La detección de la enfermedad asociada-α-sinucleína por ELISA mejorada en el cerebro de ratones transgénicos que sobreexpresan A53T humano mutado α-sinucleína

El objetivo general del siguiente experimento es monitorear la acumulación de la alfa-sinucleína asociada a la enfermedad en un modelo de ratón transgénico de la enfermedad de Parkinson utilizando un enfoque Eliza cuantitativo. Esto se logra permitiendo primero que los ratones no inoculados envejezcan normalmente o inoculando intracerebralmente ratones con un extracto cerebral de M 83 enfermo. Después de que los ratones desarrollen la enfermedad clínica y sean sacrificados, se diseccionan las regiones cerebrales de los ratones.

A continuación, se preparan homogeneizados de cada región cerebral en tampón de alta sal, y se realiza Eliza en los homogeneizados para cuantificar la alfa-sinucleína asociada a la enfermedad en cada región cerebral. Los resultados de Eliza muestran que la forma asociada a la enfermedad de la proteína alfa-sinucleína se está acumulando principalmente en las regiones cerebrales codale, incluyendo el mesencéfalo y el bulbo raquídeo, así como en las médulas espinales de los ratones. La principal ventaja de esta técnica Eliza en comparación con los métodos disponibles previamente como el western blot o la inmunohistoquímica, es que proporciona una cuantificación rápida y confiable de la alfa-sinucleína asociada a la enfermedad.

En este modelo experimental, este método puede ayudar a monitorear la acumulación y la propagación de esta proteína en el sistema nervioso central de estos ratones MA tres. Esto sugiere la participación de un mecanismo similar al cerebro hasta el desarrollo de la ciencia clínica. Desarrollos adicionales de este método podrían considerarse en el futuro para el estudio de varias muestras biológicas como el líquido cefalorraquídeo o la sangre que posiblemente también contengan formas alfa alteradas que demuestren que este procedimiento será un técnico de nuestro laboratorio.

Todos los procedimientos y protocolos que involucran animales se realizaron de acuerdo con la directiva EC 86 6 0 9 CEE y fueron ratificados por comm ETH, el Comité Nacional Francés. Para la Consideración de Ética y Experimentación Animal, los animales fueron alojados y cuidados en instalaciones experimentales aprobadas en A y S en Leon Young después de eutanasiar a los ratones y recuperar los cerebros y la médula espinal. Según el protocolo del texto, coloque un cerebro completo en una placa de Petri en hielo bajo una magnificación de baja potencia.

Comience separando uno de los dos bulbos olfatorios colocando unas pinzas justo detrás del bulbo. Usando un movimiento descendente, despegue del cerebro, luego retire el segundo bulbo de manera similar. Ahora, mientras usa pinzas para mantener el cerebro en su lugar, inserte suavemente un segundo par de pinzas entre los cortes izquierdo y derecho y muévalos hacia adelante para separar las dos mitades.

Ahora, continúe sosteniendo el cerebro en su lugar. Posicione las segundas pinzas dos milímetros detrás del corte y mantenga la presión hacia arriba para levantar el corte del hipocampo. Luego, despegue la primera parte del corte comenzando en el hipocampo y moviéndose hacia la parte frontal del cerebro.

Repita con la segunda mitad. Luego, posicione las pinzas abiertas alrededor de uno de los hipocampos. Luego cierre suavemente las pinzas en la parte inferior del órgano y retírelo suavemente.

Repita con el segundo hipocampo. Posicione las pinzas detrás de uno de los estriado y sepárelo suavemente del cerebro. Use las pinzas para eliminar cualquier resto del corte del estriado antes de eliminar el segundo satu para separar el cerebelo del resto del cerebro con las pinzas, deprima suavemente el contorno del cerebelo.

Luego, coloque las pinzas detrás del cerebelo y mueva las pinzas hacia adelante para retirarlo usando la parte ancha de las pinzas, levante el encefalón, que está compuesto por cuatro estructuras redondas para ver claramente dónde se une el bulbo raquídeo. Luego, haga una incisión vertical en la unión antes de retirar el bulbo raquídeo, posicione las pinzas detrás del mesencéfalo y verticalmente de tamaño para separarlo por completo del cerebro restante. Para preparar el homogeneizado cerebral, agregue un volumen adecuado de tampón HS a las regiones cerebrales diseccionadas para alcanzar un porcentaje esperado de homogeneizado, como se muestra en la tabla a continuación.

Usando un triturador de tejido compuesto por un tubo de vidrio de borosilicato y los pestillos de tubo A y B, vierta una región cerebral a triturar en el tubo. Y luego con el pestillo A, homogeneice el tejido 10 veces para disociarlo. Luego cambie al pestillo B y homogeneice 20 veces adicionales.

Con una pipeta de transferencia, transfiera el homogeneizado a un tubo de 1.5 mililitros, repitiendo la homogeneización con las muestras cerebrales restantes. Centrifugue las muestras a 1000 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius y luego recolecte el sobrenadante y divídalo en 200 microlitros Ali Watts. Almacene a menos 80 grados Celsius para el análisis Eliza posterior para realizar Eliza en el homogeneizado cerebral.

Comience usando 50 micromolar de tampón de carbonato para diluir el anticuerpo de recubrimiento anti-alfa sinucleína, policlonal de conejo o monoclonal clon 42 a 0.01 nanogramos por mililitro con 100 microlitros de la solución de recubrimiento de anticuerpos, cubra los pozos de una microplaca de 96. Pozos e incube a cuatro grados Celsius durante la noche. Agrega 300 microlitros de PBST a los pozos y usa un lavador de placas para lavar las placas cinco veces mientras trabaja a temperatura ambiente.

Avanzando, agregue 200 microlitros de tampón de bloqueo PBST T 20 a cada pozo y agite las placas a 150 RPM durante una hora antes de usar PBST para lavar las placas cinco veces usando PBST 1% BSA, diluya el homogeneizado cerebral siguiendo las pautas que se enumeran aquí y agregue 100 microlitros a cada uno. Pozo, luego incube a temperatura ambiente y 150 RPM durante dos horas antes de usar PBST para lavar las placas. Cinco veces después del lavado final, agregue los anticuerpos de detección de alfa sinucleína necesarios diluidos en PBS BST y 1% BSA, como se enumera en la tabla dos del protocolo de texto, incube a temperatura ambiente y 150 RPM durante una hora antes de lavar las placas cinco veces como antes.

A continuación, agregue anticuerpos conjugados de IgG HRP anti-ratón o anti-conejo diluidos a uno por 8,000 en PBST 1% BSA e incube a 150 RPM durante una hora antes de lavar las placas cinco veces. Luego, agregue 100 microlitros de solución TMB a cada pozo e incube a 150 RPM durante 15 minutos en la oscuridad. Deténga la reacción agregando 100 microlitros de un ácido clorhídrico normal por pozo.

Luego, use un lector de microplacas para medir la absorbancia a 450 nanómetros para el análisis de datos. Reste el valor de densidad óptica obtenido en el pozo en blanco que contiene solo tampones y reactivos de la densidad óptica.

Los valores determinados a partir de muestras cerebrales realizan análisis estadísticos de acuerdo con el protocolo de texto en este estudio, el Eliza realizado identificó específicamente la alfa sinucleína asociada a la enfermedad pser 1 29 en el homogeneizado cerebral de M 83 enfermo. Los ratones no presentes en ratones M 83 jóvenes. Anticuerpos adicionales probados como LB 5 0 9 mostraron señales fuertes en ratones enfermos pero no en ratones sanos.

La sensibilidad analítica del ELIZA descrita en este video se comparó con un método de western blot previamente descrito. Aproximadamente 10 microgramos de equivalente cerebral fueron suficientes para producir una señal Eliza positiva de P o 1 29 alfa sinucleína de un ratón enfermo. Sin embargo, se necesitaron al menos 200 microgramos de muestra cerebral para detectar pser 1 29 alfa sinucleína mediante western blot en ratones M 83 enfermos y viejos. El homogeneizado cerebral del mesencéfalo, bulbo raquídeo y médula espinal mostró una inmunorreactividad marcada con ambos anticuerpos LB 5 0 9 y PSER