Name: Evaluación de la migración de células endoteliales después de la exposición a sustancias químicas tóxicas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Aprenda a evaluar la migración de células endoteliales expuestas a sustancias químicas tóxicas mediante ensayos de cámara de Boyden modificada y de cicatrización. Este método permite analizar la dinámica celular y el potencial de membrana mitocondrial para comprender los mecanismos de toxicidad.

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Este trabajo fue financiado por el Ministerio de Defensa de Alemania (Subvención No. M-SAB1-6-A009).

El siguiente protocolo describe técnicas para la investigación de los principios de la migración celular endotelial. El cultivo apropiado de las células endoteliales vasculares requiere pre-revestimiento de frascos de cultivo celular con gelatina para asegurar la proliferación y el mantenimiento de un fenotipo endotelial. 1. Pre-recubrimiento de frascos de cultivo celular <ol><li> Disolver la gelatina en PBS 0,1 M a una concentración final de 0,1%. </li><li> Autoclave la solución con parámetros para autoclave líquido (para más detalles ver las instrucciones del autoclave específico). </li><li> Añadir un volumen suficiente de la solución de gelatina en autoclave a un matraz de cultivo celular estéril (por ejemplo, al menos 5 ml para un matraz de cultivo celular T25). </li><li> Transferencia de los matraces en una incubadora (37 ° C, 5% de CO 2 no es necesaria, pero no interfiere) durante al menos 30 min. </li><li> Retire la solución de gelatina restante. Utilice los frascos previamente recubierto posteriormente (véase el cultivo celular) o srasgó en condiciones estériles hasta su uso. </li></ol> 2. El cultivo celular de las células endoteliales primeros Nota: células madre embrionarias derivadas de células endoteliales primeros (CEE) se obtuvieron a partir de cuerpos embrioides murinos diferenciados por clasificación de células magnético activado de la fracción de células PECAM-1 positivo como se describe anteriormente 10,11. <ol><li> Cultura CEE sobre placas de cultivo celular recubiertas con gelatina en DMEM suplementado con 15% de FCS, 50 U / ml de penicilina, 50 U / ml de estreptomicina, 200 mM L-glutamina, 100 mM ß-mercaptoetanol y 1% de aminoácidos no esenciales. Manipular células en condiciones estériles. Cultivar las células con 5% de CO 2 a 37 ° C y 95% de humedad hasta sub-confluencia (máx. 80%). </li><li> En sub-confluencia, dividir las células a una proporción de 1: 5. Nota: El desprendimiento de las células endoteliales es un paso crítico. <ol><li> Recoger las células con RT accutase. Retire los medios de comunicación, enjuagar con PBS y añadir 1 ml de accutase por 25 cm <sup&gt; 2. </li><li> Incubar el matraz a temperatura ambiente durante 2-10 min hasta que las células se han desprendido. Dispersar las células y transferirlos a la aplicación deseada. Nota: Un neutralización química de la accutase no se requiere, ya que tiene lugar cuando las células sembradas se almacenan en la incubadora a 37 ° C. Sin embargo, accutase actividad también se puede disminuir mediante la adición de DMEM que contiene FCS. </li></ol></li></ol> 3. Cámara Boyden Nota: Los ensayos de cámara de Boyden se llevan a cabo mediante el uso de sistemas de inserción de tereftalato de polietileno de luz opaca con 8 micras de tamaño de poro. <ol><li> Pre-coat los insertos de filtro (que caben dentro de pocillos de cultivo celular, creando así una cámara de Boyden) mediante la adición de 500 l de 0,1% de gelatina disueltos en 0,1 M PBS durante al menos 30 min. </li><li> Si las células son de estar expuestos a productos químicos tóxicos, exponer de acuerdo con el diseño experimental específico antes de la recolección de células. Nota: Las células fueron expuestas a 12,5 g clorambucil / ml DMEMdurante 24 horas. Con respecto al diseño experimental específica, las instrucciones pueden variar. </li><li> Cosecha CEE y determinar el número de células mediante el uso de una cámara de celular contando. Nota: Los dispositivos automáticos de conteo pueden utilizarse, pero deben usarse con precaución: el recuento de células manual es más precisa y es muy recomendable. </li><li> Añadir 500 l medio de cultivo celular en el compartimiento de la cámara inferior de la cámara de Boyden. </li><li> Agregar exactamente 10 4 500 CEE en medio de cultivo celular l por elemento filtrante en el compartimiento de la cámara superior. Eliminar las burbujas. </li><li> Incubar los insertos de filtro en la incubadora durante exactamente 8 horas. </li><li> Enjuagar con PBS una vez y reemplazar el medio con 0,5 ml 4% de paraformaldehído en ambos compartimientos durante 25 min para la fijación celular. Lavar el filtro ampliamente pero por lo menos 3 veces con 0,1 M PBS. </li><li> Extirpar las membranas con un bisturí. </li><li> Monte la membrana entre dos cubreobjetos de vidrio con medio de montaje que contiene DAPI para stainin nuclearg. Preste atención a la orientación. Asegúrese de que sólo las células que han migrado hacia el lateral del compartimento inferior de la membrana se cuentan. </li><li> Recuento de células que han migrado hacia el lateral del compartimento inferior de la membrana con un microscopio de fluorescencia a una ampliación de 400X. No confunda poros de la membrana con células migraron (Figura 1A, 1B). Investigar un número razonable de réplicas biológicas (al menos 3 repeticiones biológica por condición). </li></ol> 4. Curación de Heridas Ensayo <ol><li> Dependiendo del equipo disponible, elegir con cuidado las placas de cultivo celular o placas: Cuando se utiliza la microscopía DIC, evitar la superficie de plástico placas de cultivo basados ​​o placas bien pero utilizar dispositivos basados ​​vidrio en su lugar. Nota: Si se utiliza la microscopía de contraste de fase, basada en platos de plástico también se pueden utilizar. </li><li> Cultivar CEE en un dispositivo de cultivo celular adecuado (por ejemplo, 4 cm con fondo de cristal placa de Petri adecuado para imágenes de células vivas) Hasta 80% de confluencia. Importante: no cultivar las células para completar confluencia. </li><li> Raspe las monocapas con 10 puntas de pipeta estériles l. Empuje la punta suavemente sin demasiada presión sobre la superficie del plato y moverlo en línea recta suavemente de un lado a other.Wash las células dos veces con 0,1 M PBS para eliminar las células desprendidas. </li><li> Añadir un volumen suficiente de medio a la placa de cultivo. En su caso, añadir compuestos que deben ser investigados. Nota: 1,5 ml de medio que contiene 15 ng / ml alfa se añadió ácido linolénico. </li><li> Monte la placa de cultivo con un microscopio capaz de imágenes de células vivas. Asegúrese de 5% de CO2, 37 ° C y una atmósfera húmeda. Nota: La humidificación es especialmente importante para evitar la evaporación medio. </li><li> Adquirir imágenes con lapso de tiempo de más de 24 horas a intervalos de 10 min. Plan de archivos de gran tamaño. Nota: Una resolución de 512 x 512 píxeles suele ser suficiente; Sin embargo, se recomienda el uso de imágenes de al menos 1024 x 1,024. </li><li> Mida la anchura del hueco en t = 0 horas y en t = 24 h utilizando la herramienta de longitud del software suministrado con el microscopio o el uso de software de código abierto (por ejemplo, ImageJ). Nota: En general, el software específico de adquisición y análisis de imagen es proporcionada por el fabricante. Por lo tanto, para los detalles técnicos relacionados con el uso del software, consulte el manual. </li></ol> Seguimiento 5. celular <ol><li> Dependiendo del equipo disponible, elegir con cuidado las placas de cultivo celular o placas: Cuando se utiliza la microscopía DIC, evitar la superficie de plástico placas de cultivo basados ​​o placas bien pero utilizar dispositivos basados ​​vidrio en su lugar. Nota: Si se utiliza la microscopía de contraste de fase, basada en platos de plástico también se pueden utilizar. </li><li> Semilla de 5 x 10 4 CEE en DMEM complementado en un dispositivo de cultivo celular adecuado (por ejemplo, placa de 24 pocillos múltiples) y cultivar las células con 5% de CO 2 a 37 ° C y 95% de humedad durante 1-2 días. </li><li> Cuando las células han crecido hasta un 80% De confluencia, retire los medios y la cultura de las células con los nuevos medios de comunicación en la presencia de las sustancias de ensayo respectivos (por ejemplo, 12,5 g clorambucil / ml de DMEM). Siempre incluir células de control (tratados con el disolvente, por ejemplo, etanol) a 37 ° C durante un cierto período de tiempo (24 hr, dependiendo del sistema de ensayo individual). </li><li> Montar la placa de cultivo bajo un microscopio capaz de formación de imágenes en vivo de células (37 ° C, 5% de CO 2 y 95% de humedad). Adquirir imágenes con lapso de tiempo de más de 24 horas a intervalos predefinidos. Adquirir imágenes a intervalos de 10 min. </li><li> Realizar seguimiento manual del CEE, por el uso del plugin de ImageJ MTrackJ. Elija 10 células al azar desde el campo de visión y un seguimiento de sus movimientos mediante la adición de un punto de datos por cada punto en el tiempo con el &quot;Añadir&quot; mando de MTrackJ. </li></ol> Nota: MTrackJ está disponible de forma gratuita en y ImageJ es availab [Meijering, Mtrackj &quot;http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/&quot;.]le a [Rasband, ImageJ. &quot;http://rsbweb.nih.gov/ij/&quot;]. Un manual detallado sobre el plugin MTrackJ está disponible en &quot;http://www.imagescience.org&quot;. 6. Imágenes de células vivas / Evaluación de la membrana mitocondrial Potencial <ol><li> Cultivar CEE en un dispositivo de cultivo celular adecuado (por ejemplo, 4 cm de vidrio placa de Petri fondo adecuado para imágenes de células vivas) hasta una confluencia del 80%. Importante: No cultivar las células para completar confluencia. </li><li> En su caso, exponer las células a los productos químicos. Nota: Las células fueron expuestas a 12,5 mg / ml clorambucil durante 24 horas. Con respecto al diseño experimental específica, las instrucciones pueden variar. </li><li> Preparar una solución madre 10 mM de tetrametilrodamina (TMRM) en DMSO. Proteger de la luz. Nota: La solución madre se puede almacenar a -20 ° C. </li><li> Diluir la solución madre en medio de cultivo celular a una solución de trabajo con una concentración de 10 micras (1: 1000 dilución). Proteger de la luzy utilizar tan pronto como sea posible. Nota: La solución de trabajo se puede mantener a temperatura ambiente durante algún tiempo (&gt; 1 hr), sin embargo, es muy recomendable preparación de una solución de trabajo fresco. </li><li> Añadir 2 l de la solución de trabajo de 1 ml de medio (solución) de carga fresca de cultivo celular. </li><li> Cargar las células mediante la sustitución del medio de cultivo celular con la solución de carga. Incubar durante 15 minutos a 37 ° C, 5% de CO 2 y el ambiente humidificado (incubadora). Precaución: Casi todos los indicadores de fluorescencia son exportados por las células a través del tiempo de vida; por lo tanto, evitar la carga prolongada o retardada análisis. </li><li> Sin lavado, colocar el plato con un microscopio adecuado para imágenes de células vivas. Importante: los indicadores de fluorescencia son muy sensibles a la luz, por lo tanto, evitar la exposición a la luz innecesaria. </li><li> Adquirir imágenes sin cambiar los parámetros de adquisición para asegurar la comparabilidad entre las diferentes imágenes. </li></ol>

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<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La exposición dérmica a productos químicos tóxicos a menudo resulta en el trastorno de la cicatrización de heridas graves. Los mecanismos subyacentes son en gran parte desconocido. La cicatrización de heridas es un proceso complejo que consta de diferentes fases (hemostasia, inflamación, proliferación y remodelación). La migración celular está involucrado en cada fase, sin embargo, es de suma importancia para la formación del tejido de granulación. Aquí, los nuevos vasos sanguíneos se forman ya sea por angio- o vasculog...

La migración celular es importante en muchos procesos fisiológicos y fisiopatológicos, incluyendo el desarrollo, diversas enfermedades, y curación de heridas después de una lesión de la piel. Después de una lesión de la piel, la inflamación elimina unidades de tejido de granulación y dañadas o necróticas cierre de la herida preliminar y permite la formación de una red de nuevos capilares a través de la vasculogénesis (formación de novela) o la angiogénesis (surgimiento de vesículas existentes) 1-3. Tanto vasculopatía y la angiogénesis requieren migración de las células endoteliales. La creciente red de vasos sanguíneos es esencial para el transporte de oxígeno y nutrientes a la proliferación de los queratinocitos que sufren en última instancia, la queratinización, formar un nuevo epitelio y proporcionar cierre de la herida. Deterioro de la migración de las células endoteliales es una causa subyacente de la cicatrización de heridas trastorno 4,5. Por lo tanto, los métodos para evaluar la migración de las células endoteliales primeros están obligados a explorar la pathophysiolgía de trastornos de la migración celular y para identificar nuevas estrategias para la intervención terapéutica. La exposición dérmica a los agentes alquilantes (por ejemplo, azufre y mostazas de nitrógeno) provoca la cicatrización de heridas trastorno 6. Estos compuestos se utilizan como agentes de guerra química en varios conflictos en el siglo 20 y se mantienen razón de gran preocupación debido a las reservas existentes en regiones políticamente inestables y la relativamente simple síntesis. Aunque la mostaza de azufre se sintetizó por primera vez en 1822, la patología molecular y clínica de la exposición SM no se entiende en detalle y no antídoto para la exposición SM ha sido identificado. Se han realizado varios estudios para entender y modelar problemas de cicatrización de la herida después de la exposición SM y para detectar si existen compuestos candidatos potenciales capaces de reservar ese efecto. Schmidt et al. (2009) probó el efecto de clorambucilo, un compuesto alquilante con propiedades similares a SM en mouSE modelos de cuerpo embrioide y encontrado una, a veces dramática reducción de más del 99% en la formación de vasos 7. Este efecto adverso fue más pronunciado en una etapa de desarrollo que, en condiciones fisiológicas, está dominada por la proliferación y migración de las células precursoras endoteliales vasculares. Por lo tanto, se identificaron estas células para ser particularmente sensibles a los agentes alquilantes. Steinritz et al. (2010) probó eliminadores de especies reactivas de oxígeno (ROS), en particular, N-acetilcisteína (NAC) y el ácido alfa linolénico (ALA) por su capacidad para reducir la toxicidad SM en modelos de ratón del cuerpo embrioide y, en particular, a restaurar la formación de vasos 8. Se observaron efectos protectores temporales, lo que indica que la formación excesiva de ROS era probable que contribuya a los efectos adversos de SM en la cicatrización de heridas. Estos efectos no eran permanentes y los dos compuestos candidatos pueden no ser capaz de restaurar la formación de vasos y la cicatrización de heridas en el largo plazo 8. However, esos experimentos se realizaron en un modelo 3D complejo que hizo permitir la investigación de la migración celular. Por lo tanto, posteriormente probado NAC y ALA para los efectos beneficiosos sobre la migración de células de CEE que tienen un papel clave en el proceso de formación de vasos 9. Además, hay evidencia de que se requiere la polaridad celular para la migración celular. La disfunción mitocondrial que conduce a la formación de ROS se demostró que deteriorar la polaridad celular y por lo tanto puede afectar adversamente la migración celular. Por lo tanto, se realizó imágenes de células vivas con respecto a la función mitocondrial y se examinaron los efectos de los basureros ROS. El siguiente protocolo describe los requisitos generales para el cultivo de la CEE, el ensayo de cámara de Boyden, la cicatrización de heridas ensayo incluyendo el análisis de rastreo celular y el uso de TMRM para la evaluación de la función mitocondrial en detalle. Se destacan aspectos importantes de protocolos experimentales para el cultivo CEE y la migración.

<table><tbody><tr><td>Cámara de Boyden &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insertos tratados con cultivo de tejidos (TC) Corning FluoroBlok, 24 pocillos - 3 y micro; m</td><td>Corning Incorporated</td><td>#351151</td><td></td></tr><tr><td>Insertos tratados con Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC), 24 pocillos - 8 y micro; m</td><td>Ciencias de la Vida</td><td>#351152</td><td></td></tr><tr><td>(para usar con Falcon Insert 24 pocillos Companion Plate (353504)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Ensayo <td></td><td></td><td></td>de <td>cicatrización de heridas &nbsp;</td></tr><tr><td>Platos con fondo de vidrio</td><td>Word Precision Instruments, Inc.</td><td>#FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Evaluación del potencial</td><td></td><td></td><td></td>mitocondrial</tr><tr><td>TMRM (tetrametilrodamina metil éster)</td><td>Life Technologies</td><td>#T669</td><td></td></tr><tr><td>Cultivo</td><td></td><td></td><td></td>celular</tr><tr><td>Accutase</td><td>PAA, Pasching, Austria</td><td># L11-007</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Ácido linolénico</td><td>Fluka (Sigma), Steinheim, Alemania</td><td>&nbsp;# L2376</td><td></td></tr><tr><td>Chlorambucil</td><td>Fluka (Sigma), Steinheim, Alemania</td><td># 23125</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania</td><td># G2500-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación de la migración de células endoteliales después de la exposición a sustancias químicas tóxicas

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

La exposición a sustancias químicas (incluyendo alquilantes agentes de guerra química, como mostazas de azufre y nitrógeno) causa una gran cantidad de síntomas clínicos incluyendo trastorno de cicatrización de heridas. El proceso fisiológico de la cicatrización de la herida es muy compleja. La formación de tejido de granulación es un paso clave en este proceso resulta en un cierre de la herida preliminar y proporcionar una red de nuevos vasos sanguíneos capilares - ya sea a través de la vasculogénesis (formación de novela) o la angiogénesis (crecimiento de vasos existentes). Tanto vasculopatía y la angiogénesis requieren funcional, la migración dirigida de células endoteliales. Por lo tanto, la investigación de la migración temprana de células endoteliales (CEE) es importante para comprender la fisiopatología de los trastornos inducidos química herida curativa y potencialmente identificar nuevas estrategias para la intervención terapéutica. Se evaluó la alteración de la cicatrización de la herida después de la exposición alquilantes agente y probado compuestos candidatos potenciales para el tratamiento. Se utilizó un conjunto de técnicas descritas en este protocolo. Una cámara de Boyden modificada para investigar cuantitativamente chemokinesis del CEE se describe. Además, se ilustra el uso de la cicatrización de la herida ensayo en combinación con el análisis de pista para evaluar cualitativamente la migración. Finalmente, se demuestra el uso de la TMRM colorante fluorescente para la investigación del potencial de membrana mitocondrial para identificar los mecanismos subyacentes de la migración celular perturbada. El siguiente protocolo describe las técnicas básicas que han sido adaptados para la investigación de la CEE.

La exposición dérmica a los agentes alquilantes provoca eritema, formación de ampollas y la ulceración dérmica que está asociada con un trastorno de cicatrización de la herida. La cicatrización de heridas requiere vasculogénesis y angiogénesis, que se basa en la migración de las células endoteliales. Migración cuantitativa se puede evaluar mediante el uso del ensayo de cámara de Boyden. Como se muestra en la Figura 1C de la exposición a la CEE clorambucil agente alquilante dado lugar a una disminución s...

La investigación de la migración temprana de células endoteliales (EEC) es importante para comprender la fisiopatología de ciertas enfermedades y para identificar potencialmente nuevas estrategias para la intervención terapéutica. El siguiente protocolo describe las técnicas para evaluar la migración celular que han sido adaptadas para la investigación de la EEC.

Evaluación de la migración de células endoteliales después de la exposición a sustancias químicas tóxicas

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

El objetivo general del siguiente experimento es examinar la influencia de sustancias químicas tóxicas sobre la migración de células endoteliales utilizando diferentes ensayos de migración. Primero, en el próximo experimento se demuestra el uso de un ensayo modificado en cámara de evitación para examinar la quimocinesis de células endoteliales expuestas. Un ensayo de cicatrización de herida se combina con el seguimiento celular para proporcionar información adicional y detallada sobre la dinámica de la migración celular.En el ensayo final, se demuestra la investigación del potencial de membrana mitocondrial para identificar los mecanismos subyacentes de la migración celular endotelial alterada. En última instancia, estos ensayos de migración pueden utilizarse para evaluar los efectos de agentes alquilantes altamente tóxicos sobre el potencial de membrana mitocondrial y la migración de células endoteliales. Los métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de los trastornos de cicatrización de heridas inducidos por sustancias químicas altamente tóxicas, demostrando que los procedimientos serán realizados por Ramat, Voer y Stefan Miller, todos técnicos de mi laboratorio. Para recubrir los frascos de cultivo celular, comience añadiendo un volumen suficiente de gelatina recién preparada para cubrir completamente el fondo de un frasco estéril de cultivo celular.Coloque el matraz en una incubadora de cultivo celular durante al menos 30 minutos. Luego, retire la solución de gelatina restante y transfiera las células endoteliales tempranas derivadas de células madre embrionarias o EEC en suficiente medio para cultivar las células hasta el 80 % de confluencia cuando las células hayan alcanzado subconfluencia. Retire el medio, lave las células con PBS e incúbelas en un mililitro de Accutane por cada 25 centímetros cuadrados durante dos a 10 minutos.Cuando las células se hayan desprendido, divídalas en una proporción de uno a cinco en medio fresco para el análisis de migración de células endoteliales mediante ensayo en cámara de Boyden. Preparar previamente los insertos de filtro en 500 microlitros de gelatina al 0,1 % recién preparada. Después de recolectar las EEC como se acaba de demostrar, cuente las células y agregue 500 microlitros de medio de cultivo celular a los compartimentos inferiores de la cámara de Boyden.A continuación, agregue exactamente una vez 10 a la cuarta EEC en 500 microlitros de medio a cada filtro. Luego, después de eliminar cualquier burbuja, coloque la cámara de Boyden en el incubador durante exactamente ocho horas. Al final de la incubación, enjuague los filtros una vez con PBS.Luego, fije las células añadiendo 0,5 mililitros de paraformaldehído al 4 % a ambos compartimentos después de 20 minutos. Lave los filtros al menos tres veces con PBS 0,1 molar y seccione las membranas con el bisturí. Use medio de montaje suplementado con DPI para montar cada membrana entre dos laminillas de vidrio.Teniendo cuidado de observar la orientación de los filtros. Luego, utilice un microscopio fluorescente con un aumento de 400 x para contar únicamente las células que han migrado hacia el compartimento inferior. Tenga cuidado de no confundir los poros con las células migratorias.Para iniciar el ensayo de cicatrización de heridas, levante manualmente las células de una placa de cultivo de EEC con una confluencia del 80 % empujando suavemente una punta estéril de pipeta de 10 microlitros a través de la superficie del cultivo en una línea recta y continua desde un lado de la placa hasta el otro. Lave la placa dos veces con PBS 0,1 molar para eliminar las células desprendidas. A continuación, agregue medio suplementado con el compuesto de interés al recipiente de cultivo.Luego, coloque el cultivo en una placa bajo un microscopio capaz de realizar imágenes en vivo de células en condiciones de cultivo celular, y adquiera imágenes de lapso de tiempo durante 24 horas a intervalos de 10 minutos, utilizando al menos una resolución de 10×24 por 10×24 al final de la sesión de imágenes. Utilice la herramienta de software adecuada para medir el ancho del hueco a las 0 y 24 horas para realizar un ensayo de seguimiento celular. Importe la secuencia de imágenes a ImageJ y active el complemento MTTrackJ para ImageJ.Luego, utilizando el comando agregar, seleccione aleatoriamente 10 células en el campo de visión para rastrear manualmente el movimiento de las células durante el período de imagen de 24 horas. Utilice el comando medir para mostrar los resultados. A continuación, use el comando de película para exportar las trayectorias y evaluar el potencial de membrana mitocondrial de las células tras el tratamiento con el compuesto experimental de interés; reemplace el medio de cultivo celular con dos microlitros de TMRM recién preparado en un mililitro de medio de cultivo celular fresco.Medio, y luego sin lavar inmediatamente, coloque la placa bajo el microscopio y obtenga imágenes de las células de control y tratadas experimentalmente sin cambiar los parámetros de adquisición. Para garantizar la comparabilidad entre los diferentes grupos, la cicatrización de heridas requiere angiogénesis, un proceso que depende de la migración de células endoteliales, como lo ilustra la gráfica. La exposición de las EEC al agente alquilante clorambucil provoca una disminución significativa en la migración celular, tal como se midió mediante el ensayo de cámara de Boyden. La adición del captador de especies reactivas de oxígeno o ERO, ácido alfa-linolénico, inmediatamente después de la exposición de 24 horas al clorambucil, rescata significativamente el fenotipo casi hasta los niveles del control.El ensayo de la cámara de Boyden, sin embargo, no proporciona información sobre el comportamiento migratorio de las células en este ensayo representativo de herida y cicatrización. Las EEC no expuestas fueron capaces de cerrar el espacio en 24 horas, mientras que las EEC tratadas con clorambucil no lo fueron. Además, el seguimiento celular de las EEC individuales reveló que las células expuestas al clorambucil mostraron poco movimiento, lo cual se restableció tras el tratamiento con el captador de ERO.De hecho, las EEC expuestas al clorambucil presentan una alteración de su potencial de membrana mitocondrial, como se ilustra por la falta de expresión de TMRM. Sin embargo, el tratamiento de las EEC con el captador de ERO evitó este daño mitocondrial, manteniendo su potencial de membrana mitocondrial. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo analizar la migración de células endoteliales alteradas químicamente mediante un ensayo modificado de punto en cámara utilizando un ensayo de herida por raspadura y de cómo evaluar su potencial de membrana mitocondrial.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este video muestra un método para probar la migración de interneuronas en respuesta a señales quimioatractivas de las células endoteliales periventriculares (PVECs). Las interneuronas se colocan en un compartimento central, con PVEC y células de control a ambos lados. El aumento de la migración hacia las PVEC indica una respuesta positiva a sus señales quimioatractivas.

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