Híbrido de imágenes μCT-FMT y análisis de imágenes

La tomografía mediada por fluorescencia es una técnica de imagen altamente sensible para evaluar cuantitativamente la distribución de la fluorescencia. En ratones anestesiados, existen muchas sondas fluorescentes dirigidas que permiten la obtención de imágenes de la angiogénesis, la apoptosis, la inflamación y otros procesos. En este vídeo, mostraremos cómo se realiza en nuestro instituto la imagen híbrida con FMT y Micro City.

En el capítulo uno, los dispositivos, esto es nuestro F-M-T-F-M-T, que significa tomografía molecular de fluorescencia. Tomografía significa que se generan imágenes tridimensionales. La TMT es altamente sensible para la obtención de imágenes de fluorescencia cercana intrínseca en ratones.

Ahora el panel frontal está abierto para mostrar el interior del FMT. En la parte inferior hay un láser montado en un servomotor 2D. El láser emite luz hacia el ratón, que se mantiene en una camilla para ratones parcialmente transparente.

Encima de la camilla del ratón hay una matriz de LED que sirve como fuente de luz alternativa, lo que permite que la TFM funcione como un dispositivo de imagen de reflectancia convencional. La rueda de filtros está montada debajo del lente, que capta la luz para el detector situado en la parte superior del dispositivo. Este es nuestro micro CT.

El micro-TC está equipado con dos tubos de rayos X y dos detectores de panel plano, lo que permite la adquisición de escaneos de doble energía. Capítulo dos, protocolo de escaneo de micro-TC con FMT. Tanto la FMT como la micro-TC están diseñadas para obtener imágenes de ratones; antes del imagenológico, los ratones se anestesian con isoflurano.

Para el escaneo mediante FMT, es necesario eliminar el vello del ratón, lo cual se realiza eficazmente con la crema de afeitado. Algunas cepas de ratones pueden desarrollar erupciones cutáneas por la crema depilatoria. Por lo tanto, se recomienda monitorear a los ratones en busca de cambios en la piel y contactar al personal veterinario para su atención, si fuera necesario.

Asimismo, pruebe la tolerancia en un lote pequeño de cualquier nueva cepa de ratones al principio. Para evitar la hipotermia, se coloca al ratón sobre una almohadilla calefactora. Para inyectar el agente de contraste, se coloca un catéter en la vena de la cola debido al pequeño tamaño.

Esto es bastante difícil y requiere cierta experiencia. Si la sangre fluye de regreso hacia el catéter, significa que está colocado correctamente a través del catéter. Se pueden inyectar agentes de contraste fluorescentes y agentes de contraste para tomografía computarizada para evitar la sobrecarga de volumen.

Como máximo, se debe inyectar cinco mililitros por kilogramo de peso corporal, lo que equivale a 150 microlitros para un ratón de 30 gramos. Para la exploración, el ratón se coloca dentro de una camilla multimodal para ratones.

Al ratón se le pueden dibujar algunos símbolos en la cola para su identificación. Es importante evitar tales elementos en el tronco, ya que podrían afectar el escaneo óptico. Se cierra la camilla del ratón y se ajusta la profundidad para sujetar firmemente al ratón en una posición fija.

Tenga cuidado y controle la respiración, ya que apretar demasiado la cama puede asfixiar al ratón. Los ratones desnudos se utilizan comúnmente en investigaciones oncológicas debido a su supresión inmunitaria. El hecho de que sean desnudos es un efecto secundario afortunado de la mutación genética.

Por lo tanto, se puede omitir el laborioso procedimiento de eliminación del vello. Se debe verificar que el ratón respire adecuadamente, y si es necesario, se debe ajustar la camilla del ratón en consecuencia. Luego, se coloca la camilla del ratón dentro del micro CT.

Los tubos que transportan el gas de flúor ISO se cambian para mantener el flujo de gas dentro del dispositivo. Luego, se cierra el micro C para permitir el blindaje de rayos X. El micro C solo comenzará a escanear si la tapa está cerrada.

Utilizando los botones del micro-TC, se puede introducir el ratón en el micro-TC. En el ordenador de control del micro-TC, se adquiere una topografía y se muestra; luego se ajustan los parámetros de ventana para visualizar mejor al ratón. Pueden colocarse uno o más escaneos ZUP. Su posición se indica mediante regiones de color azul claro.

Normalmente son suficientes de uno a tres escaneos ZUP. Después de iniciar el escaneo, el progreso se muestra con barras de progreso de color azul oscuro. Nuestro micro-TC con panel plano realiza escaneos ZUP sucesivamente, lo cual es diferente de una tomografía computarizada clínica en espiral.

Utilizando los botones, la camilla del ratón se mueve hacia el frente. Nuevamente, se abre la tapa de protección y se cambian los tubos de anestesia. El soporte se retira cuidadosamente de la camilla del ratón y se extrae el tubo de anestesia.

Esto es necesario porque el AN y el FMT no dependen de este pequeño tubo. En cambio, la cámara pequeña dentro del FMT se inunda con gas anestésico. Ahora, la camilla para ratón con el ratón se lleva al FMT y se inserta en la computadora de control del FMT.

Se ajusta también el campo de visión de exploración, así como la densidad de muestreo. Habitualmente se utilizan aproximadamente 120 puntos. La exploración comienza tras presionar un botón.

El primer pase de la TFM adquiere una imagen de iluminación o excitación transmitida para cada punto fuente de láser. En esta película, se muestra en modo de avance rápido. Normalmente, tarda alrededor de cinco minutos.

Puede observarse que una cantidad mucho menor de luz atraviesa la parte superior del cuerpo en comparación con la parte inferior. Esto se debe a que los órganos con mayor volumen sanguíneo relativo, como el corazón, el hígado y los riñones, se encuentran principalmente en la parte superior del cuerpo. La sangre es el principal absorbedor de la luz infrarroja cercana.

Las segundas ejecuciones utilizan los mismos puntos de origen con un filtro diferente, que solo permite el paso de la luz fluorescente a través del capítulo tres, aceite interactivo y segmentación. Para fusionar los datos de ambos dispositivos, se utilizan marcadores que están integrados en la camilla del ratón.

Los marcadores también son visibles en una imagen de reflexión adquirida por la FMT. Los marcadores son en realidad orificios simples y no necesitan rellenarse con ningún agente de contraste fluorescente o para tomografía computarizada. En nuestro instituto, desarrollamos un programa informático que realiza la detección de marcadores y la fusión de forma automática.

La forma del ratón, así como los mapas heterogéneos de absorción y dispersión, se estiman automáticamente utilizando los datos de micro-TC, tal como se describe en nuestra publicación reciente en Theranostics. Estos parámetros son importantes para la reconstrucción cuantitativa de la fluorescencia. Para medir la biodistribución de la fluorescencia, se requiere una segmentación de órganos.

Generamos dicha segmentación de forma interactiva utilizando un software llamado imulitic preclinical desarrollado en nuestro instituto en lo siguiente. Dicha segmentación se muestra en avance rápido y una persona experimentada puede realizarla en aproximadamente de 10 a 20 minutos. Primero, se carga el conjunto de datos de TC.

Se puede inspeccionar en 3D utilizando una representación de superficie ISO. Al modificar la configuración de la ventana, se puede cambiar el valor ISO. Por ejemplo, para visualizar los huesos de todo el cuerpo del ratón junto con la camilla del ratón, se carga la superposición.

La señal para este ejemplo aparece en la vejiga. Ahora se ha desactivado la visualización superpuesta. Para concentrarse en la segmentación anatómica.

En los escaneos microt de tejido nativo, el pulmón se encuentra fácilmente debido al fuerte contraste negativo con respecto a otros tejidos blandos. La estructura grande dentro del pulmón es el corazón. Vamos a segmentar primero el pulmón.

Todos los vóxeles por debajo de un cierto valor se segmentan utilizando umbralización. Esto aparece en verde. El pulmón es una región conectada, que puede separarse mediante una operación de relleno.

Similar al cubo de pintura en un programa de dibujo, el pulmón puede separarse al cortar y rellenar. Órganos convexos, como la vejiga, pueden segmentarse dibujando garabatos para delimitar los bordes del órgano.

Se pueden agregar más trazos hasta alcanzar una precisión suficiente. Los órganos no convexos, como el intestino, pueden segmentarse pieza por pieza. El hígado aparece como una región homogénea y tiene una estructura más compleja.

Dado que consta de múltiples lóbulos, la segmentación puede guardarse en el disco y cargarse en el programa. Mediante dicha segmentación, la señal fluorescente puede asignarse a los órganos. El programa calcula estas cantidades y las guarda como una hoja adicional para escaneos longitudinales; la segmentación debe realizarse nuevamente para cada punto temporal, ya que los intervalos suelen ser demasiado largos para mantener al ratón anestesiado en una posición fija.

Por lo tanto, la segmentación es una tarea laboriosa si se incluyen muchos ratones y muchos puntos temporales. Para cuantificar los resultados, cargue una superposición y una segmentación. Haga clic en Establecer configuración por lotes para que el programa recuerde la configuración actual.

Ahora, haga clic en estadísticas por lotes para indicar al programa que calcule los valores para todas las regiones en todos los escaneos micro CT FMT. Esto tomará unos segundos. Luego, las estadísticas se guardan en un solo archivo de hoja de cálculo.

Esto es conveniente porque el usuario no tiene que combinar decenas de archivos él mismo. A partir de este archivo, se pueden calcular las curvas del órgano. Capítulo cuatro, resultados representativos.

Para comprobar que la fusión funciona correctamente, utilizamos un fantasma de aros. Se agregó algo de polvo de óxido de titanio para provocar dispersión. Para lograr una forma irregular, recortamos algunas partes.

Se incorporaron varias inclusiones pequeñas llenas de agente de contraste fluorescente y de TC en el fantasma. Dado que la TFM no conoce la forma real del objeto y asume una forma simplificada, la reconstrucción no es precisa para objetos con formas irregulares. Por lo tanto, implementamos otra reconstrucción que utiliza la forma derivada de los datos de micro ciudad.

Como puede observarse, la localización de la señal en el fantasma es mucho mejor. Para examinar los datos in vivo, repasemos los puntos temporales de la adquisición de imágenes. Esta es la exploración previa.

Lo que vemos es básicamente ruido y artefactos. Si pasamos al siguiente punto temporal, el posterior a la inyección, observamos mucha más señal, pero los ajustes de ventana están demasiado altos. Mediante el cuadro de diálogo de ventana, puede ajustar la configuración de ventana.

Observamos la mayor parte de la señal en la vejiga. Si pasamos al siguiente momento, 0,2 horas después de la inyección, vemos algo de señal fuera del ratón. Esto se debe a que el ratón ha orinado la fluorescencia sobre el lecho del animal.

Al ajustar aún más la ventana, podemos observar cierta señal en la columna vertebral y las rodillas. Ahora pasemos al tiempo de 0,4 horas después de la inyección; la señal proveniente de la orina ha desaparecido y observamos fluorescencia en la columna vertebral y las rodillas en los siguientes puntos temporales: seis horas y 24 horas después de la inyección. Observamos lo mismo.

Ahora pasemos al siguiente corte. La preescaneo no muestra nada usando estos ajustes de ventana. El escaneo a los 15 minutos después de la inyección muestra una señal intensa en la vejiga y así sucesivamente.

En este estudio, encontramos altas concentraciones en la vejiga urinaria poco después de la inyección, como consecuencia de la rápida excreción renal de esta sonda. Además, la señal en la columna vertebral aumenta rápidamente y permanece relativamente estable a lo largo de los puntos temporales posteriores de imagen. Capítulo cinco, conclusión.

En conclusión, presentamos un protocolo de imagen multimodal que combina las ventajas de la fluorescencia, la tomografía molecular y la microtomografía computarizada. Los datos anatómicos de micro-TC permiten una reconstrucción mejorada de la fluorescencia mediante el uso de la forma del ratón. Además, resulta útil para generar segmentaciones de órganos, necesarias para extraer mediciones cuantitativas a partir de los datos de imagen.