Name: Híbrido de imágenes μCT-FMT y análisis de imágenes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: Aprende a realizar imágenes híbridas μCT-FMT para evaluar cuantitativamente la distribución de fluorescencia en ratones anestesiados. Este protocolo integra tomografía molecular de fluorescencia con microtomografía computarizada.

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Damos las gracias a Marek Weiler para la realización de los experimentos fantasmas. Este trabajo fue apoyado por el Consejo Europeo de Investigación (ERC Starting Grant 309495: NeoNaNo), el Estado federal alemán de Renania del Norte Westfalia (NRW; High-Tech.NRW/EU-Ziel 2-Programm (EFRE); ForSaTum), el alemán Ministerio de Educación e Investigación (BMBF) (programas de financiación de hígado virtual (0.315.743), LungSys (0315415C), LungSys2 (0316042F), Photonik Forschung Deutschland (13N13355)), la Universidad RWTH Aachen (I 3 Fondo Semilla TM), e Investigación de Philips (Aquisgrán, Alemania).

<ol><li>Hoffman, R. M., Yang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+imaging+in+the+live+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Subcellular imaging in the live mouse.</a> Nature Protocols. 1 (2), 775-782 (2006).</li>
<li>Ale, A., Ermolayev, V., Herzog, E., Cohrs, C., Angelis, M. H., Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMT-XCT%3A+in+vivo+animal+studies+with+hybrid+fluorescence+molecular+tomography-X-ray+computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">FMT-XCT: in vivo animal studies with hybrid fluorescence molecular tomography-X-ray computed tomography.</a> Nature Methods. 9 (9), 615-620 (2012).</li>
<li>Eaton, V. L., Vasquez, K. O., Goings, G. E., Hunter, Z. N., Peterson, J. D., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tomographic+imaging+of+near+infrared+imaging+agents+quantifies+disease+severity+and+immunomodulation+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Optical tomographic imaging of near infrared imaging agents quantifies disease severity and immunomodulation of experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo.</a> Journal of Neuroinflammation. 10 (138), (2013).</li>
<li>Lederle, W., Arns, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+of+annexin-based+apoptosis+imaging+in+the+assessment+of+antiangiogenic+therapy+effects%5BTitle%5D)+AND+%22EJNMMI+Research%22%5BJournal%5D)">Failure of annexin-based apoptosis imaging in the assessment of antiangiogenic therapy effects.</a> EJNMMI Research. 1 (26), (2011).</li>
<li>Ntziachristos, V., Tung, C. -H., Bremer, C., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+molecular+tomography+resolves+protease+activity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo.</a> Nature Medicine. 8 (7), (2002).</li>
<li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multiple+uses+of+fluorescent+proteins+to+visualize+cancer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The multiple uses of fluorescent proteins to visualize cancer in vivo.</a> Nature Reviews Cancer. 5 (10), 796-806 (2005).</li>
<li>Schulz, R. B., Ale, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+system+for+simultaneous+fluorescence+and+x-ray+computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Medical+Imaging%22%5BJournal%5D)">Hybrid system for simultaneous fluorescence and x-ray computed tomography.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 29 (2), 465-473 (2010).</li>
<li>Stuker, F., Baltes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+small+animal+imaging+system+combining+magnetic+resonance+imaging+with+fluorescence+tomography+using+single+photon+avalanche+diode+detectors%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Medical+Imaging%22%5BJournal%5D)">Hybrid small animal imaging system combining magnetic resonance imaging with fluorescence tomography using single photon avalanche diode detectors.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (6), 1265-1273 (2011).</li>
<li>Leblond, F., Davis, S. C., Valdés, P. A., Pogue, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+Whole-body+Fluorescence+Imaging%3A+Review+of+Instruments%2C+Methods+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobiology+B%3A+Biology%22%5BJournal%5D)">Preclinical Whole-body Fluorescence Imaging: Review of Instruments, Methods and Applications.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 98 (1), 77-94 (2010).</li>
<li>Kunjachan, S., Gremse, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+optical+imaging+of+nanomedicine+biodistribution%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Noninvasive optical imaging of nanomedicine biodistribution.</a> ACS Nano. 7 (1), 252-262 (2013).</li>
<li>Radrich, K., Ale, A., Ermolayev, V., Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+limited-projection-angle+fluorescence+molecular+tomography+using+a+co-registered+x-ray+computed+tomography+scan%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Improving limited-projection-angle fluorescence molecular tomography using a co-registered x-ray computed tomography scan.</a> Journal of Biomedical Optics. 17 (12), 126011(2012).</li>
<li>Freyer, M., Ale, A., Schulz, R. B., Zientkowska, M., Ntziachristos, V., Englmeier, K. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+automatic+segmentation+of+anatomical+structures+in+x-ray+computed+tomography+images+to+improve+fluorescence+molecular+tomography+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Fast automatic segmentation of anatomical structures in x-ray computed tomography images to improve fluorescence molecular tomography reconstruction.</a> Journal of Biomedical Optics. 15 (3), 036006(2010).</li>
<li>Gremse, F., Theek, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absorption+Reconstruction+Improves+Biodistribution+Assessment+of+Fluorescent+Nanoprobes+Using+Hybrid+Fluorescence-mediated+Tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Absorption Reconstruction Improves Biodistribution Assessment of Fluorescent Nanoprobes Using Hybrid Fluorescence-mediated Tomography.</a> Theranostics. 4 (10), 960-971 (2014).</li>
<li>Cheong, W. -F., Prahl, S. A., Welch, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+optical+properties+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Journal+of+Quantum+Electronics%22%5BJournal%5D)">A review of the optical properties of biological tissues.</a> IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2166-2185 (1990).</li>
<li>Doleschel, D., Mundigl, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+near-infrared+imaging+of+the+erythropoietin+receptor+in+human+lung+cancer+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%3A+Official+Publication%2C+Society+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeted near-infrared imaging of the erythropoietin receptor in human lung cancer xenografts.</a> Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 53 (2), 304-311 (2012).</li>
<li>Al Rawashdeh, W., Arns, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tomography+of+MMP-activity+allows+a+sensitive+non-invasive+characterization+of+the+invasiveness+and+angiogenesis+of+SCC-xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Optical tomography of MMP-activity allows a sensitive non-invasive characterization of the invasiveness and angiogenesis of SCC-xenografts.</a> Neoplasia. 16 (3), 235-246 (2014).</li>
<li>Kunjachan, S., Pola, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+versus+Active+Tumor+Targeting+Using+RGD-+and+NGR-Modified+Polymeric+Nanomedicines%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Passive versus Active Tumor Targeting Using RGD- and NGR-Modified Polymeric Nanomedicines.</a> Nano Letters. 14 (2), 972-981 (2014).</li>
<li>Schober, A., Nazari-Jahantigh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-126-5p+promotes+endothelial+proliferation+and+limits+atherosclerosis+by+suppressing+Dlk1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-126-5p promotes endothelial proliferation and limits atherosclerosis by suppressing Dlk1.</a> Nature Medicine. 20 (4), 368-376 (2014).</li>
<li>Aikawa, E., Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenesis+associates+with+inflammation+in+early-stage+atherosclerosis+evaluated+by+molecular+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Osteogenesis associates with inflammation in early-stage atherosclerosis evaluated by molecular imaging in vivo.</a> Circulation. 116 (24), 2841-2850 (2007).</li>
<li>Gremse, F., Höfter, A., Schwen, L., Kiessling, F., Naumann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPU-Accelerated+Sparse+Matrix-Matrix+Multiplication+by+Iterative+Row+Merging%5BTitle%5D)+AND+%22SIAM+Journal+on+Scientific+Computing%22%5BJournal%5D)">GPU-Accelerated Sparse Matrix-Matrix Multiplication by Iterative Row Merging.</a> SIAM Journal on Scientific Computing. , C54-C71 (2015).</li>
<li>Vasquez, K. O., Casavant, C., Peterson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Whole+Body+Biodistribution+of+Fluorescent-Labeled+Agents+by+Non-Invasive+Tomographic+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Quantitative Whole Body Biodistribution of Fluorescent-Labeled Agents by Non-Invasive Tomographic Imaging.</a> PLoS ONE. 6 (6), e20594(2011).</li>
<li>Theek, B., Gremse, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+EPR-mediated+passive+drug+targeting+using+contrast-enhanced+functional+ultrasound+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Characterizing EPR-mediated passive drug targeting using contrast-enhanced functional ultrasound imaging.</a> Journal of Controlled Release. 182 (1), 83-89 (2014).</li>
<li>Hyde, D., Schulz, R., Brooks, D., Miller, E., Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+dependence+of+hybrid+x-ray+computed+tomography%2Ffluorescence+molecular+tomography+on+the+optical+forward+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Optical+Society+of+America.+A%2C+Optics%2C+Image+Science%2C+and+Vision%22%5BJournal%5D)">Performance dependence of hybrid x-ray computed tomography/fluorescence molecular tomography on the optical forward problem.</a> Journal of the Optical Society of America. A, Optics, Image Science, and Vision. 26 (4), 919-923 (2009).</li>
<li>Jacques, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+properties+of+biological+tissues%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Optical properties of biological tissues: a review.</a> Physics in Medicine and Biology. 58 (11), R37(2013).</li>
<li>Loening, A. M., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMIDE%3A+a+free+software+tool+for+multimodality+medical+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">AMIDE: a free software tool for multimodality medical image analysis.</a> Molecular Imaging. 2 (3), 131-137 (2003).</li>
<li>Gremse, F., Schulz, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+Quantitative+Data+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Small+Animal+Imaging%22%5BJournal%5D)">Qualitative and Quantitative Data Analysis.</a> Small Animal Imaging. , 363-378 (2011).</li>
<li>Baiker, M., Milles, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atlas-based+whole-body+segmentation+of+mice+from+low-contrast+Micro-CT+data%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Image+Analysis%22%5BJournal%5D)">Atlas-based whole-body segmentation of mice from low-contrast Micro-CT data.</a> Medical Image Analysis. 14 (6), 723-737 (2010).</li>
<li>Sevick-Muraca, E. M., Rasmussen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+with+optics%3A+primer+and+case+for+near-infrared+fluorescence+techniques+in+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging with optics: primer and case for near-infrared fluorescence techniques in personalized medicine.</a> Journal of Biomedical Optics. 13 (4), 041303(2008).</li>
</ol>

Felix Gremse es fundador y propietario de Gremse-IT, una compañía de lanzamiento que ofrece software y servicios para el análisis de imágenes médicas en colaboración con Philips y el Departamento de Imagen Molecular Experimental de la Universidad RWTH Aachen.

Describimos y aplicamos un protocolo para multimodal de imágenes μCT-FMT. Utilizamos FMT disponible en el mercado y ampliamente utilizado y dispositivos μCT 3,11,15 - 17,21. Mientras que el protocolo requiere una FMT específica, el μCT puede ser sustituido por otro μCT con una funcionalidad similar y parámetros de análisis comparables, por ejemplo, el campo de visión debe ser lo suficientemente grande como para cubrir la cama ratón incluyendo los marcadores. La FMT se ha utilizado para el análisis de biodistribución sin combinarla con μCT o MRI 21, sin embargo, los datos anatómica es beneficioso para aumentar la reproducibilidad porque la segmentación se puede basar en los límites de órganos que son visibles en los datos μCT 10. Mientras que los dispositivos μCT-FMT integrados se han desarrollado 2,7, éstos aún no están disponibles comercialmente. Además, el uso de dos dispositivos separados permite la tubería, es decir., El siguiente ca ratónn ser fotografiado en el μCT mientras que el primer ratón se encuentra todavía en la FMT, para aumentar el rendimiento. Para reducir la carga de trabajo manual, llevamos a cabo la detección de marcadores automatizado y la fusión. Además, la forma de ratón se segmenta automáticamente esta información y mejora significativamente la 11,13,22 reconstrucción de fluorescencia. Para la reconstrucción de fluorescencia cuantitativa, se necesitan mapas de absorción y dispersión 13,23. Obtenemos el mapa de dispersión por la segmentación automatizado de los datos μCT y asignar coeficientes de dispersión conocidos de varios tipos de tejidos (pulmón, hueso, piel, grasa y tejido blando restante) 24. Posteriormente, se reconstruye un mapa de absorción de los datos en bruto óptico que es particularmente importante para los órganos bien perfundidos, tales como el corazón y el hígado 13,20. Escaneado de varios ratones en múltiples puntos de tiempo se traduce rápidamente en un gran número de conjuntos de datos para ser analizados. Para Biodisestudios tribución, varios órganos deben ser segmentados para cada exploración μCT-FMT. Por desgracia, las segmentaciones no pueden ser reutilizados, ya que el ratón está recién colocado en el lecho del ratón repetidamente. Utilizamos una herramienta para la segmentación interactiva, desarrollada en nuestro instituto, sin embargo, otras herramientas pueden también ser apropiados 25. Generamos segmentaciones-vóxel sabio, ya que estos se ajustan mejor a los órganos complejos de formas simples tales como elipses y cubos 26. Segmentación todo animal automatizada sería útil para reducir aún más la carga de trabajo manual de 27, sino una herramienta de segmentación interactiva seguiría siendo necesario para corregir errores de segmentación. Además, las herramientas de segmentación automatizada difícilmente pueden anticipar casos especiales como patologías correctamente. Desde que usamos exploraciones μCT nativos, algunos órganos como el bazo son muy difíciles de segmento incluso manualmente. Los medios de contraste se ayudan, pero hay problemas con la tolerabilidad y es difícil de mantenina distribución de agente de contraste constante en toda la imagen longitudinal. Nuestro estudio fantasma muestra que la localización de la señal se mejora cuando se utiliza la información de la forma para la reconstrucción de fluorescencia. In vivo, una mejora similar es evidente para el punto de tiempo temprano (15 min después de la inyección), cuando una gran cantidad de la sonda ya está en el vejiga urinaria. La sonda de unión a hidroxiapatita se acumula en los huesos y las articulaciones. Es notable lo rápido que se produce este, es decir, la señal ya es claramente visible en la columna 15 min después de la inyección. Esto probablemente es causada por el bajo peso molecular de la sonda, lo que permite la extravasación rápido y difusión a las regiones de destino. La sonda se une covalentemente a su hidroxiapatita diana y la sonda no unido se excreta. Para los puntos de tiempo posteriores, entre 6 h y 24 h después de la inyección, la intensidad de la señal en la columna vertebral se mantiene relativamente estable, probablemente, porque casi no re luzdolores profundamente en el ratón para blanquear la fluorescencia. Para nuestro estudio, hemos utilizado el canal de 750 nm, lo que resulta en una baja fluorescencia de fondo como es evidente para los escáneres adquiridos antes de la inyección. En longitudes de onda más bajas, más la señal de fondo se puede esperar 28. En resumen, se describe un protocolo de imagen multimodal para dispositivos FMT y μCT disponibles en el mercado. Se demuestra que la combinación proporciona beneficios para la reconstrucción de fluorescencia. Se ilustra cómo las curvas de biodistribución se extraen de la gran cantidad de datos de imagen por medio de la segmentación del órgano interactivo y procesamiento por lotes. Creemos que este flujo de trabajo estandarizado puede ser útil para el desarrollo de medicamentos y otros estudios de imagen utilizando sondas marcadas con fluorescencia.

Tomografía de fluorescencia mediada, también llamada tomografía de fluorescencia molecular (FMT), es una técnica prometedora para evaluar cuantitativamente la distribución de fluorescencia en los tejidos difusos, tales como ratones anestesiados o incluso tejidos del cuerpo humano, por ejemplo, senos o articulaciones de los dedos. En contraste con las técnicas de microscopía no invasivos, que permiten imágenes de objetivos superficiales en resolución subcelular 1, FMT permite la reconstrucción tridimensional de fuentes fluorescentes en profundidades de varios centímetros, aunque a menor resolución 2. Muchas sondas fluorescentes específicas están disponibles para la angiogénesis imagen, apoptosis, inflamación, y otros 2 - 5. Algunas sondas son activable, por ejemplo., Mediante escisión específica de la enzima que conduce a unquenching de fluorocromos. Por otra parte, los genes indicadores que expresan proteínas fluorescentes se pueden obtener imágenes, por ejemplo, para rastrear la migración de células del tumor 6. FMT beneficia considerablemente de la combinación con una modalidad anatómica, por ejemplo, μCT 2,7 o RM 8. Mientras que los dispositivos FMT independientes están disponibles comercialmente 9, las imágenes de fluorescencia son difíciles de interpretar, sin información de referencia anatómica. Recientemente hemos sido capaces de demostrar, que los datos de imagen anatómica fundido permite un análisis más robusto 10. Los datos anatómicos también se pueden utilizar para proporcionar conocimiento previo, tal como la forma exterior del ratón, lo cual es importante para el modelado óptico de fluorescencia reconstrucción precisa y 11. Además, los mapas de dispersión y absorción ópticos pueden estimarse utilizando la segmentación de tipos de tejido y mediante la asignación de coeficientes específicos de clase 12,13. Para la luz del infrarrojo cercano, la hemoglobina es el absorbente principal en ratones, además de la melanina y la piel 14. Dado que el volumen de sangre relativa varía regionalmente por órdenes de magnitud, un mapa de absorción es particularmente importante para Quanfluorescencia reconstrucción cuanti- 13. Una ventaja de utilizar dispositivos de imagen no invasivas es que los ratones se pueden obtener imágenes longitudinalmente, es decir, en múltiples puntos de tiempo. Esto es importante para evaluar el comportamiento dinámico de sondas, es decir, su acumulación de destino, biodistribución y la excreción 10,15, o para evaluar la progresión de la enfermedad 16. Cuando la formación de imágenes de varios ratones en múltiples puntos de tiempo, una gran cantidad de conjuntos de datos de imagen surge. Para permitir la comparabilidad, estos deben ser adquiridos de manera sistemática, es decir, con un protocolo bien definido y documentado. El gran número de exploraciones plantea un desafío para el análisis de imágenes, que se requiere para extraer mediciones cuantitativas de los datos de imagen. El objetivo de nuestro estudio es proporcionar una descripción detallada de un protocolo de imágenes μCT-FMT que utilizamos y optimizado a lo largo de varios estudios 10,13,15,17,18. Describimoscómo se generan los conjuntos de datos, procesado, visualizado, y se analizaron. Esto se demuestra utilizando una sonda molecular establecido, OsteoSense, que se une a la hidroxiapatita 19, y se puede utilizar para enfermedades de los huesos y remodelación de imagen 2. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el comité de evaluación del gobierno en el cuidado de animales.

<table><tbody><tr><td>FMT (Tomografía molecular de fluorescencia) FMT2500 LX</td><td>PerkinElmer</td><td>FMT2000</td><td>Dispositivo para tomografía molecular de fluorescencia</td></tr> <tr><td>y micro; TC (micro tomografía computarizada) Tomoscope Duo</td><td>CT Imaging GmbH</td><td>Tomoscope Duo</td><td>Dispositivo para micro tomografía computarizada</td></tr><tr><td>Cama de ratón multimodal</td><td>CT Imaging GmbH</td><td>Constructor experimental</td><td>Soporte para animales parcialmente transparente</td></tr><tr><td>IsoFlo (isoflurano, USP)</td><td>Abbott</td><td>05260-05</td><td>Isoflurano Anestesia inhalada Sistema</td></tr> de <tr><td>anestesia para pequeños animales</td><td>Aparato Harvard</td><td>726419</td><td>Sistema completo de sobremesa de isoflurano</td></tr><tr><td>Alimento para ratones sin clorofila</td><td>Ssniff</td><td>E15051</td> Alimento <td>de baja clorofila / baja fluorescencia</td></tr><tr><td>OsteoSense 750EX</td><td>PerkinElmer</td><td>NEV10053EX</td><td>Animal FMT agente de contraste</td></tr><tr><td>Portex Tubo de polietileno de diámetro fino</td><td>Smith medical</td><td>800/100/120</td><td>Tubo para catéter de inyección</td></tr><tr><td>Sterican 30g</td><td>BBraun</td><td>4656300</td><td>Aguja hipodérmica para catéter</td></tr><tr><td>Imeron</td><td>Altana pharma</td><td>INLA F.1/0203/3.5337.69</td><td>CT Agente de contraste para las inclusiones fantasma</td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma</td><td>90-12-36-6</td><td>Agarosa para la producción de maniquíes</td></tr><tr><td>TiO2</td><td>Applichem</td><td>A1900,1000</td><td>Óxido de titanio como agente dispersor fantasma</td></tr><tr><td>Azul tripán</td><td>Fluka</td><td>93595</td><td>Azul tripán para ajustar la luz fantasma propagación</td></tr><tr><td>Cy7</td><td>Lumiprobe</td><td>15020</td><td>Fluorocromo para las inclusiones fantasma</td></tr><tr><td>Lipovenoes 20%</td><td>Fresenius Kabi</td><td>3094740</td><td>Emulsión lipídica, agente dispersor para agentes de contraste FMT</td></tr><tr><td>Definiens Developer XD Server</td><td>Definiens AG Server</td><td>XD</td><td>Plataforma de software para la segmentación automatizada</td></tr><tr><td>Imalytics Preclinical</td><td>ExMI/Gremse-IT</td><td>Versión 2.0.1</td><td>Software para fusión, reconstrucción y análisis de imágenes</td></tr><tr><td>NVIDIA Geforce Titan</td><td>Asus</td><td>GTXTITAN6GD5</td><td>Tarjeta gráfica de computadora de gama alta, 6 GB de memoria</td></tr></tbody></table>

híbrido de imágenes μct-fmt y análisis de imágenes

Hybrid &#181;CT-FMT imaging and image analysis

La fluorescencia mediada por tomografía (FMT) permite la determinación longitudinal y cuantitativa de la distribución de fluorescencia in vivo y se puede utilizar para evaluar la biodistribución de nuevas sondas y para evaluar la progresión de la enfermedad utilizando sondas moleculares establecidas o genes informadores. La combinación con una modalidad anatómica, por ejemplo, micro tomografía computarizada (μCT), es beneficioso para el análisis de imagen y para la reconstrucción de fluorescencia. Se describe un protocolo para multimodal de imágenes μCT-FMT incluyendo los pasos de procesamiento de imágenes necesarias para extraer mediciones cuantitativas. Después de la preparación de los ratones y la realización de la formación de imágenes, los conjuntos de datos multimodales están registrados. Posteriormente, se realiza una mejor reconstrucción de fluorescencia, que tiene en cuenta la forma del ratón. Para el análisis cuantitativo, segmentaciones de órganos se genera en base a los datos anatómicos utilizando nuestra herramienta de segmentación interactiva. Finalmente, el cu biodistribuciónrves se generan utilizando una función de procesamiento por lotes. Mostramos la aplicabilidad del método mediante la evaluación de la biodistribución de una sonda bien conocido que se une a los huesos y las articulaciones.

Se aplicó el protocolo descrito para evaluar la biodistribución de una sonda específica, OsteoSense, que se une a la hidroxiapatita. 3 ratones (C57BL / 6 ApoE - / - AHSG - / - ratones doble knockout, 10 semanas de edad) se obtuvieron imágenes de antes y 15 min, 2 h, 4 h, 6 h, y 24 h después de la inyección iv de 2 nmol OsteoSense. Nuestro software detecta automáticamente los marcadores incorporados en la cama ratón multimodal (Figura 1, Figura 2A, B), lo que permitió la fusión de los datos μCT anatómicas con la reconstrucción de fluorescencia realizado por el FMT (Figura 2C, D). Desde OsteoSense es una sonda con un bajo peso molecular, un excreción renal rápido y por lo tanto, la señal de alto en la vejiga urinaria que se espera. La fusión de la reconstrucción de fluorescencia de la FMT reveló problemas como señal fuera de lugar fuera de la vejiga (Figura 2C, D). Estos problemas se producen porque el FMT no sabe la verdadera forma del ratón y asume una forma de bloque. Oureconstrucción r determina la forma precisa de los datos μCT y genera dispersión y los mapas de absorción 13 con el fin de permitir una reconstrucción más exacta de fluorescencia con una mejor localización de la señal, que es particularmente evidente en la vejiga (Figura 2E, F). Para asignar la fluorescencia reconstruida a regiones apropiadas, que de forma interactiva segmentado varios órganos que utilizan nuestro software (Figura 3). Para cada una de las 18 exploraciones, 7 regiones fueron segmentados basan en los datos, es decir μCT., Corazón, pulmón, hígado, riñones, la columna vertebral, el intestino y la vejiga. Posteriormente, el software se utilizó para calcular la concentración media de fluorescencia para cada una de las regiones 126. Afortunadamente, el software ofrece un modo discontinuo, que calcula todos los valores y las guarda en una sola hoja de cálculo. Para visualizar la distribución de fluorescencia, representaciones en 3D se generaron para cada punto de tiempo,usando entorno de ventanas comparables (Figura 4A-F). Utilizando los valores cuantificados de órganos, la biodistribución se calculó promediando los valores de órganos durante los tres ratones (Figura 4G). Las exploraciones previas, adquiridas antes de la inyección, mostraron señal de fondo insignificante. 15 min después de la inyección, la señal más fuerte apareció en la vejiga urinaria, debido a la excreción renal rápido. En los puntos de tiempo posteriores, la sonda restante había acumulado en los huesos y las articulaciones. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52770/52770fig1.jpg" /> Figura 1. Multimodal ratón cama. (A) La cama del ratón multimodal contiene dos placas de vidrio acrílico que sujetan firmemente el ratón. El endurecimiento se ajusta con dos tornillos. La cama ratón contiene marcadores (agujeros vacíos) para la fusión de imágenes. Gas anestésico se suministra mediante un tubo flexible que está obsesionado con tsimio. (B) La cama del ratón está unido a un soporte de metal y se mantiene en el centro del pórtico μCT rotativo. (C) Evitar una brecha entre la cama del ratón y el soporte de metal, porque de lo contrario, los marcadores pueden ser asignados de forma incorrecta que lleva a la fusión incorrecta. El tubo de gas anestésico debe ser conectado al conector de tubo. (D) La cama ratón debe ser insertado en el FMT con el frente primero para permitir una fusión correcta automatizado. (E) Los marcadores son visibles para la cámara FMT, que se utiliza para la detección de marcadores automatizado y la fusión. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52770/52770fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52770/52770fig2.jpg" /> Figura 2. Imagen de Fusión y Reconstrucción. (A, B) Marcadores y la forma exterior del mouSE se determina por el algoritmo de segmentación automatizado. (C, D) 15 min después de la inyección de OsteoSense, una cantidad considerable de la sonda ya ha sido excretado en la vejiga urinaria. Después de la fusión de la reconstrucción proporcionada por el proveedor con los datos μCT, los problemas se hacen visibles. La mayor parte de la señal aparece alrededor de la vejiga, pero no dentro de la vejiga y algunos incluso señal aparece en el aire. Esto sucede porque el FMT asume un ratón en forma de bloque. (E, F) Nuestra mejorado la reconstrucción de fluorescencia, usando la forma del ratón derivado de los datos μCT, se traduce en una mejor localización de la fluorescencia dentro de la vejiga. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52770/52770fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52770/52770fig3.jpg" /> Figura 3. interactivo Organ Segmentat. iónico (A) Para cuantificar la distribución de fluorescencia, varios órganos están segmentados: Corazón (rojo), pulmón (rosa), hígado (marrón), estómago (beige), la columna vertebral (morado), los riñones (amarillo), intestino (verde) y la vejiga urinaria (oro). (B) El pulmón, que se contrastó fuertemente en comparación con el tejido circundante, se segmenta usando umbralización y llenado región. (C) de la Ronda órganos, como la vejiga, los riñones y el corazón están segmentados utilizando &quot;garabatos&quot;. (D) Los órganos con una forma más compleja, por ejemplo, el hígado y el estómago están segmentados de forma incremental utilizando garabatos. Para el segmento de la columna vertebral, un umbral alto se aplica a todos los segmentos de huesos. Entonces algunos huesos, por ejemplo., Las costillas, se cortan, hasta que la columna vertebral se mantiene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52770/52770fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 4. La biodistribución. Para evaluar la biodistribución, los ratones se escanean en varios puntos temporales (AF). (A) La detección previa, antes de la inyección, muestra poca señal de fondo en el canal 750 nm. (B) 15 min después de la inyección, una cantidad considerable de la sonda ya está en la vejiga urinaria. (C) En el punto de tiempo de 2 h, el ratón había orinado, lo que resulta en algunos fluorescencia fuera del ratón. En los puntos de tiempo posteriores (DF), la señal aparece predominantemente en los huesos y articulaciones, es decir., En la columna vertebral y las rodillas. (G) La concentración de fluorescencia cuantificada se muestra para los órganos seleccionados.

Describimos un protocolo para la obtención de imágenes híbridas, que combina la tomografía mediada por fluorescencia (FMT) con la micro tomografía computarizada (μCT). Después de la fusión y la reconstrucción, realizamos una segmentación interactiva de órganos para extraer mediciones cuantitativas de la distribución de fluorescencia.

Híbrido de imágenes μCT-FMT y análisis de imágenes

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to ...

La tomografía mediada por fluorescencia es una técnica de imagen altamente sensible para evaluar cuantitativamente la distribución de la fluorescencia. En ratones anestesiados, existen muchas sondas fluorescentes dirigidas que permiten la obtención de imágenes de la angiogénesis, la apoptosis, la inflamación y otros procesos. En este vídeo, mostraremos cómo se realiza en nuestro instituto la imagen híbrida con FMT y Micro City.En el capítulo uno, los dispositivos, esto es nuestro F-M-T-F-M-T, que significa tomografía molecular de fluorescencia. Tomografía significa que se generan imágenes tridimensionales. La TMT es altamente sensible para la obtención de imágenes de fluorescencia cercana intrínseca en ratones.Ahora el panel frontal está abierto para mostrar el interior del FMT. En la parte inferior hay un láser montado en un servomotor 2D. El láser emite luz hacia el ratón, que se mantiene en una camilla para ratones parcialmente transparente.Encima de la camilla del ratón hay una matriz de LED que sirve como fuente de luz alternativa, lo que permite que la TFM funcione como un dispositivo de imagen de reflectancia convencional. La rueda de filtros está montada debajo del lente, que capta la luz para el detector situado en la parte superior del dispositivo. Este es nuestro micro CT.El micro-TC está equipado con dos tubos de rayos X y dos detectores de panel plano, lo que permite la adquisición de escaneos de doble energía. Capítulo dos, protocolo de escaneo de micro-TC con FMT. Tanto la FMT como la micro-TC están diseñadas para obtener imágenes de ratones; antes del imagenológico, los ratones se anestesian con isoflurano.Para el escaneo mediante FMT, es necesario eliminar el vello del ratón, lo cual se realiza eficazmente con la crema de afeitado. Algunas cepas de ratones pueden desarrollar erupciones cutáneas por la crema depilatoria. Por lo tanto, se recomienda monitorear a los ratones en busca de cambios en la piel y contactar al personal veterinario para su atención, si fuera necesario.Asimismo, pruebe la tolerancia en un lote pequeño de cualquier nueva cepa de ratones al principio. Para evitar la hipotermia, se coloca al ratón sobre una almohadilla calefactora. Para inyectar el agente de contraste, se coloca un catéter en la vena de la cola debido al pequeño tamaño.Esto es bastante difícil y requiere cierta experiencia. Si la sangre fluye de regreso hacia el catéter, significa que está colocado correctamente a través del catéter. Se pueden inyectar agentes de contraste fluorescentes y agentes de contraste para tomografía computarizada para evitar la sobrecarga de volumen.Como máximo, se debe inyectar cinco mililitros por kilogramo de peso corporal, lo que equivale a 150 microlitros para un ratón de 30 gramos. Para la exploración, el ratón se coloca dentro de una camilla multimodal para ratones.Al ratón se le pueden dibujar algunos símbolos en la cola para su identificación. Es importante evitar tales elementos en el tronco, ya que podrían afectar el escaneo óptico. Se cierra la camilla del ratón y se ajusta la profundidad para sujetar firmemente al ratón en una posición fija.Tenga cuidado y controle la respiración, ya que apretar demasiado la cama puede asfixiar al ratón. Los ratones desnudos se utilizan comúnmente en investigaciones oncológicas debido a su supresión inmunitaria. El hecho de que sean desnudos es un efecto secundario afortunado de la mutación genética.Por lo tanto, se puede omitir el laborioso procedimiento de eliminación del vello. Se debe verificar que el ratón respire adecuadamente, y si es necesario, se debe ajustar la camilla del ratón en consecuencia. Luego, se coloca la camilla del ratón dentro del micro CT.Los tubos que transportan el gas de flúor ISO se cambian para mantener el flujo de gas dentro del dispositivo. Luego, se cierra el micro C para permitir el blindaje de rayos X. El micro C solo comenzará a escanear si la tapa está cerrada.Utilizando los botones del micro-TC, se puede introducir el ratón en el micro-TC. En el ordenador de control del micro-TC, se adquiere una topografía y se muestra; luego se ajustan los parámetros de ventana para visualizar mejor al ratón. Pueden colocarse uno o más escaneos ZUP. Su posición se indica mediante regiones de color azul claro.Normalmente son suficientes de uno a tres escaneos ZUP. Después de iniciar el escaneo, el progreso se muestra con barras de progreso de color azul oscuro. Nuestro micro-TC con panel plano realiza escaneos ZUP sucesivamente, lo cual es diferente de una tomografía computarizada clínica en espiral.Utilizando los botones, la camilla del ratón se mueve hacia el frente. Nuevamente, se abre la tapa de protección y se cambian los tubos de anestesia. El soporte se retira cuidadosamente de la camilla del ratón y se extrae el tubo de anestesia.Esto es necesario porque el AN y el FMT no dependen de este pequeño tubo. En cambio, la cámara pequeña dentro del FMT se inunda con gas anestésico. Ahora, la camilla para ratón con el ratón se lleva al FMT y se inserta en la computadora de control del FMT.Se ajusta también el campo de visión de exploración, así como la densidad de muestreo. Habitualmente se utilizan aproximadamente 120 puntos. La exploración comienza tras presionar un botón.El primer pase de la TFM adquiere una imagen de iluminación o excitación transmitida para cada punto fuente de láser. En esta película, se muestra en modo de avance rápido. Normalmente, tarda alrededor de cinco minutos.Puede observarse que una cantidad mucho menor de luz atraviesa la parte superior del cuerpo en comparación con la parte inferior. Esto se debe a que los órganos con mayor volumen sanguíneo relativo, como el corazón, el hígado y los riñones, se encuentran principalmente en la parte superior del cuerpo. La sangre es el principal absorbedor de la luz infrarroja cercana.Las segundas ejecuciones utilizan los mismos puntos de origen con un filtro diferente, que solo permite el paso de la luz fluorescente a través del capítulo tres, aceite interactivo y segmentación. Para fusionar los datos de ambos dispositivos, se utilizan marcadores que están integrados en la camilla del ratón.Los marcadores también son visibles en una imagen de reflexión adquirida por la FMT. Los marcadores son en realidad orificios simples y no necesitan rellenarse con ningún agente de contraste fluorescente o para tomografía computarizada. En nuestro instituto, desarrollamos un programa informático que realiza la detección de marcadores y la fusión de forma automática.La forma del ratón, así como los mapas heterogéneos de absorción y dispersión, se estiman automáticamente utilizando los datos de micro-TC, tal como se describe en nuestra publicación reciente en Theranostics. Estos parámetros son importantes para la reconstrucción cuantitativa de la fluorescencia. Para medir la biodistribución de la fluorescencia, se requiere una segmentación de órganos.Generamos dicha segmentación de forma interactiva utilizando un software llamado imulitic preclinical desarrollado en nuestro instituto en lo siguiente. Dicha segmentación se muestra en avance rápido y una persona experimentada puede realizarla en aproximadamente de 10 a 20 minutos. Primero, se carga el conjunto de datos de TC.Se puede inspeccionar en 3D utilizando una representación de superficie ISO. Al modificar la configuración de la ventana, se puede cambiar el valor ISO. Por ejemplo, para visualizar los huesos de todo el cuerpo del ratón junto con la camilla del ratón, se carga la superposición.La señal para este ejemplo aparece en la vejiga. Ahora se ha desactivado la visualización superpuesta. Para concentrarse en la segmentación anatómica.En los escaneos microt de tejido nativo, el pulmón se encuentra fácilmente debido al fuerte contraste negativo con respecto a otros tejidos blandos. La estructura grande dentro del pulmón es el corazón. Vamos a segmentar primero el pulmón.Todos los vóxeles por debajo de un cierto valor se segmentan utilizando umbralización. Esto aparece en verde. El pulmón es una región conectada, que puede separarse mediante una operación de relleno.Similar al cubo de pintura en un programa de dibujo, el pulmón puede separarse al cortar y rellenar. Órganos convexos, como la vejiga, pueden segmentarse dibujando garabatos para delimitar los bordes del órgano.Se pueden agregar más trazos hasta alcanzar una precisión suficiente. Los órganos no convexos, como el intestino, pueden segmentarse pieza por pieza. El hígado aparece como una región homogénea y tiene una estructura más compleja.Dado que consta de múltiples lóbulos, la segmentación puede guardarse en el disco y cargarse en el programa. Mediante dicha segmentación, la señal fluorescente puede asignarse a los órganos. El programa calcula estas cantidades y las guarda como una hoja adicional para escaneos longitudinales; la segmentación debe realizarse nuevamente para cada punto temporal, ya que los intervalos suelen ser demasiado largos para mantener al ratón anestesiado en una posición fija.Por lo tanto, la segmentación es una tarea laboriosa si se incluyen muchos ratones y muchos puntos temporales. Para cuantificar los resultados, cargue una superposición y una segmentación. Haga clic en Establecer configuración por lotes para que el programa recuerde la configuración actual.Ahora, haga clic en estadísticas por lotes para indicar al programa que calcule los valores para todas las regiones en todos los escaneos micro CT FMT. Esto tomará unos segundos. Luego, las estadísticas se guardan en un solo archivo de hoja de cálculo.Esto es conveniente porque el usuario no tiene que combinar decenas de archivos él mismo. A partir de este archivo, se pueden calcular las curvas del órgano. Capítulo cuatro, resultados representativos.Para comprobar que la fusión funciona correctamente, utilizamos un fantasma de aros. Se agregó algo de polvo de óxido de titanio para provocar dispersión. Para lograr una forma irregular, recortamos algunas partes.Se incorporaron varias inclusiones pequeñas llenas de agente de contraste fluorescente y de TC en el fantasma. Dado que la TFM no conoce la forma real del objeto y asume una forma simplificada, la reconstrucción no es precisa para objetos con formas irregulares. Por lo tanto, implementamos otra reconstrucción que utiliza la forma derivada de los datos de micro ciudad.Como puede observarse, la localización de la señal en el fantasma es mucho mejor. Para examinar los datos in vivo, repasemos los puntos temporales de la adquisición de imágenes. Esta es la exploración previa.Lo que vemos es básicamente ruido y artefactos. Si pasamos al siguiente punto temporal, el posterior a la inyección, observamos mucha más señal, pero los ajustes de ventana están demasiado altos. Mediante el cuadro de diálogo de ventana, puede ajustar la configuración de ventana.Observamos la mayor parte de la señal en la vejiga. Si pasamos al siguiente momento, 0,2 horas después de la inyección, vemos algo de señal fuera del ratón. Esto se debe a que el ratón ha orinado la fluorescencia sobre el lecho del animal.Al ajustar aún más la ventana, podemos observar cierta señal en la columna vertebral y las rodillas. Ahora pasemos al tiempo de 0,4 horas después de la inyección; la señal proveniente de la orina ha desaparecido y observamos fluorescencia en la columna vertebral y las rodillas en los siguientes puntos temporales: seis horas y 24 horas después de la inyección. Observamos lo mismo.Ahora pasemos al siguiente corte. La preescaneo no muestra nada usando estos ajustes de ventana. El escaneo a los 15 minutos después de la inyección muestra una señal intensa en la vejiga y así sucesivamente.En este estudio, encontramos altas concentraciones en la vejiga urinaria poco después de la inyección, como consecuencia de la rápida excreción renal de esta sonda. Además, la señal en la columna vertebral aumenta rápidamente y permanece relativamente estable a lo largo de los puntos temporales posteriores de imagen. Capítulo cinco, conclusión.En conclusión, presentamos un protocolo de imagen multimodal que combina las ventajas de la fluorescencia, la tomografía molecular y la microtomografía computarizada. Los datos anatómicos de micro-TC permiten una reconstrucción mejorada de la fluorescencia mediante el uso de la forma del ratón. Además, resulta útil para generar segmentaciones de órganos, necesarias para extraer mediciones cuantitativas a partir de los datos de imagen.

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