Análisis De Las Funciones De Los MastOcitos In Vivo Usando ' MastCell Knock-in' Ratones

El objetivo general del siguiente método es analizar las funciones de los mastocitos in vivo utilizando ratones knockin de mastocitos. Esto se logra generando primero mastocitos cultivados derivados de la médula ósea, o BMC MC, o injertándolos en ratones deficientes en mastocitos. En el segundo paso, los BMC MC se transfieren adoptivamente a varios sitios anatómicos en los ratones deficientes en mastocitos para generar ratones knockin de mastocitos.

En última instancia, el número y la distribución anatómica de los mastocitos transferidos adoptivamente se evalúan mediante citometría de flujo y análisis inmunohistoquímico para evaluar hasta qué punto las poblaciones injertadas se parecen a las encontradas en ratones de tipo salvaje. La principal ventaja de esta técnica es que permite la evaluación directa de las funciones de las poblaciones de células MA modificadas genéticamente o de tipo pared injertada in vivo. Por lo tanto, este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular MA, como hasta qué punto las células MA o sus productos pueden contribuir a las características de los modelos de ratón de procesos fisiológicos, inmunológicos o patológicos, incluidos los modelos de enfermedades humanas.

En general, las personas que aprenden este método pueden tener dificultades porque el injerto y la deficiencia de mastocitos pueden variar según el método utilizado para generar CMC BM, la raíz de la inyección, el número de MC BMC inyectados y el número de semanas de un peso después del injerto antes de realizar experimentos in vivo. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los aspectos del procedimiento de injerto son difíciles de aprender a menos que se vea exactamente cómo se realizan. Para extraer primero la médula ósea, use herramientas de disección estériles para recolectar el fémur, la tibia y el peroné de ratones de tipo salvaje sin maldecir ninguna epífisis ósea.

A medida que se disecciona cada hueso, asegúrelo con pinzas y raspe todo el tejido superfluo. Luego, coloque el hueso en PBS en hielo cuando se hayan recolectado todos los huesos, transfiéralos a una campana de cultivo de tejidos estéril, luego, uno a la vez, asegure cada hueso con pinzas y corte ambas epífisis para exponer las cavidades medulares. A continuación, utilizando jeringas de tres mililitros, equipadas con agujas de calibre 30 y un medio frío de lavado, toda la médula roja de cada hueso en una nueva placa de Petri Cuando se hayan enjuagado todos los huesos, utilice la misma jeringa para disociar los grupos de células de la médula ósea mediante una aspiración y eyección suaves repetidas.

A continuación, transfiera la suspensión de la célula a un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Llene el tubo con medio de lavado en frío y centrifugue las células resus. Suspender el pellet de celda en 10 mililitros de medio de cultivo.

A continuación, transfiera las células de la médula ósea a un matraz de cultivo de tejidos del tamaño adecuado. Después de uno o dos días de cultivo, transfiera las células que no se adhieren a un nuevo matraz junto con 10 mililitros de cultivo fresco, medio por ratón durante las semanas siguientes. Alimentar las células cada tres o cuatro días está recién demostrado.

Transferir las células de no adherencia a un nuevo matraz una vez a la semana hasta que no queden células de adherencia para el injerto intradérmico en el auricular Resus. Suspenda los BMC MC a cuatro veces 10 a las siete celdas por mililitro en DMEM frío. A continuación, aspire las células en una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 30 y coloque la jeringa en hielo.

A continuación, confirme la profundidad adecuada de la anestesia con una pizca superior de un ratón receptor con deficiencia de mastocitos de cuatro a seis semanas de edad y aplique ungüento para los ojos para inyectar las células. Use el dedo índice para exponer y estirar la cara ventral de la oreja, creando presión vertical en la cara dorsal de la oreja. A continuación, administre 1 inyección intradérmica de 25 microlitros de una multiplicada por 10 a los seis BMC MC en el centro del oído, y una segunda inyección de 25 microlitros de la misma hacia la punta del pinner.

Para el intraperitoneal, el injerto resuspende las BMC MC a una vez 10 a las siete células por mililitro en DMEM frío. A continuación, utilice una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 25 para inyectar dos veces 10 a las seis CMC BM en 200 microlitros de medio en la cavidad peritoneal de los receptores deficientes de mastocitos para el injerto intravenoso. Vuelva a suspender las CMC BM a 2,5 veces 10 a las siete celdas por mililitro en DMEM frío, y luego inyecte cinco veces 10 a las seis CMC BMC en 200 microlitros de medio a través de la vena de cola.

De cuatro a seis semanas después de un injerto intraperitoneal, utilice una jeringa de cinco mililitros equipada con una aguja de calibre 25 para inyectar cinco mililitros de PBS frío en la cavidad peritoneal del animal receptor. Masajear el abdomen durante 20 segundos para recolectar las células peritoneales. A continuación, utilice una jeringa de cinco mililitros equipada con una aguja de calibre 22 para aspirar lentamente el lavado peritoneal.

El porcentaje de mastocitos y el número total de células en el líquido de lavado peritoneal se pueden evaluar mediante citometría de flujo o histoquímica. Para evaluar los mastocitos en las ventanas mesentéricas, corte la membrana peritoneal para exponer el tracto intestinal. Coloque de cuatro a cinco ventanas mesentéricas por ratón en una corredera seguida de una fijación de una hora en la solución de ruido del automóvil.

Agregue temperatura ambiente al final de la incubación, seque al aire los portaobjetos y retire el intestino. Las ventanas mesentéricas fijas permanecerán unidas a las correderas. Finalmente, tiñir las preparaciones durante 20 minutos a temperatura ambiente con una solución de tinción de chaba que representa el análisis de citometría de flujo y la tinción con azul de odo de las CMC BM después de 15 y 45 días de cultivo En DMEM, suplementadas con IL se muestran tres CMC BM cultivadas durante 45 días y con una pureza del 95% y que contienen un alto número de gránulos citoplasmáticos.

Por lo tanto, las células de estos cultivos son adecuadas para experimentos de injerto, mientras que las células cultivadas durante 15 días no están en estas imágenes. El injerto exitoso de la oreja penique cuatro semanas después del injerto intradérmico, las ventanas mesentéricas del injerto, la cavidad peritoneal seis semanas después del injerto intraperitoneal y el pulmón 12 semanas después del injerto intravenoso se muestran como se esperaba. Los mastocitos están presentes en las muestras de tejido aisladas de ratones de tipo salvaje, mientras que no se detectan mastocitos en los animales deficientes en mastocitos en los ratones knockin

Sin embargo, los BMC MC transferidos adoptivamente aparecen en lugares similares a los observados en los animales de tipo salvaje. Al intentar este procedimiento, es importante tener en cuenta que el intervalo entre el injerto y el estudio del experimento variará según el lugar de inyección de los mastocitos. Es muy importante respetar estos intervalos para dar tiempo suficiente a que las células injertadas maduren y ocupen la ubicación final vivo.

Este enfoque ha proporcionado y sigue proporcionando información importante sobre lo que la célula de masa y su producto pueden hacer o no hacer in vivo. Tenga siempre en cuenta que trabajar con animales vivos requiere capacitación específica, revisión y aprobación adecuadas de los protocolos experimentales y un estricto cumplimiento de los más altos estándares de cuidado animal, incluido el cuidado de reducir el dolor y el estrés del animal cuando realice estos procedimientos.