividen en 200 ml de alícuotas y mantenerlos a -80 ° C para el análisis ELISA posterior. </li></ol> 3. aS Extracción de diseccionado cerebrales Regiones <ol><li> Diseccionar untodo el cerebro en un 35 mm placa Petri de plástico en el hielo con una lupa de baja potencia (ampliación 8X) utilizando dos forcipes cuyos extremos se mantienen juntos, excepto cuando la disección del hipocampo. No exceda de 10 minutos para preservar la integridad del cerebro. Coloque el cerebro boca arriba y recuperar las regiones cerebrales siguientes en este orden: <ol><li> Separar una de las dos bulbos olfatorios utilizando fórceps colocados justo detrás de la bombilla. Separe desde el cerebro por un movimiento hacia abajo. Repita esta operación para el segundo foco. </li><li> Cuña suavemente las pinzas entre las dos cortezas y moverlo hacia delante para facilitar la disociación de las dos cortezas. Mantener el cerebro en su lugar con uno fórceps, utilizar otra para separar la corteza del hipocampo. </li><li> Coloque la pinza 2 mm por debajo de la corteza. Mantener una presión suave sobre las pinzas hasta la parte superior del hipocampo es visible. Despegar la primera parte de la corteza, y repetir con la segunda parte. Utilice las pinzas para separar las dos cortezascomenzando en el hipocampo y moviéndose hacia la parte delantera del cerebro. </li><li> Coloque las pinzas abiertas alrededor de uno de los hipocampos. Cierre la pinza en la parte inferior del hipocampo luego retire suavemente, recuperando tanto como sea posible. Repita el procedimiento para el segundo hipocampo. </li><li> Coloque las pinzas abiertas debajo de uno de los cuerpos estriados y suavemente separarlo del cerebro. Utilice las pinzas para quitar cualquier corteza restante del cuerpo estriado. Repita este procedimiento para el segundo cuerpo estriado. </li><li> Usa los fórceps para deprimir suavemente por 2 mm el contorno del cerebelo para facilitar la separación del cerebelo del cerebro. Coloque la pinza justo detrás del cerebelo y quitarlo moviendo la pinza hacia adelante. </li><li> Utilice la parte ancha de las pinzas para levantar el mesencéfalo con el fin de ver claramente donde se une con el tallo cerebral. Hacer una incisión vertical en la unión luego retire el tallo cerebral. </li><li> Coloque la pinza detrás del mesencéfalo, que is compuesta de cuatro estructuras redondeadas. Una incisión vertical hasta el mesencéfalo ha sido completamente separado del cerebro restante. </li></ol></li><li> Preparar homogeneizados de% variable (peso / volumen) en tampón HS, dependiendo de la cantidad de tejidos disponibles, es decir, 5% homogeneizado para un peso entre 10 y 30 mg, 10% para un peso entre 30 y 80 mg, y 20% para un peso por encima de 80 mg. <ol><li> Añadir un volumen adecuado de tampón HS a las regiones cerebrales disecadas para obtener el% esperado de homogeneizado. </li><li> Vortex y comprobar que los tejidos están completamente inmersos en el búfer HS. </li><li> Homogeneizar las muestras preparadas a partir de las regiones cerebrales disecadas o la médula espinal cervical con un triturador de tejidos compuesta de un tubo de vidrio de borosilicato y dos manos de mortero, A y B. </li><li> Verter cada región del cerebro de ser aplastado directamente en el tubo. Inserte mano de mortero A en el tubo y retraerlo. Repita este movimiento alrededor de diez veces para disociar el tejido. A continuación, utilice la maja B para continuac moliendo el tejido con 20 movimientos. La transferencia de los homogeneizados en un tubo de 1,5 ml con una pipeta de transferencia 1 ml. </li></ol></li><li> Centrifugar las muestras a 1000 xg durante 5 min a 4 ° C para eliminar cualquier fragmento cerebrales no molidos. Recuperar los sobrenadantes, dividirlos en 200 ml de alícuotas y mantenerlos a -80 ° C para el análisis ELISA posterior. </li></ol> 4. Detección de aS por ELISA <ol><li> Diluir los anticuerpos de recubrimiento de 0,01 ng / ml. Utilice-aS policlonal anti conejo o monoclonal clon 42 de anticuerpos en 50 mM Na 2 CO 3 / NaHCO3 (pH 9,6). </li><li> Escudo del microplacas de 96 pocillos con 100 l por pocillo de esta solución de revestimiento, y dejar a 4 ° CO / N. Utilice el anticuerpo policlonal de conejo anti-aS en la solución de recubrimiento para ELISA utilizando anticuerpos de detección syn514, clonar 42, LB509, AS11, 4D6 o 8A5. Utilice el clon de anticuerpo monoclonal anti-aS 42 como una solución de revestimientoen combinación con el anticuerpo de detección anti-pSer129 aS. NOTA: Si es necesario, las placas pueden mantenerse a 4 ° C durante una semana antes de la prueba ELISA se lleva a cabo. </li><li> Utilice un lavador de placas para lavar las placas cinco veces con 300 l de solución salina tamponada con fosfato con 0,05% de Tween 20 (PBST) por pocillo. A partir de este paso hacia adelante, la incubación es a TA. </li><li> Añadir 200 l de PBS T20 tampón de bloqueo por pocillo. Agitar durante 1 hora a 150 rpm. Lavar las placas cinco veces con PBST. </li><li> Diluir los homogeneizados de cerebro (dilución 1: 100 de los homogeneizados de 20%, 01:50 de los homogeneizados de 10% y 1:25 de los homogeneizados de 5% en PBST BSA 1%), y añadir 100 l a cada pocillo. A continuación se incuba durante 2 horas con agitación a 150 rpm. Lavar las placas cinco veces con PBST. </li><li> Añadir los diferentes anticuerpos de detección aS en PBST con BSA 1% en las diluciones mencionadas en la Lista de materiales. Incubar durante 1 hora a 150 rpm. Lavar las placas cinco veces con PBST. </li><li> Añadir o bien contra-Ratón o anti-conejo conjugados HRP IgG diluyeron 1: 8000 en PBST suplementado con BSA 1% durante 1 h con agitación a 150 rpm. Lavar las placas cinco veces con PBST. </li><li> Añadir 100 l de 3,3 &#39;, solución de 5,5&#39;-tetrametilbencidina (TMB) a cada pocillo e incubar durante 15 min en la oscuridad con agitación a 150 rpm. </li><li> Detener la reacción mediante la adición de 100 l de HCl 1 N por pocillo luego medir la absorbancia a 450 nm con el lector de microplacas. </li><li> Para el análisis de datos, restar el valor de DO obtenido en un pozo con todos los reactivos excepto las muestras de cerebro de ratón (así en blanco) de los valores de la DO medidos para cada una de las muestras analizadas. </li></ol> 5. Epitope Mapping <ol><li> Realizar el mapeo de epítopos de acuerdo con el método descrito por Osman 16. En pocas palabras, los péptidos del punto de la secuencia de α-sinucleína humana contiene 12 aminoácidos de nitrocelulosa con 10 aminoácidos que se solapan. </li><li> Bloque con 50 mM Tris / tampón NaCl 150 mM pH 10 que contiene 0,05% de Tween 20 y 5% de leche en polvo. Incubar el anticuerpo en solución de bloqueo a una concentración de 2 mg de anticuerpo por ml a 2-10 ° CO / N. </li><li> Se lava la membrana tres veces con 50 mM Tris / NaCl 150 mM pH del tampón 10 que contiene 0,05% de Tween 20. Incubar con el anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado HRP. Lavar la membrana otros cinco veces con el mismo tampón a continuación mancha usando un kit de tinción blot TMB occidental. </li></ol> 6. Análisis estadístico <ol><li> Utilice el paquete de software de R y nlme para realizar regresiones de efectos mixtos para modelar OD. Para cada comparación, lleve a cabo un modelo de regresión efecto mixto. Use un efecto fijo para distinguir los síntomas de los grupos asintomáticos. </li><li> Utilice un efecto aleatorio para reflejar la variabilidad de repeticiones para un ratón dado. Compruebe homocedasticidad mediante el examen de los residuos y, si es necesario, utilice las funciones de varianza para modelar la estructura de la varianza de los errores dentro de los grupos de acuerdo con Pinheiro y Bates 17. Establecer 0,05 como el umbral de significación de P. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses para divulgar.

El uso de un ELISA se demostró para detectar específicamente aS D directamente a partir de homogeneizados de cerebro de ratón durante la enfermedad en el modelo de ratón transgénico M83. De hecho, este ELISA podría distinguir fácilmente los ratones M83 enfermos de ratones sanos M83 utilizando homogeneizados de cerebro solamente enteros en tampón elevado de sal. Los pasos más importantes para los resultados exitosos que utilizan este ELISA son: disección correctamente las diferente...

La mayoría de los métodos actuales para detectar la α-sinucleína asociada a enfermedades (αSD) en modelos experimentales de la enfermedad de Parkinson (EP), como la inmunohistoquímica o el Western blot, son lentos y no cuantitativos. Esta enfermedad neurodegenerativa se caracteriza por la agregación de alfa-sinucleína principalmente en forma de inclusiones que contienen una forma agregada de la proteína presináptica normalmente soluble αS1,2 (cuerpos de Lewy y neuritas de Lewy). Normalmente solo marginalmente fosforilada, αS está hiperfosforilada en su residuo de serina 129 en estas inclusiones3 y puede ser monitoreada por anticuerpos específicamente dirigidos contra αS fosforilado en Ser129, proporcionando así un marcador confiable de la patología.
Investigaciones recientes sugieren que un mecanismo "tipo prion" podría estar involucrado en la propagación de la agregación de αS dentro del sistema nervioso de un paciente afectado4,5. Estos estudios informaron la aceleración de una sinucleinopatía mediante la inoculación de extractos cerebrales que contienen αSD en un modelo de ratón transgénico (M83) que expresa una proteína αS humana mutada A53T asociada con un deterioro motor severo que ocurre a medida que los ratones envejecen6. De la misma manera, la inoculación intracerebral de αS recombinante agregado en el mismo modelo de ratón M83 confirmó la aceleración de la agregación5. La inducción de depósitos de αS fosforilado también se ha reportado después de la inoculación de ratones C57Bl/6 de tipo silvestre con αS recombinante fibrilar o extractos cerebrales de pacientes humanos con DBL7,8. Sacino et al.9 recientemente señalaron que después de la inyección de αS humano fibrilar, se podría inducir una formación generalizada y progresiva de inclusiones de αS cerebral en ratones M83, pero no en ratones transgénicos E46K o ratones no transgénicos en los que las inclusiones de αS inducidas eran transitorias y principalmente restringidas al sitio de inyección. Estudios recientes en monos confirmaron la propagación de agregados de αS después de la inoculación de extractos derivados de EP en especies más cercanas a los humanos10.
El vínculo entre las alteraciones de αS y la enfermedad de Parkinson sugiere que αSD es un biomarcador potencial para la enfermedad de Parkinson11. Un estudio reciente mostró la detección de agregados solubles oligoméricos de α-sinucleína en el líquido cefalorraquídeo (LCR) humano y el plasma como un biomarcador potencial para la enfermedad de Parkinson basado en un sistema ELISA de sándwich convencional que utiliza el mismo anticuerpo para capturar y detectar αS12. Basándose en el mismo método, se reconocieron proteínas multiméricas en muestras biológicas, incluyendo el cerebro, porque hay múltiples copias de epítopos presentes en las formas ensambladas13. Muy recientemente, se detectó αS patológico en el LCR de pacientes con una patología de cuerpos de Lewy probada utilizando tanto un kit ELISA con un anticuerpo altamente específico contra αSD (5G4) como un ensayo de inmunoprecipitación14. Estos métodos podrían diferenciar a los pacientes con EP/DBL de otros tipos de demencia.
La propagación "tipo prion" de la agregación de αS se estudió más a fondo en el modelo de ratón transgénico M83 utilizando un enfoque ELISA diseñado para identificar específicamente αSD15. En este estudio, informamos el protocolo ELISA detallado utilizado para detectar cuantitativamente αSD en ratones enfermos (ya sea inoculados o no con αSD de ratones M83 enfermos) y más especialmente en las regiones cerebrales específicamente dirigidas por el proceso patológico en este modelo de ratón transgénico M834.

<table><tbody><tr><td>LB509</td><td>Abcam</td><td>ab27766</td><td>Anticuerpo de detección 1/2,000</td></tr><tr><td>AS11</td><td>Producido en Anses</td><td></td><td>Anticuerpo de detección 1/1,000</td></tr><tr><td>4D6</td><td>Abcam</td><td>ab1903</td><td>Anticuerpo de detección 1/2,000</td></tr><tr><td>PSer129</td><td>Abcam</td><td>ab59264</td><td>Anticuerpo de detección 1/3,000</td></tr><tr><td>PSer129&nbsp;EP1536Y</td><td>Abcam</td><td>ab51253</td><td>Anticuerpo de detección 1/1,000</td></tr><tr><td>syn514</td><td>Abcam</td><td>ab24717</td><td>Anticuerpo de detección 1/500</td></tr><tr><td>clone 42</td><td>BD Biosciences</td><td>610787</td><td>Anticuerpo de recubrimiento y detección (1/2,000)</td></tr><tr><td>8A5</td><td>Proporcionado por el Dr. Anderson</td><td></td><td>Anticuerpo de detección 1/2,000</td></tr><tr><td>anticuerpo policlonal anti-α-syn</td><td>Millipore</td><td>AB5038P</td><td>Anticuerpo de recubrimiento</td></tr><tr><td>Conjugado HRP anti-IgG de ratón</td><td>Southern Biotech</td><td>1010-05</td><td></td></tr><tr><td>Conjugado HRP anti-IgG de conejo</td><td>Southern Biotech</td><td>4010-05</td><td></td></tr><tr><td>Conjugado HRP anti-IgG de cabra de ratón</td><td>Dianova</td><td>115-035-164</td><td></td></tr><tr><td>HS buffer</td><td></td><td></td><td>Ajustar a pH 7.5 y mantener a 4 &#176;C</td></tr><tr><td><ul>
<li>Tris-HCl 50&nbsp;mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>26-128-3094-B</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>NaCl 750 mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>1112-A</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>EDTA 5 mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>EU0007-B</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>DTT 1 mM </li>
</ul></td><td>Sigma</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>Ajustar a pH 7.5</td></tr><tr><td><ul>
<li>Na2HPO4 1&nbsp;mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>1309</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>KH2PO4 1.5&nbsp;mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>2018</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>NaCl&nbsp; 137 mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>1112-A</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>KCl 2.7 mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>P017</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Euromedex</td><td>2001-C</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>DTT 1 mM</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>Solución stock 100 mM, tóxico</td></tr><tr><td>1% cóctel de fosfatasa</td><td>Pierce</td><td>78428</td><td></td></tr><tr><td>1% cóctel inhibidor de proteasa</td><td>Roche</td><td>04&nbsp;693&nbsp;132&nbsp;001</td><td>50x concentrado</td></tr><tr><td>Microplaca MaxiSorpTM</td><td>Thermo Scientific</td><td>442404</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tampon carbonato 50 mM pH 9.6</td></tr><tr><td><ul>
<li>Na2CO3, 10H2O </li>
</ul></td><td>Sigma</td><td>71360</td><td>2.86 g/L</td></tr><tr><td><ul>
<li>NaHCO3 </li>
</ul></td><td>Merk</td><td>6329</td><td>3.36 g/L, pH&nbsp;9.6</td></tr><tr><td>Buffer de bloqueo Superblock T20 PBS</td><td>Pierce</td><td>E6423H</td><td>10x concentrado</td></tr><tr><td>TMB</td><td>Sigma</td><td>T0440</td><td>Usado para ELISA</td></tr><tr><td>TMB</td><td>Analytik Jena AG</td><td>847-0104200302</td><td>Usado para mapeo de epítopos</td></tr><tr><td>HCl 1&nbsp;N</td><td>Chimie plus</td><td>40030</td><td></td></tr><tr><td>Ribolyser</td><td>Thermo</td><td>Fast prep FP120</td><td>mantener en hielo en este paso</td></tr><tr><td>Tubos de molienda</td><td>Biorad</td><td>355-1197</td><td></td></tr><tr><td>Lavador de placas</td><td>Tecan</td><td>Columbus Pro</td><td></td></tr><tr><td>Lector de placas</td><td>Biorad</td><td>Model 680</td><td></td></tr><tr><td>Lente de aumento de baja potencia&nbsp;</td><td>VWR</td><td>630-1062</td><td>8X aumento</td></tr><tr><td>Pinza Dumont#7</td><td>WPI</td><td>14097</td><td>Para pasos de disección</td></tr><tr><td>Pipeta de transferencia 1ml Samso</td><td>Samso</td><td>043231</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 1.5 ml</td><td>Dutscher</td><td>033290</td><td></td></tr></tbody></table>

la detección de la enfermedad asociada-α-sinucleína por elisa mejorada en el cerebro de ratones transgénicos que sobreexpresan a53t humano mutado α-sinucleína

Detection of Disease-associated &#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &#945;-synuclein

Además de los métodos establecidos como Western blot, se necesitan nuevos métodos para cuantificar rápida y fácilmente asociado a la enfermedad α-sinucleína (aS D) en modelos experimentales de synucleopathies. Una línea de ratón transgénico (M83) sobre-expresión de los aS A53T humanos y desarrollar espontáneamente un fenotipo clínico dramática entre ocho y 22 meses de edad, que se caracterizan por síntomas que incluyen pérdida de peso, postración, y deterioro motor severa, se utilizó en este estudio. Para los análisis moleculares de aS D (aS asociado a la enfermedad) en estos ratones, un ELISA fue diseñado para cuantificar específicamente aS D en ratones enfermos. Análisis del sistema nervioso central en este modelo de ratón mostró la presencia de aS D principalmente en las regiones cerebrales caudal y la médula espinal. No hubo diferencias en la distribución aS D entre diferentes condiciones experimentales que conducen a la enfermedad clínica, es decir, en uninoculado y normalmente envejecimiento ratones transgénicos y en ratones inoculados con extractos de cerebro de ratones enfermos. La detección específica de aS D inmunorreactividad utilizando un anticuerpo contra la Ser129 fosforilada aS por ELISA esencialmente correlacionados con la obtenida por Western blot e inmunohistoquímica. Inesperadamente, se observaron resultados similares con varios otros anticuerpos contra la parte C-terminal de aS. La propagación de aS D, lo que sugiere la participación de un mecanismo de &quot;-prión como&quot;, de este modo se puede monitorizar y cuantificar en este modelo de ratón utilizando un enfoque ELISA fácilmente.

En este estudio, las pruebas ELISA utilizadas específicamente identificados aS enfermedades asociadas (aS D) en homogeneizados de cerebro preparados en un tampón de alta sal de ratones enfermos M83. El uso de un anticuerpo que reconoce específicamente pSer129 aS (p = 0,0074), el ELISA distingue fácilmente de edad, ratones enfermos (&gt; 8 meses de edad) de los jóvenes (2-5 meses de edad), los ratones sanos M83 (Figura 1). Varios otros anticuerpos mostraron igualmente altos señales (&gt; 0,6 O...

Se describe una ELISA que ofrece un enfoque cuantitativo novedoso. Detecta específicamente alfa-sinucleína asociada a la enfermedad (αSD) en un modelo de ratón transgénico (M83) de sinucleinopatía utilizando varios anticuerpos contra la forma de alfa-sinucleína fosforilada en Ser129 o la parte C-terminal de la proteína.

La detección de la enfermedad asociada-α-sinucleína por ELISA mejorada en el cerebro de ratones transgénicos que sobreexpresan A53T humano mutado α-sinucleína

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) ...

El objetivo general del siguiente experimento es monitorear la acumulación de la alfa-sinucleína asociada a la enfermedad en un modelo de ratón transgénico de la enfermedad de Parkinson utilizando un enfoque Eliza cuantitativo. Esto se logra permitiendo primero que los ratones no inoculados envejezcan normalmente o inoculando intracerebralmente ratones con un extracto cerebral de M 83 enfermo. Después de que los ratones desarrollen la enfermedad clínica y sean sacrificados, se diseccionan las regiones cerebrales de los ratones.A continuación, se preparan homogeneizados de cada región cerebral en tampón de alta sal, y se realiza Eliza en los homogeneizados para cuantificar la alfa-sinucleína asociada a la enfermedad en cada región cerebral. Los resultados de Eliza muestran que la forma asociada a la enfermedad de la proteína alfa-sinucleína se está acumulando principalmente en las regiones cerebrales codale, incluyendo el mesencéfalo y el bulbo raquídeo, así como en las médulas espinales de los ratones. La principal ventaja de esta técnica Eliza en comparación con los métodos disponibles previamente como el western blot o la inmunohistoquímica, es que proporciona una cuantificación rápida y confiable de la alfa-sinucleína asociada a la enfermedad.En este modelo experimental, este método puede ayudar a monitorear la acumulación y la propagación de esta proteína en el sistema nervioso central de estos ratones MA tres. Esto sugiere la participación de un mecanismo similar al cerebro hasta el desarrollo de la ciencia clínica. Desarrollos adicionales de este método podrían considerarse en el futuro para el estudio de varias muestras biológicas como el líquido cefalorraquídeo o la sangre que posiblemente también contengan formas alfa alteradas que demuestren que este procedimiento será un técnico de nuestro laboratorio.Todos los procedimientos y protocolos que involucran animales se realizaron de acuerdo con la directiva EC 86 6 0 9 CEE y fueron ratificados por comm ETH, el Comité Nacional Francés. Para la Consideración de Ética y Experimentación Animal, los animales fueron alojados y cuidados en instalaciones experimentales aprobadas en A y S en Leon Young después de eutanasiar a los ratones y recuperar los cerebros y la médula espinal. Según el protocolo del texto, coloque un cerebro completo en una placa de Petri en hielo bajo una magnificación de baja potencia.Comience separando uno de los dos bulbos olfatorios colocando unas pinzas justo detrás del bulbo. Usando un movimiento descendente, despegue del cerebro, luego retire el segundo bulbo de manera similar. Ahora, mientras usa pinzas para mantener el cerebro en su lugar, inserte suavemente un segundo par de pinzas entre los cortes izquierdo y derecho y muévalos hacia adelante para separar las dos mitades.Ahora, continúe sosteniendo el cerebro en su lugar. Posicione las segundas pinzas dos milímetros detrás del corte y mantenga la presión hacia arriba para levantar el corte del hipocampo. Luego, despegue la primera parte del corte comenzando en el hipocampo y moviéndose hacia la parte frontal del cerebro.Repita con la segunda mitad. Luego, posicione las pinzas abiertas alrededor de uno de los hipocampos. Luego cierre suavemente las pinzas en la parte inferior del órgano y retírelo suavemente.Repita con el segundo hipocampo. Posicione las pinzas detrás de uno de los estriado y sepárelo suavemente del cerebro. Use las pinzas para eliminar cualquier resto del corte del estriado antes de eliminar el segundo satu para separar el cerebelo del resto del cerebro con las pinzas, deprima suavemente el contorno del cerebelo.Luego, coloque las pinzas detrás del cerebelo y mueva las pinzas hacia adelante para retirarlo usando la parte ancha de las pinzas, levante el encefalón, que está compuesto por cuatro estructuras redondas para ver claramente dónde se une el bulbo raquídeo. Luego, haga una incisión vertical en la unión antes de retirar el bulbo raquídeo, posicione las pinzas detrás del mesencéfalo y verticalmente de tamaño para separarlo por completo del cerebro restante. Para preparar el homogeneizado cerebral, agregue un volumen adecuado de tampón HS a las regiones cerebrales diseccionadas para alcanzar un porcentaje esperado de homogeneizado, como se muestra en la tabla a continuación.Usando un triturador de tejido compuesto por un tubo de vidrio de borosilicato y los pestillos de tubo A y B, vierta una región cerebral a triturar en el tubo. Y luego con el pestillo A, homogeneice el tejido 10 veces para disociarlo. Luego cambie al pestillo B y homogeneice 20 veces adicionales.Con una pipeta de transferencia, transfiera el homogeneizado a un tubo de 1.5 mililitros, repitiendo la homogeneización con las muestras cerebrales restantes. Centrifugue las muestras a 1000 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius y luego recolecte el sobrenadante y divídalo en 200 microlitros Ali Watts. Almacene a menos 80 grados Celsius para el análisis Eliza posterior para realizar Eliza en el homogeneizado cerebral.Comience usando 50 micromolar de tampón de carbonato para diluir el anticuerpo de recubrimiento anti-alfa sinucleína, policlonal de conejo o monoclonal clon 42 a 0.01 nanogramos por mililitro con 100 microlitros de la solución de recubrimiento de anticuerpos, cubra los pozos de una microplaca de 96. Pozos e incube a cuatro grados Celsius durante la noche. Agrega 300 microlitros de PBST a los pozos y usa un lavador de placas para lavar las placas cinco veces mientras trabaja a temperatura ambiente.Avanzando, agregue 200 microlitros de tampón de bloqueo PBST T 20 a cada pozo y agite las placas a 150 RPM durante una hora antes de usar PBST para lavar las placas cinco veces usando PBST 1% BSA, diluya el homogeneizado cerebral siguiendo las pautas que se enumeran aquí y agregue 100 microlitros a cada uno. Pozo, luego incube a temperatura ambiente y 150 RPM durante dos horas antes de usar PBST para lavar las placas. Cinco veces después del lavado final, agregue los anticuerpos de detección de alfa sinucleína necesarios diluidos en PBS BST y 1% BSA, como se enumera en la tabla dos del protocolo de texto, incube a temperatura ambiente y 150 RPM durante una hora antes de lavar las placas cinco veces como antes.A continuación, agregue anticuerpos conjugados de IgG HRP anti-ratón o anti-conejo diluidos a uno por 8,000 en PBST 1% BSA e incube a 150 RPM durante una hora antes de lavar las placas cinco veces. Luego, agregue 100 microlitros de solución TMB a cada pozo e incube a 150 RPM durante 15 minutos en la oscuridad. Deténga la reacción agregando 100 microlitros de un ácido clorhídrico normal por pozo.Luego, use un lector de microplacas para medir la absorbancia a 450 nanómetros para el análisis de datos. Reste el valor de densidad óptica obtenido en el pozo en blanco que contiene solo tampones y reactivos de la densidad óptica.Los valores determinados a partir de muestras cerebrales realizan análisis estadísticos de acuerdo con el protocolo de texto en este estudio, el Eliza realizado identificó específicamente la alfa sinucleína asociada a la enfermedad pser 1 29 en el homogeneizado cerebral de M 83 enfermo. Los ratones no presentes en ratones M 83 jóvenes. Anticuerpos adicionales probados como LB 5 0 9 mostraron señales fuertes en ratones enfermos pero no en ratones sanos.La sensibilidad analítica del ELIZA descrita en este video se comparó con un método de western blot previamente descrito. Aproximadamente 10 microgramos de equivalente cerebral fueron suficientes para producir una señal Eliza positiva de P o 1 29 alfa sinucleína de un ratón enfermo. Sin embargo, se necesitaron al menos 200 microgramos de muestra cerebral para detectar pser 1 29 alfa sinucleína mediante western blot en ratones M 83 enfermos y viejos. El homogeneizado cerebral del mesencéfalo, bulbo raquídeo y médula espinal mostró una inmunorreactividad marcada con ambos anticuerpos LB 5 0 9 y PSER

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Incubar con una enzima proteolítica para digerir los priones normales, dejando intactos los agregados resistentes.

Detección de agregados de proteínas priónicas mal plegadas en tejido cerebral de ratón mediante Western Blotting

Fuente: Bétemps, D., et al.,  Detección de α-sinucleína asociada a enfermedades mediante ELISA mejorado en el cerebro de ratones transgénicos que sobreexpresan la α-sinucleína mutada A53T humana. J. Vis. Exp. (2015). Este video muestra el procedimiento para detectar la proteína α-sinucleína asociada a enfermedades neurodegenerativas en tejido cerebral de ratones transgénicos utilizando ELISA. Los pasos incluyen la homogeneización de tejidos, la centrifugación y la detección ELISA de la proteína...

Detección de la proteína α-sinucleína asociada a enfermedades neurodegenerativas mediante ELISA

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Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento de alfa-sinucleína (α-syn) cada vez más insoluble/agregada a partir de tejido cerebral humano post-mortem. Mediante la utilización de tampones con una fuerza detergente creciente y técnicas de ultracentrifugación de alta velocidad, se pueden examinar las propiedades variables de la agregación α-syn en tejidos enfermos y no enfermos.

Extracción secuencial de soluble e insoluble alfa-sinucleína de cerebros parkinsonianos

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La detección de la enfermedad asociada-α-sinucleína por ELISA mejorada en el cerebro de ratones transgénicos que sobreexpresan A53T humano mutado α-sinucleína (Video) | JoVE Journal

La detección de la enfermedad asociada-α-sinucleína por ELISA mejorada en el cerebro de ratones transgénicos que sobreexpresan A53T humano mutado α-sinucleína

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