Híbrido de imágenes μCT-FMT y análisis de imágenes

Describimos un protocolo para la obtención de imágenes híbridas, que combina la tomografía mediada por fluorescencia (FMT) con la micro tomografía computarizada (μCT). Después de la fusión y la reconstrucción, realizamos una segmentación interactiva de órganos para extraer mediciones cuantitativas de la distribución de fluorescencia.

La tomografía mediada por fluorescencia es una técnica de imagen de alta sensibilidad para evaluar cuantitativamente la distribución de fluorescencia. En ratones anestesiados, hay disponibles muchas sondas fluorescentes dirigidas, que permiten obtener imágenes de la angiogénesis, la apoptosis, la inflamación y otras. En esta película, mostraremos cómo se realizan las imágenes híbridas con FMT y Micro City en nuestro instituto.

En el capítulo uno, los dispositivos, esto es nuestro F-M-T-F-M-T significa tomografía molecular de fluorescencia. La tomografía significa que se generan imágenes en 3D. El FMT es altamente sensible para obtener imágenes de fluorescencia casi innata en ratones.

Ahora se abre el panel frontal para mostrar el interior del FMT. En la parte inferior hay un láser montado en un servidor 2D. El láser emite luz en el ratón, que se mantiene en una cama de ratón parcialmente transparente.

Sobre la base del ratón hay una serie de LED como fuente de luz alternativa, lo que permite que el FMT funcione como un dispositivo de imagen de reflectancia normal. La rueda de filtros está montada debajo de la lente, que captura la luz para el detector en la parte superior del dispositivo. Esta es nuestra micro tomografía computarizada.

El micro CT está equipado con dos tubos de rayos X y dos detectores de panel plano, que permiten la adquisición de escaneos de energía dual. Capítulo dos, protocolo de escaneo micro CT FMT. Tanto el FMT como la micro CT están diseñados para obtener imágenes de ratones antes de que los ratones se anestesien con isof flúor.

Para el escaneo FMT, es necesario eliminar el pelo del ratón, lo que funciona bien con la crema de arenque. Algunas cepas de ratones pueden desarrollar erupciones cutáneas debido a la crema deha. Por lo tanto, se recomienda monitorear los ratones para detectar cambios en la piel y ponerse en contacto con el personal veterinario para recibir atención si es necesario.

Además, pruebe la tolerancia en un pequeño lote de cualquier cepa nueva de ratones para empezar. Para evitar la hipotermia, el ratón se coloca sobre una almohadilla térmica. Para inyectar el agente de contraste, se coloca un catéter en la vena de la cola debido a su pequeño tamaño.

Esto es bastante difícil y requiere cierta experiencia. Si la sangre regresa al catéter, se coloca correctamente a través del catéter. Se pueden inyectar agentes de contraste fluorescentes y agentes de contraste para TC para evitar la sobrecarga de volumen.

a lo más. Se deben inyectar cinco mililitros por kilogramo de peso corporal, lo que significa 150 microlitros para un ratón de 30 gramos. Para escanear, el ratón se coloca dentro de una cama de ratón multimodal.

El ratón puede tener algunos símbolos dibujados en la cola para su identificación. Es importante evitar este tipo de cosas en el torso, ya que pueden afectar al escaneo óptico. La cama del ratón se cierra y la profundidad se ajusta para sujetar firmemente el ratón en una posición fija.

Tenga cuidado y controle la respiración, ya que apretar demasiado la cama puede asfixiar al mouse. Los ratones desnudos se utilizan habitualmente para la investigación oncológica debido a su inmunosupresión. El hecho de que estén desnudos es un afortunado efecto secundario de la mutación genética.

Por lo tanto, se puede omitir el laborioso procedimiento de depilación. Se debe comprobar que el ratón respira correctamente y, si es necesario, se debe ajustar la cama del ratón en consecuencia. A continuación, se coloca la cama del ratón dentro del micro ct.

Los tubos que transportan el gas flúor ISO se conmutan para mantener el flujo de gas dentro del dispositivo. A continuación, se cierra el micro C para permitir el blindaje de rayos X. El micro C solo comenzará a escanear si la tapa está cerrada.

Usando los botones del micro ct, el mouse se puede conducir al micro CT.At la computadora de control de la micro ciudad, se adquiere un topograma y se muestra la configuración de las ventanas se ajusta para ver mejor el mouse. Se pueden colocar uno o más escaneos ZUP. Su posición está indicada por las regiones de color azul claro.

Por lo general, de una a tres exploraciones ZUP son suficientes. Después de comenzar el escaneo, el progreso se muestra con barras de progreso de color azul oscuro. Nuestra micro tomografía computarizada de pantalla plana realiza posteriormente exploraciones ZUP, lo que es diferente de una tomografía computarizada espiral clínica.

Con los botones, la cama del ratón se mueve hacia la parte delantera. De nuevo, se abre la tapa protectora y se cambian los tubos de anestesia. El soporte se retira con cuidado de la cama del ratón y se extrae el tubo anestésico.

Esto es necesario porque el AN y el FMT no dependen de este pequeño tubo. En cambio, la pequeña cámara dentro del FMT está inundada con gas anestésico. Ahora la cama del ratón con el ratón se lleva al FMT y se inserta en el ordenador de control del FMT.

Se ajusta el campo de visión de escaneo, así como la densidad de muestreo. Por lo general, se utilizan alrededor de 120 puntos. El escaneo comienza después de presionar un botón.

El primer paso del FMT adquiere una imagen de iluminación trans o excitación para cada punto de fuente láser. En esta película, se muestra en modo de avance rápido. Por lo general, tarda alrededor de cinco minutos.

Se puede ver que pasa mucha menos luz a través de la parte superior del cuerpo en comparación con la parte inferior del cuerpo. Esto se debe a que los órganos con mayor volumen sanguíneo relativo, como el corazón, el hígado y los riñones, están más en la parte superior del cuerpo. La sangre es el principal absorbente de la luz infrarroja cercana.

El segundo paso corre por los mismos puntos de fuente con un filtro diferente, que solo deja pasar la luz fluorescente a través del Capítulo tres, aceite interactivo y segmentación. Para fusionar los datos de ambos dispositivos. Se utilizan marcadores, que están integrados en la cama del ratón.

Los marcadores también son visibles en una imagen de reflexión adquirida por el FMT. Los marcadores son en realidad orificios simples y no necesitan ser rellenados con ningún agente de fluorescencia o contraste de TC. En nuestro instituto, desarrollamos un programa de software que realiza la detección y fusión de marcadores de forma automática.

La forma del ratón, así como los mapas heterogéneos de absorción y dispersión, se estiman automáticamente utilizando los datos de micro CT como se describe en nuestra reciente publicación de Theranostics. Estos parámetros son importantes para la reconstrucción cuantitativa de fluorescencia. Para medir la biodistribución de la fluorescencia, se necesita una segmentación de órganos.

Generamos dicha segmentación de forma interactiva utilizando un software llamado imulitic preclínico desarrollado en nuestro instituto a continuación. Dicha segmentación se muestra en avance rápido y una persona experimentada puede realizarla en alrededor de 10 a 20 minutos. En primer lugar, se carga el conjunto de datos de TC.

Se puede inspeccionar en 3D utilizando una representación de superficie ISO. Al cambiar la configuración de las ventanas, se puede cambiar el valor ISO. Por ejemplo, para visualizar los huesos de todo el cuerpo del ratón con la cama del ratón, se carga la superposición.

La señal para este ejemplo aparece en la vejiga. Ahora la visualización de superposición está desactivada. Concentrarse en la segmentación anatómica.

En las microexploraciones nativas, el pulmón se encuentra fácilmente debido al fuerte contraste negativo con el otro tejido blando. La gran estructura dentro del pulmón es el corazón. Segmentemos primero el pulmón.

Todos los vóxeles por debajo de un determinado valor se segmentan mediante umbrales. Aparece en verde. El pulmón es una región conectada, que se puede separar mediante una operación de llenado.

Similar al cubo de pintura. En un programa de pintura, se puede separar del pulmón mediante corte y relleno. Los órganos convexos, como la vejiga, se pueden segmentar dibujando garabatos para delinear los bordes del órgano.

Se agregarán más garabatos hasta que se alcance una precisión suficiente. Los órganos no convexos, como el intestino, se pueden segmentar pieza por pieza. El hígado aparece como una región homogénea y tiene una estructura más compleja.

Dado que consta de varios lóbulos, la segmentación se puede guardar en el disco y cargar en el programa. Usando tal segmentación, la señal fluorescente se puede asignar a los órganos. El programa calcula estas cantidades y las guarda como una hoja adicional para los escaneos longitudinales, la segmentación debe realizarse nuevamente para cada punto de tiempo, porque los intervalos suelen ser demasiado largos para mantener el mouse anestesiado en una posición fija.

Por lo tanto, la segmentación es una tarea laboriosa si se trata de muchos ratones y muchos puntos de tiempo. Para cuantificar los resultados, cargue una superposición y una segmentación. Haga clic en establecer configuración de lote para permitir que el programa recuerde la configuración actual.

Ahora, haga clic en estadísticas por lotes para decirle al programa que calcule los valores de todas las regiones en todas las micro tomografías computarizadas FMT. Esto tardará unos segundos. Luego, las estadísticas se guardan en un archivo de hoja de cálculo.

Esto es conveniente porque el usuario no tiene que fusionar docenas de archivos por sí mismo. A partir de este archivo, se pueden calcular las curvas de los órganos. Capítulo cuarto, resultados representativos.

Para comprobar que la fusión funciona correctamente, utilizamos un fantasma aros. Se agregó un poco de polvo de exide de titanio para dispersar. Para realizar una forma irregular, cortamos algunas partes.

Varias inclusiones pequeñas rellenas de fluorescencia y agente de contraste CT se incorporaron al fantoma. Dado que el TMF no conoce la forma verdadera del objeto y asume una forma simplificada, la reconstrucción no es precisa para objetos con formas irregulares. Por lo tanto, implementamos otra reconstrucción que utiliza la forma derivada de los datos de la microciudad.

Como puedes ver, la localización de la señal en el phantom es mucho mejor. Para inspeccionar los datos in vivo, repasemos los puntos de tiempo de las imágenes. Este es el escaneo previo.

Lo que vemos es básicamente ruido y artefactos. Si vamos al siguiente punto de tiempo, el que sigue a la inyección, vemos mucha más señal, pero la configuración de las ventanas es demasiado dura. Con el cuadro de diálogo de ventanas, puede ajustar la configuración de las ventanas.

Vemos la mayor parte de la señal en la vejiga. Si vamos a la próxima vez, 0,2 horas después de la inyección, vemos alguna señal fuera del ratón. Esto se debe a que el ratón orinó la fluorescencia en la cama del ratón.

Al ajustar aún más las ventanas, podemos ver alguna señal en la columna vertebral y las rodillas. Ahora vayamos al tiempo 0,4 horas después de la inyección, la señal de la orina ha desaparecido y vemos fluorescencia en la columna vertebral y las rodillas para los próximos puntos de tiempo seis horas y 24 horas después de la inyección. Nosotros vemos lo mismo.

Ahora pasemos a la siguiente nariz. El escaneo previo no muestra nada usando esta configuración de ventanas. La exploración 15 minutos después de la inyección muestra una fuerte señal de vejiga y así sucesivamente.

En este estudio, encontramos altas concentraciones en la vejiga urinaria poco después de la inyección, como consecuencia de la rápida excreción renal de esta sonda. Además, la señal en la columna vertebral se eleva rápidamente y permanece relativamente estable a lo largo de los últimos puntos de tiempo de la imagen. Capítulo quinto, conclusión.

En conclusión, mostramos un protocolo de imagen multimodal para combinar las fortalezas de la fluorescencia, la tomografía molecular y la tomografía microinformática. Los datos anatómicos de la micro TC permiten una reconstrucción de fluorescencia mejorada mediante el uso de la forma del ratón. Además, es útil generar segmentaciones de órganos, que son necesarias para extraer mediciones cuantitativas de los datos de la imagen.