Name: Análisis De Las Funciones De Los MastOcitos In Vivo Usando MastCell Knock-in Ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Aprende a analizar funciones de mastocitos in vivo mediante la generación de células madre de médula ósea y su trasplante en ratones deficientes. Este método permite evaluar fenotipo y distribución anatómica.

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N.G. ha recibido becas de la "Fondation pour la Recherche Médicale FRM" francesa y de la Fundación Philipp; R.S. cuenta con el apoyo de la Fundación Lucile Packard para la Salud infantil y el premio CTSA de los NIH/NCRR de Stanford número UL1 RR025744; P.S. cuenta con el apoyo de una beca Max Kade de la Fundación Max Kade y la Academia Austríaca de Ciencias y una beca Schroedinger del Fondo Austriaco para la Ciencia (FWF): J3399-B21; S.J.G. reconoce el apoyo de las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud U19 AI104209, NS 080062 y del Programa de Investigación de Enfermedades Relacionadas con el Tabaco de la Universidad de California; L.L.R. reconoce el apoyo de la Arthritis National Research Foundation (ANRF) y la subvención K99AI110645 de los Institutos Nacionales de Salud.

Todo el cuidado y la experimentación animal se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud y con la aprobación específica del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Stanford.
1. Generación y Caracterización De Mastocitos Cultivados Derivados De La Médula Ósea (BMCMCs).
Nota: Los BMCMCs dispensadores de aceite se deben generar de las células de la médula del mismo fondo genético que los ratones MC-deficientes receptores. BMCMCs donante Varón-derivado no es conveniente para el engraftment de ratones femeninos. Los BMCMCs donantes derivados de mujeres se injertarán con éxito en receptores masculinos y femeninos.
<ol><li>Extracción de médula ósea.<ol>
<li>Vierta solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) en 6 placas de cultivo de pozos (1 pozo por ratón) y colóquelo sobre hielo.</li>
		<li>Remoje los instrumentos de disección en etanol al 70% para la esterilización.</li>
		<li>Eutanasia ratones donantes por inhalación de dióxido de carbono (CO2)seguido de dislocación cervical, luego rocíe a los ratones con etanol al 70% en los sitios de manipulación.</li>
		<li>Use instrumentos de disección estériles para extraer los huesos del fémur, la tibia y el peroné sin cortar ninguna epífis ósea.</li>
		<li>Mientras asegura los huesos con un fórceps, raspe todo el tejido de los huesos (y deseche el peroné) usando tijeras estériles (o cuchillas de bisturí). Coloque los huesos en PBS sobre hielo hasta que se recojan todos los huesos.</li>
		<li>Lleve a cabo todos los pasos restantes en la campana de cultivo de tejido estéril. Usando instrumentos estériles, asegure los huesos con fórceps y corte ambas epífimas para exponer la cavidad medular.</li>
		<li>Usando jeringas de 3 ml y agujas de 30 G, y medio de lavado en frío (Dulbecco Modified Eagle Medium [DMEM] complementado con suero fetal de terneros al 10% [FCS, inactivado por calor], 2 mM de L-glutamina, 1% de solución antibiótico-antimicótica, 50 μM de Β-mercaptoetanol), enjuague la médula ósea roja en una placa de Petri.</li>
		<li>Use la misma jeringa para disociar los grupos de células de médula ósea enrojecidas por aspiración y eyección suaves repetidas.</li>
		<li>Piscina de médula ósea femoral y tibial de cada ratón en un tubo de centrífuga de 15 ml. Llene el tubo con un medio de lavado en frío para lavar las células de la médula ósea y la centrífuga a 400 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Cultura de BMCMCs.<ol>
<li>Retire el sobrenadante y recupere las células peletadas de la médula ósea en 10 ml de medio de cultivo (DMEM complementado con suero fetal de terneros al 10% [FCS, inactivado por calor], 2 mM de L-glutamina, 1% de solución antibiótica, 50 μM de Β-mercaptoetanol y 20% de medio acondicionado de células WEHI-3 [como fuente de IL-3; alternativamente, use IL-3 de ratón recombinante a 10 ng/ml]).</li>
		<li>Coloque las células en el matraz de cultivo de tejidos de tamaño adecuado(por ejemplo,T25 para 1 ratón, T75 para 2 ratones, etc.).</li>
		<li>1-2 días después del revestimiento de las células, transfiera las células del medio y de suspensión (dejando los restos y las células adherentes pegadas al fondo del matraz) a un nuevo matraz y agregue el medio de cultivo fresco (10 ml / ratón).</li>
		<li>Durante las semanas siguientes, las células de alimentación cada 3-4 días (añadir 10 ml de medio de cultivo por ratón). Mantener la densidad celular entre 2,5 x 105-1 x 106 células/ml. Transfiera las células no adherentes a un nuevo matraz una vez a la semana hasta que no haya células adherentes presentes en el matraz de cultivo. Pruebe la madurez de las células (ver más abajo) antes de su uso para ensayos in vitro o injertos en ratones deficientes en MC. NOTA: La diferenciación completa de BMCMCs tomará 4-6 semanas.</li>
	</ol></li>
	<li>Evaluación de la madurez de BMCMC.<ol>
<li>
Uso de citometría de flujo.
		<ol>
<li>Lave las células (5 x 104-5 x 105 células/condición) con tampón FACS helado (PBS, 0,5% FCS) en tubo inferior redondo de poliestireno de 5 ml. Centrífuga a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Sobrenadante aspirado.</li>
			<li>Diluir anticuerpos monoclonales anti-ratón CD16/32 (clon 93 o 2.4G2) 1:200 (2.5 μg/ml) en tampón FACS. Añadir 10 μl a cada pellet y resuspend por vórtice breve. Incubar 5 min sobre hielo para bloquear la unión a Fc. NOTA: Proteja las muestras de la luz directa para todos los pasos restantes.</li>
			<li>Diluir ficoeritrina (PE) conjugada anti-ratón Fc εRI α (clon MAR-1) 1:200 (1 μg/ml) y fluoresceína isotiocianato (FITC) conjugado anti-ratón KIT (CD117; clon 2B8) 1:200 (2.5 μg/ml) ("solución de tinción"), o los respectivos anticuerpos de control de isotipo etiquetados en el tampón FACS ("solución de control de isotipo").</li>
			<li>Dividir la mitad de las células bloqueadas de la etapa 1.3.1.2) en un tubo inferior redondo de poliestireno adicional y añadir 20 μl de "solución de tinción" en un tubo y 20 μl de "solución de controles de isotipo" en el otro tubo. Incubar 30 min sobre hielo.</li>
			<li>Añadir 3 ml de tampón facs helado y centrífuga a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y resuspiente el pellet en tampón FACS de 300 μl que contenga 1 μg/ml de yoduro de propidio (PI, para la identificación de células muertas). Proceder al análisis de citometría de flujo (ver Figura 2A).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Uso de tinción azul de toluidina.<ol>
<li>Lavar 1 x 105 células una vez con PBS por centrifugación a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente, luego aspirar y resuspend las células en 200 μl de PBS.</li>
			<li>Transfiera la suspensión celular a un citofunnel preparado unido a un portaobjetos de microscopio y proceda con la citocentrifugación usando una citocentrífuga (40 x g durante 5 min).</li>
			<li>Seque al aire los portaobjetos durante 10 minutos y dibuje un círculo de cera alrededor de las células usando una pluma pap. Añadir solución azul de toluidina al 0,1% para cubrir las células. Incubar durante 1 min. Lave los portaobjetos en agua corriente del grifo durante 1 minuto, luego seque al aire los portaobjetos durante 10 min.</li>
			<li>Celdas coverslip utilizando medio de montaje. Proceder al análisis de microscopio de luz (ver Figura 2B)</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. Engraftment de ratones deficientes en mastocitos con BMCMCs.
<ol><li>Injerto de oído por inyección intradérmica (i.d.). NOTA: Para la transferencia adoptiva de BMCMCs en los pabellones auriculares de ratones deficientes en MC, recomendamos realizar dos inyecciones de 1 x 106 células cada una (para un total de 2 x 106 células) por pabellón auricular. El injerto intradérmico de BMCMCs en los pabellones auriculares de ratones con deficiencia de MC ha sido utilizado por muchos investigadores en varios modelos, incluidos modelos de anafilaxia cutánea pasiva (PCA)24,27,defensa del huésped contra venenos28y reacciones de hipersensibilidad crónica (CHS)29,30.<ol>
<li>Contar y resuspend las células a 4 x 107 BMCMCs/ml (1 x 106 BMCMCs/ 25 μl) en DMEM frío. Transfiera la solución de BMCMCs en una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de 30 G. Mantenga el hielo hasta la inyección.</li>
		<li>Anestesiar ratones deficientes en MC de 4-6 semanas de edad usando isoflurano (2,5% v/v). Compruebe la profundidad de la anestesia con pellizco en los dedos de los artículos, ajuste el isoflurano si está indicado y continúe supervisando la respuesta respiratoria y del pellizco de los dedos de los dedos durante todo el procedimiento. Aplique ungüento oftálmico con una punta Q para prevenir la sequedad de los ojos.</li>
		<li>Con el dedo índice, cree presión vertical sobre la cara dorsal del pabellón auricular para exponer y estirar la cara ventral.</li>
		<li>Realice dos inyecciones de 25 μl i.d. de solución de BMCMC en dos sitios diferentes de la cara ventral del pabellón auricular, la primera inyección en el centro del oído y la segunda inyección hacia la punta del pabellón auricular. Espere 4-6 semanas después del injerto de i.d. antes de realizar experimentos in vivo. Nota: En nuestra experiencia, en ese momento el número de MCs/mm2 de dermis en la parte central del pabellón auricular generalmente es similar al de la ubicación correspondiente en ratones de tipo salvaje, mientras que el número de MCs/mm2 en la periferia de los pabellones auriculares es típicamente sustancialmente menor que los de los ratones de tipo salvaje correspondientes27,28. Esto debe tenerse en cuenta al diseñar experimentos con tales ratones con mc-engrafted(e.g.,los agentes con efectos posibles sobre la función de la bujía métrica se deben inyectar en la parte central de los pabellones auriculares, y el análisis de los efectos de tales tratamientos debe también centrarse en esa área).</li>
	</ol></li>
	<li>Engraftment peritoneal de la cavidad por la inyección intraperitoneal (i.p.). NOTA: La transferencia adoptiva de BMCMCs en la cavidad peritoneal de ratones MC-deficientes requerirá una inyección de 2 x 106 células por ratón. Tales inyecciones de i.p. de BMCMCs en ratones con deficiencia de MC han sido utilizadas por muchos grupos para estudiar el papel de los MCs peritoneales en varios modelos, incluidos los modelos de defensa del huésped contra los venenos31 o la sepsis bacteriana32,33.<ol>
<li>Contar el número adecuado de células y resuspend a 1 x 107 BMCMCs/ml (2 x 106 BMCMCs/ 200 μl) en DMEM frío. Transfiera la solución de BMCMCs en una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de 25 G. Mantenga el hielo hasta la inyección.</li>
		<li>Realizar 1 inyección de 200 μl de solución de BMCMCs en la cavidad peritoneal de ratones deficientes en MC de 4-6 semanas de edad. Espere 4-6 semanas después del injerto de i.p. antes de realizar experimentos in vivo.</li>
	</ol></li>
	<li>Engraftment por la inyección intravenosa (i.v.). NOTA: La transferencia adoptiva de BMCMCs por inyección de i.v. en ratones con deficiencia de MC requerirá una inyección de 5 x 106 células por ratón. Las inyecciones intravenosas (i.v.) de BMCMCs en ratones con deficiencia de MC han sido utilizadas por muchos grupos para estudiar el papel de los MCs en varios modelos de enfermedades, incluidos los modelos de infección vesical34,asma35,fibrosis pulmonar36y artritis mediada por anticuerpos37.<ol>
<li>Contar el número adecuado de células y resuspend a 2,5 x 107 BMCMCs/ml (5 x 106 BMCMCs/200 μl) en DMEM frío. Transfiera la solución de BMCMCs en una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de 30 G. Mantenga el hielo hasta la inyección.</li>
		<li>Anestesiar ratones deficientes en MC de 4-6 semanas de edad usando isoflurano (2,5% v/v). Compruebe la profundidad de la anestesia con pellizco en los dedos de los artículos, ajuste el isoflurano si está indicado y continúe supervisando la respuesta respiratoria y del pellizco de los dedos de los dedos durante todo el procedimiento. Aplique ungüento oftálmico con una punta Q para prevenir la sequedad de los ojos.</li>
		<li>Realice una inyección de 200 μl de solución de BMCMC en la vena de la cola (o, alternativamente, la vena retro-orbital) de un ratón deficiente en MC. Espere 12 semanas después del injerto de i.v. antes de realizar experimentos in vivo.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Análisis de ratones deficientes en mastocitos en injertados.
<ol><li>Análisis del engraftment del oído.<ol>
<li>Al final del experimento, eutanasia ratones por inhalación de CO2 seguido de dislocación cervical.</li>
		<li>Aísle los pabellones auriculares y fije en formalina tamponada al 10% (vol/vol) durante la noche a 4 °C. Incruste pinnas de oreja fijas en parafina, corte secciones de 4 μm de pinnas de oreja y monte en diapositivas de vidrio.</li>
		<li>Manche los portaobjetos con una solución azul de toluidina al 0,1% durante 1 min a temperatura ambiente. Lave los portaobjetos en agua del grifo durante 1 minuto, luego los portaobjetos secos al aire durante 10 minutos a temperatura ambiente.</li>
		<li>Portaobjetos de cubrebocas utilizando el medio de montaje, luego cuente el número de MCs engrafted por secciones de pines usando un microscopio de luz. Evalúe la eficacia del engraftment comparando el porcentaje y la distribución de MCs en la piel del oído de ratones engrafted contra ratones del tipo salvaje.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis del engraftment de la cavidad peritoneal.<ol>
<li>Evaluación del número de mastocitos en la cavidad peritoneal.<ol>
<li>Al final del experimento, eutanasia ratones por inhalación de CO2 seguido de dislocación cervical. Retire cuidadosamente la piel ventral de los ratones sin romper la cavidad peritoneal.</li>
			<li>Inyecte 5 ml de PBS frío o a temperatura ambiente en la cavidad peritoneal usando una jeringa de 5 ml equipada con una aguja de 25 G. Utilice PBS frío para reducir el riesgo de activación de las células peritoneales (esto es muy importante al evaluar la degranulación peritoneal de mc o los niveles de algunos productos derivados de MC en el líquido de lavado peritoneal). Realizar un masaje del abdomen durante 20 segundos para cosechar las células peritoneales.</li>
			<li>Aspirar lentamente el lavado peritoneal usando una jeringa de 5 ml equipada con una aguja de 22 G. Registre el volumen de lavado aspirado (espere recuperar hasta el 80% del volumen inyectado).</li>
			<li>Transferir líquido de lavado peritoneal a un tubo inferior redondo de poliestireno de 5 ml y centrífuga a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Sobrenadante aspirado. Recuperar el pellet en PBS frío de 400 μl.</li>
			<li>Contar el número total de células peritoneales utilizando una cámara de hemocitómetro. Utilice la mitad de la suspensión celular para un análisis de citometría de flujo (como se describe en el paso 1.3.1), para evaluar el porcentaje y la expresión de marcadores de MCs engrafted en la cavidad peritoneal. Multiplique el número total de células peritoneales por el porcentaje de MCs para obtener el número absoluto de MCs peritoneales.</li>
			<li>Realizar una citocentrifugación con las células restantes como se describe en el paso 1.3.2.2. Seque al aire los portaobjetos durante 10 minutos a temperatura ambiente y dibuje un círculo de cera alrededor de las células usando una pluma pap.</li>
			<li>Cubra las células con solución de tinción de May-Grünwald sin diluir durante 5 min, seguida de lavado en PBS durante 5 min, ambos a temperatura ambiente. Cubrir las células con tinción de Giemsa diluida 1:20 con agua desionizada e incubar 20 min a temperatura ambiente. Lave los portaobjetos 2 veces en agua del grifo durante 1 minuto, luego los portaobjetos secos al aire.</li>
			<li>Cubre las células que utilizan el medio de montaje y calcula el porcentaje de MCs injertados utilizando un microscopio de luz (contando al menos 400 células en total). Evalúe la eficiencia del injerto comparando el porcentaje de MCs en el lavado peritoneal de ratones injertados versus ratones de tipo salvaje.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Evaluación de mastocitos en las ventanas mesentéricas.<ol>
<li>Tras el lavado peritoneal descrito en el paso 3.2.1, se abre la membrana peritoneal para exponer el tracto intestinal de los ratones. Organice de 4 a 5 ventanas mesentéricas por mouse en una diapositiva.</li>
			<li>Fije las guías durante 1 hora en solución de Carnoy (3:2:1 vol/vol/vol de etanol, cloroformo y ácido acético glacial) a temperatura ambiente. Seque al aire los portaobjetos y retire el intestino (las ventanas mesentéricas fijas permanecerán unidas a los portaobjetos).</li>
			<li>Manche las preparaciones durante 20 minutos a temperatura ambiente con solución de tinción de Csaba (Azul alciano / Safranin O).<ol>
<li>Para hacer 500 ml de tinción de Csaba, preparar 500 ml de tampón de acetato mezclando 100 ml de solución de acetato de sodio 1 M con 120 ml de HCl de 1 M. Encuadernar hasta 500 ml con agua desionizada y ajustar el pH a 1,42. A continuación, disuelva 90 mg de Safranin [identifica 'MCs maduros' en rojo], 1,8 g de azul alciano [identifica 'MCs inmaduros' en azul] y 2,4 g de sulfato férrico de amonio NH4Fe (SO4)2 en 500 ml de tampón de acetato.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Cubreboganes con medio de montaje, luego cuente el número de MCs engrafted por ventana mesentérica usando un microscopio de luz. Evalúe la eficiencia del injerto comparando el porcentaje y la distribución de los MCs en las ventanas mesentéricas de ratones engrafted contra ratones de tipo salvaje.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>I.v. análisis del engraftment.<ol>
<li>Al final del experimento, eutanasiar ratones por inhalación de CO2 seguida de dislocación cervical, y cosechar tejido de interés (porejemplo, pulmón, piel o bazo) y fijar durante la noche en 10% (vol / vol) formol tamponado a 4 ° C.</li>
		<li>Incruste tejidos fijos en la parafina, corte secciones de 4 μm y monte en portaobjetos de vidrio. Manche los portaobjetos con una solución azul de toluidina al 0,1% durante 1 min a temperatura ambiente. Lave los portaobjetos en agua del grifo durante 1 minuto, luego seque al aire los portaobjetos durante 10 min.</li>
		<li>Cubreboganes con medio de montaje y evaluar el número y la distribución de los MCs injertados por secciones de tejido utilizando un microscopio de luz.</li>
	</ol></li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Casi 30 años después de su descripción inicial38, el enfoque'mast cell knock-in'sigue proporcionando información valiosa sobre lo que los MCs pueden o no pueden hacer in vivo. Las funciones de MCs eran de largo probablemente limitadas a su papel en alergia. Los datos generados utilizando el enfoque'mast cell knock-in'han cambiado esta visión, al proporcionar evidencia de que los MCs pueden, entre otras funciones, desempeñar papeles críticos en la defensa del huésped contra ciertos pa...

Los mastocitos (MCs) son células hematopoyéticas que surgen de progenitores pluripotentes de la médula ósea1-3. Después de la egressión de la médula ósea, los progenitores de las MCs migran a varios tejidos donde se convierten en MCs maduros bajo la influencia de factores de crecimiento locales1-3. Los MCs residentes en tejidos están estratégicamente ubicados en interfaces huésped-ambiente, como la piel, las vías respiratorias y el tracto gastrointestinal, donde se comportan como una primera línea de defensa contra los insultos externos3-6. Los MCs se subclasifiquen a menudo basados en sus características fenotípicas de la "línea de fondo" y sus localizaciones anatómicas. En ratones, se han descrito dos tipos de MCs: "tipo tejido conectivo" MCs (CTMCs) y MCs de la mucosa (MMCs)1-3,7,8. Los CTMCs a menudo se encuentran alrededor de las vénulas y cerca de las fibras nerviosas, y residen en cavidades serosales, mientras que los MMCs ocupan ubicaciones intraepiteliales en el intestino y la mucosa respiratoria1-3.
Se han aplicado numerosas metodologías para estudiar las funciones biológicas de las MCs9-13. Muchos grupos se han centrado en enfoques in vitro utilizando líneas celulares (como las líneas de MC humanas HMC114 o LAD215,16),MCs derivados in vitro (como MCs derivados de sangre periférica humana17,o MCs cultivados derivados de médula ósea de ratón [BMCMCs]18,MCs cultivados derivados de la piel fetal [FSCMCs]19 y MCs derivados de células peritoneales [PCMCs]20)o MCs aislados ex vivo de diferentes sitios anatómicos. Todos estos modelos son ampliamente utilizados para estudiar los detalles moleculares de la biología mc, tales como vías de señalización implicadas en la activación mc. Sin embargo, un aspecto importante de la biología de los MCs es que sus características fenotípicas y funcionales (porejemplo,el contenido de proteasa de gránulos citoplasmáticos o la respuesta a diferentes estímulos) pueden ser moduladas por la ubicación anatómica y el microambiente2,7. Dado que la mezcla exacta de tales factores que se encuentran in vivo puede ser difícil de reproducir in vitro,favorecemos el uso de enfoques in vivo para obtener información sobre las funciones de los MCs9.
Existen varias cepas de ratón con deficiencia genética de MC, como los ampliamente utilizados WBB6F1-Kit W/W-v o C57BL/6-Kit W-sh/W-sh ratones. Estos ratones carecen de expresión y/o actividad de KIT (CD117), el receptor del principal factor de crecimiento MC factor de células madre (SCF)21,22. Como resultado, estos ratones tienen una profunda deficiencia de MC, pero también tienen anomalías fenotípicas adicionales relacionadas con sus mutacionesc-kit (en los ratones WBB6F1-Kit W/W-v) o con los efectos de la gran inversión cromosómica que resulta en una reducción de la expresión de c-kit (en los ratones C57BL/6-Kit W-sh/W-sh) 9,10,12,23. Más recientemente, se han reportado varias cepas de ratones con deficiencia de MC constitutiva independiente dec-kit24-26. Todos estos ratones y algunos nuevos tipos adicionales de ratones inducibles deficientes en MC han sido revisados recientemente en detalle9,10,13.
Aquí, se describen los métodos para la generación de ratón derivado de la médula ósea MCs cultivados (BMCMCs), su transferencia adoptiva en ratones deficientes en MC, y el análisis de los números y la distribución de MCs transferidos adoptivamente en diferentes sitios anatómicos. Este método llamado "knock-in de mastocitos" se puede utilizar para evaluar las funciones de los MC y los productos derivados de MC in vivo. Discutimos las ventajas y las limitaciones de este método, a la luz de los acercamientos alternativos que se han desarrollado en los últimos años.

<table><tbody><tr><td>Solución Antibiótica-Antimicótica al 1%</td><td>Corning cellgro</td><td>30-004-Cl</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Jeringa</td><td>Falcon</td><td>309656</td><td></td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm</td><td>Plato Corning cellgro</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Poliestireno Tubo de Fondo Redondo</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Acético Glacial</td><td>Fisher Scientific</td><td>A35-500</td><td></td></tr><tr><td>Azul Alcián 8GX</td><td>Rowley Biochemical Danver</td><td>33864-99-2</td><td></td></tr><tr><td>Allegra 6R Centrífuga</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-ratón CD16/32 (clon 93) Purificado</td><td>eBioscience</td><td>14-0161-81</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>BD 1 ml TB Jeringa</td><td>BD Jeringa BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>BD 22 G x 1 (0,7 mm x 25 mm) Agujas</td><td>BD Aguja Precision Glide</td><td>205155</td><td></td></tr><tr><td>BD 25 G 5/8 Agujas</td><td>BD Jeringa</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>BD 30 G x 1/2 Agujas</td><td>BD Precision Glide</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Azul MAX Jr, 15 ml Polipropileno Tubo cónico</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Fisher Scientific</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60 Medio de montaje</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>8310-4</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin3</td><td>Shandon</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>DakoPluma de citomación</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td><td>Corning cellgro</td><td>15-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E 7023-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino Inactivado por Calor Sigma</td><td>Aldrich</td><td>F4135-500ml</td><td></td></tr><tr><td>FITC IgG2b K Conjugado Control de Isotipo de Rata</td><td>eBioscience</td><td>14-4031-82</td><td></td></tr><tr><td>Isotiocianato de fluoresceína (FITC) KIT anti-ratón conjugado (CD117; clon 2B8)</td><td>eBioscience</td><td>11-1171-82</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79-500</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa Tinción Sigma Modificada</td><td>Aldrich</td><td>GS-1L</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Henry Schein Salud Animal</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>May-Grunwald Tinción</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MG-1L</td><td></td></tr><tr><td>Multipocillo 6 placas de pocillos</td><td>Falcon</td><td>35 3046</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Olympus BX60</td><td>Olympus</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Plus Medio de inclusión de tejidos</td><td>Fisher Brand</td><td>23-021-400</td><td></td></tr><tr><td>PE Conjugado IgG Hámster Armenio Control de isotipos</td><td>eBioscience</td><td>12-4888-81</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x</td><td>Corning cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Ficoeritrina (PE) Conjugada Anti-ratón FceRIa (clon MAR-1)</td><td>eBioscience</td><td>12-5898-82</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tinción de yoduro de propidio</td><td>eBioscience</td><td>00-6990-50</td><td></td></tr><tr><td>Ratón recombinante IL-3</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>Certificado Safranin-o</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8884</td><td></td></tr><tr><td>Matraces de cultivo de tejidos T25 25 cm2</td><td>Beckton Dickinson</td><td>353109</td><td></td></tr><tr><td>Matraces de cultivo de tejidos T75 75 cm2</td><td>Beckton Dickinson</td><td>353110</td><td></td></tr><tr><td>Azul de toluidina 1% acuoso</td><td>LabChem-Inc</td><td>LC26165-2</td><td></td></tr><tr><td>SCF de ratón recombinante</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis de las funciones de los mastocitos in vivo usando ' mastcell knock-in' ratones

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Los mastocitos (MCs) son células hematopoyéticas que residen en diversos tejidos, y son especialmente abundantes en sitios expuestos al medio externo, como la piel, las vías respiratorias y el tracto gastrointestinal. Mejor conocidos por su papel perjudicial en las reacciones alérgicas dependientes de IgE, los MCs también han surgido como actores importantes en la defensa del huésped contra el veneno y las bacterias y parásitos invasores. El fenotipo y la función del mc pueden ser influenciados por los factores microambientales que pueden diferir según la localización anatómica y/o basado en el tipo o la etapa del desarrollo de inmunorespuestas. Por esta razón, nosotros y otros hemos favorecido los acercamientos in vivo sobre métodos ines vitro para ganar la penetración en funciones de la bujía métrica. Aquí, se describen los métodos para la generación de ratón derivado de la médula ósea cultivada MCs (BMCMCs), su transferencia adoptiva en ratones genéticamente deficientes en MC, y el análisis de los números y la distribución de MCs transferidos adoptivamente en diferentes sitios anatómicos. Este método, denominado el enfoque'mast cell knock-in', se ha utilizado ampliamente en los últimos 30 años para evaluar las funciones de los MC y los productos derivados de MC in vivo. Discutimos las ventajas y las limitaciones de este método, a la luz de los acercamientos alternativos que se han desarrollado en los últimos años.

En la Figura 1se muestra una visión general del enfoque de'knock-in de mastocitos'e incluye la generación de BMCMCs, el número de células que deben injertrse i.p., i.d. o i.v. en ratones deficientes en MC (el número puede variar si se indica en función del diseño experimental) y el intervalo entre el injerto y el experimento dependiendo del sitio de inyección (este intervalo también puede variar, si se indica; por ejemplo,el contenido de mediadores almacenados en los gránulos citoplasmá...

Describimos un método para la generación de células de mástil derivadas in vitro, su engraftment en ratones célula-deficientes del mástil, y el análisis del fenotipo, de los números y de la distribución de las células de mástil engrafted en diversos sitios anatómicos. Este protocolo se puede utilizar para evaluar las funciones de los mastocitos in vivo.

Análisis De Las Funciones De Los MastOcitos In Vivo Usando ' MastCell Knock-in' Ratones

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

El objetivo general del siguiente método es analizar las funciones de los mastocitos in vivo utilizando ratones knockin de mastocitos. Esto se logra primero generando mastocitos cultivados derivados de médula ósea, o MC-BMO, para su injerto en ratones deficientes en mastocitos. En el segundo paso, los MC-BMO se transfieren adoptivamente a diversos sitios anatómicos en ratones deficientes en mastocitos para generar ratones knockin de mastocitos.Finalmente, los números y la distribución anatómica de los mastocitos transferidos adoptivamente se evalúan mediante citometría de flujo y análisis inmunohistoquímico para determinar en qué medida las poblaciones injertadas se asemejan a las encontradas en ratones de tipo salvaje. La principal ventaja de esta técnica es que permite la evaluación directa de las funciones de las poblaciones de mastocitos de tipo salvaje o modificadas genéticamente in vivo. Por lo tanto, este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de los mastocitos, como en qué medida los mastocitos o sus productos pueden contribuir a características de modelos murinos de procesos fisiológicos, inmunológicos o patológicos, incluyendo modelos d

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

A continuación se describe una técnica en la que lipopolisacárido se inyecta en la glándula mamaria lactante ratón mediante la boquilla para simular la mastitis, una condición comúnmente causada por una infección bacteriana. Resultados lipopolisacárido de inyección en el aumento del factor nuclear kappa B (NF-kB) de señalización, visualizado a través de imágenes bioluminiscentes de un ratón reportero luciferasa NF-kB.

Inyección intraductal de LPS como un modelo de ratón de Mastitis: Señalización Visualizada a través de un transgénico NF-kB Reportero

Este video muestra un ensayo colorimétrico para determinar la actividad de degranulación de los mastocitos. La enzima liberada por los mastocitos hidroliza el sustrato y produce un producto coloreado. La actividad de degranulación de los mastocitos se midió como el porcentaje de liberación de enzimas fuera de la célula normalizado con el contenido total de enzimas en la célula.

Ensayo de degranulación de mastocitos para estudiar el efecto de un producto químico objetivo

Este video muestra un método de lavado peritoneal para aislar mastocitos maduros de tipo tejido conectivo de la cavidad peritoneal de ratones adultos. Al aislar una mezcla de células inmunitarias primarias de la cavidad peritoneal, se realiza la proliferación selectiva de mastocitos en condiciones de cultivo adecuadas.

Una técnica para aislar mastocitos primarios de una cavidad peritoneal murina

Las respuestas alérgicas, caracterizados por la activación de los mastocitos y basófilos, están impulsados ​​por la reticulación de IgE y liberación de mediadores proinflamatorios. Una evaluación cuantitativa de las respuestas alérgicas se puede lograr mediante el uso de colorante azul de Evans para monitorear los cambios en la permeabilidad vascular después de la provocación con alergeno.

Medición anafilaxia local en ratones

El objetivo de este protocolo era desarrollar un método que permita a los análisis de genómica funcional de la secreción de mastocitos. El protocolo se basa en la evaluación cuantitativa de la liberación de un gen indicador fluorescente cotrasfected con el gen de interés y análisis en tiempo real de la morfología de los gránulos de secreción.

Investigando mastocitos secretora gránulos; de Biosíntesis de la exocitosis

Este protocolo describe la digestión enzimática de la piel de ratón en un medio rico en nutrientes seguida de una separación en gradiente para aislar leucocitos.  Las células así derivadas se pueden utilizar para diversas aplicaciones posteriores. Se trata de una alternativa eficaz, económica y mejorada a las máquinas de disociación de tejidos y a los protocolos más estrictos de digestión de tejidos basados en tripsina y dispasas.

Aislamiento de leucocitos infiltrantes de ratón Piel Usando enzimática Digest y Separación de degradado

Mientras que los macrófagos infiltrados son continuamente reclutados en tejidos adultos a partir de precursores circulantes, los macrófagos residentes sembran su tejido durante el desarrollo, donde se mantienen sin más aportación de los progenitores. Recientemente se identificaron los progenitores de macrófagos residentes. Aquí, presentamos métodos para el mapeo de destino genético de los progenitores de macrófagos residentes.

Identificación de progenitores eritromioideos y su progenie en el embrión de ratón por citometría de flujo

Protocolos para el estudio de la aorta murina embrionaria y perinatal mediante análisis clonal de en vivo y asignación de destino, explantes aórticos y aislada del músculo liso células se detallan aquí. Estos diversos enfoques facilitan la investigación de la morfogénesis de la aorta embrionaria y perinatal en el desarrollo normal y la patogénesis en la enfermedad.

Utilizan en Vivo y tejido y célula explante enfoques para el estudio de la morfogénesis y la patogenesia de la Aorta embrionaria y Perinatal

Aquí, presentamos un protocolo para aislar y cultivar células de mástil peritoneales murinas. También describimos dos protocolos para su caracterización funcional: una proyección de imagen fluorescente de la concentración de Ca libre2 + intracelular y una prueba de degranulación basado en la cuantificación colorimétrica de la β-hexosaminidasa lanzado.

Aislamiento de mastocitos de peritoneo derivado y su caracterización funcional con Ca2 +-proyección de imagen y pruebas de degranulación

Este artículo describe el procedimiento para la preparación de una versión marcado fluorescentemente de bacteriófago lambda, la infección...

A raíz de la celda de destino en<em&gt; E. coli</em&gt; Después de la infección por fagos Lambda

Aprende a analizar funciones de mastocitos in vivo mediante la generación de células madre de médula ósea y su trasplante en ratones deficientes. Este método permite evaluar fenotipo y distribución anatómica.

Análisis De Las Funciones De Los MastOcitos In Vivo Usando ' MastCell Knock-in' Ratones

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