Name: Funcional hígado humano Conservación y Recuperación de Medios de Subnormothermic máquina de perfusión (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Aprende la perfusión subnormotérmica de hígado humano a 21 °C para preservación y evaluación funcional. Este método permite recuperación metabólica y producción de bilis sin altas demandas energéticas.

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La utilización de tejidos humanos debe ser revisada por un comité de revisión institucional (IRB) o equivalente. El trabajo que se describe aquí fue aprobado y declarado exento por el Hospital de la Junta de Revisión Institucional General de Massachusetts (núm 2011P001496). 1. Preparación de la solución <ol><li> Agregar asépticamente suplementos para rojo fenol libre de Williams &#39;E medio como se indica en la Tabla 1. La solución debe prepararse fresco antes de su uso. La insulina se debe añadir justo antes de su uso. </li></ol> 2. Volver Preparación Tabla del Hígado <ol><li> Publicar un tazón órgano lleno de hielo sobre una superficie estéril, cubierta. Retire el hígado de la caja, dejando en la bolsa de solución de preservación fría. Mantenga el hígado en su mayoría sumergidos. </li><li> Identificar la arteria hepática (HA), que se encuentra distal al parche aórtico. Diseccionar libre la arteria para revelar varias ramas cortadas a lo largo de la longitud con tijeras Metzenbaum. Cuidadosamente dissect toda la longitud de la arteria para evitar la ruptura de un vaso que suministra el hígado. No corte ni atar las ramas que no tienen un final visible. </li><li> Tie fuera de todas las ramas arteriales que no hayan entregado el hígado usando sutura de seda que van desde el tamaño de 0 a 4-0, dependiendo del tamaño de la embarcación. Cerrar ramas que son demasiado cortos para empatar o agujeros en la arteria con una puntada de 7-0 prolene. Lazo y cortó las arterias gástricas esplénica e izquierda cerca de su origen en el tronco celíaco. </li><li> Retire el parche aórtico cortando el tronco celíaco directamente debajo del parche. Cannulate tronco celíaco utilizando la cánula aórtica. </li><li> Identificar la vena porta (VP) y sin rodeos diseccionarlo libre. Ate las ramas y canular el PV con el segmento preparada de tamaño 24 tubos. </li><li> Eliminar secciones de diafragma de la vena cava suprahepática, sin cortar la vena sí mismo. Caudal de salida de los desagües de vena cava directamente en la cámara de órganos. </li><li> Cortar 2 circunferencia-timuestras DICIÓN (2-3 mm de longitud) desde el extremo del conducto biliar común; congelamiento rápido uno en nitrógeno líquido (almacenar a -80 ° C) y almacenar el otro en 10% de formalina tamponada, para el análisis histológico del tejido y, respectivamente. Canular el conducto biliar común con el recipiente de cánula y un tubo de drenaje de tubo de oxigenador de membrana. </li><li> Identificar y ligar el conducto cístico con un empate 0 seda. El conducto cístico se encuentra entre el conducto biliar común y la vesícula biliar. </li><li> Conecte el tubo de descarga fijado a las bolsas de helados de solución de lactato de Ringer (LR) y cebe el tubo, eliminando todo el aire. </li><li> Ajuste el regulador de flujo en la tubería de descarga a un goteo lento. Antes de conectar el tubo de descarga a la cánula de la vena portal, ocluir la vena portal con los dedos en el hilio y llenar la cánula y la vena con lavado para eliminar el aire de la vena portal. No elevar la bolsa de más de 20 cm por encima de la altura del hígado durante el lavado en frío para evitar una presión excesiva sobre lavena. </li><li> Durante el breve ras ocluir el PV en el punto más bajo. Examine el PV de fugas. Ramas del buque pueden cerrarse como se describe anteriormente. Enjuague el hígado a través del PV con un total de 2 L de LR enfriado con hielo. </li><li> Repita los pasos del 2,10, 2,11 para la HA con 1 l de LR. </li></ol> 3. Cebado del Sistema SNMP <ol><li> Primer dispositivo de perfusión mediante la adición de 2 L de líquido de perfusión (21 ° C) a la taza del órgano y de iniciar el dispositivo para cebar el tubo. Siga las instrucciones del dispositivo para prepararse para la perfusión, ajustar la temperatura a 21 ° C. Comience con presiones de 3 mmHg y 30 mmHg en el PV y HA, respectivamente. Abra el tanque de gas y establecer a un flujo de 3 L / min. </li><li> Tomar una muestra de gases en sangre tanto de la entrada de HA y PV dibujando una muestra de 0,3 ml a partir de los puertos de muestreo y ejecutarlo en la máquina de análisis de gases en sangre de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Confirme la oxigenación adecuada (PO 2&gt; 700 mmHg) y pH (7,35-7,45). </li><li> Antes de que el hígado está conectado tomar una muestra del líquido de perfusión 1,0 ml como a = 0 medición en un tubo Eppendorf y se almacena a -80 ° C. Corta dos ± 250 biopsias de cuña mg de hígado usando una cuchilla de acero de un solo filo; complemento congelar uno en nitrógeno líquido (conservar a -80 ° C) y almacenar la otra en formalina al 10%. Pesar el hígado antes de la perfusión. </li></ol> 4. hígado humano de perfusión <ol><li> Transferir el hígado para el dispositivo. Conecte la entrada PV a la cánula PV, después de eliminar el aire del PV como en el paso 2.10. Conectar el HA de una manera similar. Establezca PV y la presión HA a 3 y 30 mmHg. El hígado se debe casi sumergido por perfusión. Cubra cualquier superficies secas, incluyendo los vasos de flujo de entrada, con una gasa estéril húmedo para prevenir la deshidratación </li><li> Dejar escurrir el tubo de bilis en un contenedor de recogida. Asegúrese de que la apertura de la fuga de bilis está en el nivel del hígado o inferior para permitir la bilis para ejecutar out libremente. </li><li> Caudales Target son 275-325 ml / min.kg y 50-100 ml / min.kg para el PV y HA respectivamente una vez que el hígado se ha calentado a 21 ° C. Puesto que cada hígado reacciona de manera diferente a la perfusión, controlar el flujo de cerca durante los primeros minutos. Aumente o disminuya la presión sobre cualquiera de los buques, si no se alcanzan las velocidades de flujo objetivo. No exceda de 50 mmHg en la HA y 5 mmHg en el PV. </li><li> Se pueden tomar muestras de tejido del hígado, perfundido y la bilis en la preferencia de los investigadores. Se recomienda como mínimo la siguiente régimen de recogida de muestras durante la perfusión. <ol><li> Biopsias de tejido, n = 2 x 250 mg, cada hora. Almacenamiento: snap congelar uno en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C a largo plazo. Además, tome otra biopsia antes y después de la perfusión y fijar en el 10% formalina tamponada (n = 1) </li><li> Las muestras de perfusado, n = 2x 1 ml, cada 15 min durante la primera hora y cada 30 min a partir de entonces. Extraer muestras de la inf PVbajo puerto de la muestra. Almacenamiento: -80 ° C a largo plazo. </li><li> Análisis de gases en sangre de PV y HA entrada y salida de la vena cava. n = 3 x 0,3 ml, cada 30 min. Extraer muestras tanto de la PV y puertos de muestreo HA. Dibuje una muestra de 0,3 ml de la vena cava mediante la inserción de una jeringa en la vena y ejecutar directamente en el analizador de gases en sangre. Utilice la salida para asegurar la oxigenación y pH adecuado. </li><li> La producción de bilis, n = 1 x 1 ml, cada hr. Visualmente cuantificar la producción de bilis cada hora y tomar una muestra del recipiente de recogida. Renovar el contenedor después del muestreo. Almacenamiento: hielo seco y -80 ° C a largo plazo. </li></ol></li><li> Continuar la perfusión durante 3 h. Control de la presión, el pH y la oxigenación y la toma de muestras en todas partes. Ajustar el pH mediante la adición de él bicarbonato de sodio al perfundido. </li><li> Al final de la perfusión tomar las muestras finales mientras que el hígado se perfundió. Desconecte el hígado y retire la cánula de la vía biliar. Tomar 2 muestras de tejido post-perfusión delconducto biliar como se ha descrito antes para el almacenamiento a -80 ° C y en formalina al 10%. </li><li> Deseche el hígado humano siguiendo las pautas de eliminación de riesgo biológico adecuado. </li></ol>

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Drs. SE Uygun, K Uygun y Yarmush son inventores de una patente pendiente que es relevante para este estudio (WO / 2011/002926), y los Dres. SE Uygun, K Uygun y Yarmush son inventores de una patente pendiente que es relevante para este estudio (WO / 2011/35223). Drs. K Uygun y Bruinsma tienen una solicitud de patente provisional relacionada con este trabajo. Dr. K Uygun y BE Uygun tienen un interés financiero en Soluciones de órganos, una empresa enfocada en el desarrollo de la tecnología de preservación de órganos. Dr. K Uygun y SER intereses de uygun son administrados por el MGH y Partners HealthCare en función de su situación de conflicto de intereses políticas.

En un intento de recuperar hígados heridos durante la isquemia hemos desarrollado un sistema SNMP que se puede emplear después de un período de almacenamiento en frío. Máquina de perfusión Subnormothermic ofrece una alternativa viable para el almacenamiento en frío convencional, así como las modalidades de la máquina de perfusión hipotérmica y normotérmicos. Existen varios sistemas diferentes; todos ofrecen diferentes ventajas y desventajas 3,9,20. SNMP permite la perfusión sin un portador de oxígeno, como las demandas de oxígeno del metabolismo en 21 ° C se reunió por la oxigenación activa de la perfusión. Aunque se ha reducido en condiciones subnormothermic, el metabolismo es importante y requiere el apoyo de una solución de perfusión rica en nutrientes. Disoluciones de perfusión tradicionales, tales como la solución de Belzer máquina de perfusión, son generalmente mínimo en la composición y están diseñados para la perfusión fría. Williams &#39;Medium E se ha utilizado como un medio de cultivo de hepatocitos durante muchos años, y contiene cOMPONENTES que son universales para apoyar la función celular, en particular bajo condiciones cálidas ex vivo. Las mediciones realizadas durante la máquina de perfusión son un reflejo de la función del órgano. Parámetros directamente observables, tales como la producción de bilis y el consumo de oxígeno son mediciones en tiempo real que pueden ser utilizados para evaluar el hígado pre-trasplante. Del mismo modo, los marcadores de la lesión celular y la isquemia (K +, la liberación de lactato) se pueden medir directamente en la solución de perfusión y pueden ser indicativos de la función del órgano 20. Como la tecnología de máquina de perfusión desarrolla y logra aplicación clínica más generalizada, las correlaciones precisas entre ex vivo la función y el resultado clínico se pueden hacer y parámetros de perfusión serán útiles en ayudar a las decisiones de trasplantar o rechazar hígados calidad marginal. Además, como punto de atención herramientas analíticas adelantado, un análisis más sofisticado estará disponible directamente en la máquina perfusión 21. En este trabajo se muestra que el hígado se pueden apoyar en el sistema SNMP con mínima lesión al hígado, que se refleja por la histología y la liberación de ALT. La recuperación funcional del hígado se refleja mejor por el ATP, que se ha demostrado que se correlaciona con la viabilidad de hígado y es fuertemente sugestivo de éxito del trasplante en modelos animales 22. Ex vivo y recuperación previa al trasplante de injertos de hígado permitiría una expansión significativa del donante piscina hígado, corregir la disparidad entre la oferta y la demanda de hígados de donantes en el trasplante.

El trasplante hepático es el único tratamiento curativo para decenas de miles de pacientes que sufren de enfermedad hepática terminal. Para facilitar el éxito del trasplante, la preservación óptima del hígado desde el momento en que se adquirió desde el donante hasta el momento en que se implanta en el receptor es necesario para evitar el rápido deterioro del injerto. El estándar actual para la conservación del hígado se denomina &#39;almacenamiento en frío estático&#39;: el hígado se enfría en una solución de conservación en refrigeración con hielo, reduciendo así el metabolismo del hígado y ralentizar los efectos deletéreos de la isquemia. Aunque esta técnica de almacenamiento en frío ha permitido el éxito del trasplante, los órganos de calidad marginal, como órganos DCD dañados por la isquemia caliente o esteatosis paciente muestran resultados inferiores 1. Hay un cuerpo de rápida expansión de evidencia de que la máquina de perfusión ex vivo de los injertos de hígado como una modalidad alternativa de preservación puede potencialmente improbar los resultados para estos órganos marginales 2,3. El trasplante de hígado se ha convertido en una víctima de su propio éxito. Muchos más pacientes son remitidos para trasplante que hay hígados disponibles, y miles de personas mueren en lista de espera en los Estados Unidos cada año. Teniendo en cuenta la realidad de la escasez de donantes de hígado y la creciente utilización de injertos de hígado de calidad subóptima para los beneficiarios necesitados, se sostiene ampliamente que ex vivo máquina de perfusión de los injertos hepáticos antes de la implantación mantiene la promesa de un cambio de paradigma en el trasplante hepático. Ha habido un marcado aumento en interés de la investigación en este tema en los últimos años 4-8. En diversos centros europeos y norteamericanos máquina de perfusión hipotérmica ha hecho una introducción 8 y normothermic máquina de perfusión clínica a temperaturas fisiológicas se ha aplicado recientemente a hígados humanos desechados y está siendo traducido al uso clínico y 9.Extenso desarrollo ha llevado al desarrollo de diversos protocolos, mientras que la optimización continua identifica parámetros de la perfusión óptima 10-12. El uso de injertos de calidad marginal se ha incrementado más de 10 veces en la última década 13. Cuando se compara con el estándar actual para la preservación del hígado (almacenamiento en frío estática), la perfusión ex vivo máquina proporciona numerosos beneficios potenciales, todos los que dan lugar a la tan necesaria ampliación de la piscina de órganos y un potencial disminución de la incidencia de complicaciones post-trasplante. En particular, las complicaciones biliares que afectan actualmente injertos de hígado calidad subóptima después del trasplante siguen siendo una cuestión sustancial 14-18. Máquina de perfusión en condiciones subnormothermic ofrece una ventana de tiempo para evaluar la función del injerto más objetiva a la idoneidad para el trasplante 19. Mientras que el hígado se perfundió en un circuito ex vivo, tanto el perfundido unand la bilis producida durante la perfusión se puede muestrear para la medición de los marcadores de la función del órgano. De esta manera &#39;seriamente comprometida&#39; hígados que se descartan para el trasplante, según los criterios actuales se pueden evaluar de manera objetiva en cuanto a su idoneidad para el trasplante. Evaluación de la viabilidad potencialmente permite para muchos de estos órganos para ser utilizada para el trasplante. Un igualmente poderoso beneficio de máquina de perfusión es la reparación y mejora de los hígados que han sido dañados por la isquemia caliente / frío. ATP se agota muy rápidamente durante el calentamiento y posterior isquemia fría y se puede repleted durante un período de máquina de perfusión antes de la implantación del hígado 20. El hígado, con sus reservas de energía y estado metabólico repone, se preacondicionará y mejor preparados para los efectos perjudiciales de la lesión por reperfusión después de la implantación en el receptor. Este trabajo describe un método ex vivo máquina de perfusión de graf hígado humanots en el laboratorio, lo que será útil para los investigadores que deseen estudiar tanto la técnica y los efectos beneficiosos de la perfusión ex vivo máquina. Hacemos uso de hígados de donantes humanos que se han disminuido para el trasplante y luego son asignados para fines de investigación. Técnica de la contratación hígado estándar implica en ras arterial in situ del hígado tras el pinzamiento aórtico en donantes con muerte cerebral (DBD) o después de la parada circulatoria en donantes circulatorios muerte (DCD), que se describen en más detalle en otra parte 20. Además, el hígado se enfría durante la adquisición llenando la cavidad abdominal del donante con hielo. Preferencias solución de lavado varían entre regiones, con la mayoría de contratación con la Universidad de La histidina-triptófano-cetoglutarato (HTK) solución de Wisconsin o. Un back-ras tabla adicional de la vena portal mejora la de lavado de la sangre residual. Los hígados son a menudo adquiridos dejando un sur segmento aórticoredondeo del tronco celíaco. La vesícula biliar se realiza una incisión, la bilis se aspira, y el conducto biliar se vacía. Los hígados se empaquetan en bolsas estériles que contienen solución de preservación en frío con hielo y se transportan en cajas o enfriadores designados. Para obtener resultados representativos cálido y frío tiempo de isquemia se debe limitar a 60 minutos y 12 horas, respectivamente. A pesar de un control serológico de rutina para los patógenos transmisibles, se deben tomar las precauciones normales al manejar los órganos humanos, las muestras obtenidas de órganos humanos, y cualquier producto de desecho. El protocolo aquí se describe la máquina de perfusión subnormothermic usando un dispositivo de perfusión del hígado disponible comercialmente. El uso de un dispositivo de este tipo permite una traducción más rápida para el entorno clínico y de validación cruzada de los diferentes protocolos y la configuración del dispositivo entre grupos de investigación y centros de trasplante.

<table><tbody><tr><td>Dispositivo de perfusión Liver Assist</td><td>Organ Assist B.V.</td><td>Liver Assist</td><td></td></tr><tr><td>Set desechable Liver Assist</td><td>Organ Assist B.V.</td><td>Liver Assist desechable</td><td></td></tr><tr><td>Williams' Medio E</td><td>Sigma</td><td>W1878&ndash; 6x500ml</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Eli Lilly & Co</td><td>Humulin R U-100</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina 5.000 U/ml</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-156</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Farmacia MGH</td><td>7750500</td><td></td></tr><tr><td>Tanque de gasolina de carbógeno 95% O2/5% CO2</td><td>Airgas</td><td>ZO2OX9522000043</td><td></td></tr><tr><td>Regulador de gases especiales</td><td>Airgas</td><td>Y11244D580</td><td></td></tr><tr><td>Lactated Ringer' s solución</td><td>Baxter</td><td>2B2324X</td><td></td></tr><tr><td>10% formal tamponado neutro</td><td>Fischer Scientific</td><td>316-155</td><td></td></tr><tr><td>Pinza Adson dentada</td><td>Roboz</td><td>RS-5234</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de tejido Debakey, 7,75", 2,25 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-7562</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Metzenbaum 7" Curvado SureCut Tungsteno</td><td>Roboz</td><td>RS-6965SC</td><td></td></tr><tr><td>Portaagujas Castroviejo 5.5&ndash; 7"</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>0 suturas de seda trenzada negra</td><td>Ethicon</td><td>SA66G</td><td></td></tr><tr><td>4-0 sutura de nylon, Nurolon RB1</td><td>Ethicon</td><td>C554D</td><td></td></tr><tr><td>máquina de análisis de gases en sangre</td><td>Siemens</td><td>RapidPoint 500</td><td></td></tr><tr><td>Báscula de equilibrio</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-10000-12</td><td></td></tr><tr><td>Caja de visualización de presión</td><td>Medtronic</td><td>66000</td><td></td></tr><tr><td>Conjuntos de indicadores de presión desechables</td><td>Medtronic</td><td>61000</td><td></td></tr><tr><td>Termómetro y sonda de termopar de mano</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-91500-04 y EW-08516-55</td><td></td></tr><tr><td>Cánula de recipiente con punta de bellota, 4 mm</td><td>Medtronic</td><td>30005</td><td></td></tr><tr><td>Juego de riego tubo de descarga</td><td>Hospira</td><td>06543-01</td><td></td></tr><tr><td>Tazón de mezcla, 4 L</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07300-40</td><td></td></tr></tbody></table>

funcional hígado humano conservación y recuperación de medios de subnormothermic máquina de perfusión

Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion

Actualmente hay una grave escasez de injertos hepáticos disponibles para trasplante. Se necesitan nuevas técnicas de preservación de órganos para ampliar el grupo de hígados de donantes. La perfusión mecánica de injertos de hígado de donante es una alternativa al almacenamiento tradicional en frío de hígados y es muy prometedora como modalidad para ampliar el grupo de órganos de donantes. Recientemente hemos descrito el beneficio potencial de la perfusión con máquina subnormotérmica de hígados humanos. Los hígados perfundidos a máquina mostraron una mejora de la función y la restauración de los niveles tisulares de ATP. Además, la perfusión mecánica de injertos hepáticos a temperaturas subnormotérmicas permite una evaluación objetiva de la funcionalidad e idoneidad de un hígado para el trasplante. De esta manera, un gran número de hígados que se descartaron previamente debido a su calidad subóptima pueden ser rescatados a través de los efectos restauradores de la perfusión mecánica y utilizados para el trasplante. Aquí describimos en detalle esta técnica de perfusión de máquina subnormotérmica. Los injertos hepáticos humanos asignados a la investigación se perfunden a través de la arteria hepática y la vena porta con una perfusión oxigenada acelular a 21 °C.

Una serie de observaciones y análisis se puede realizar en el hígado durante la perfusión, incluyendo observaciones en tiempo real directos, como las tasas de flujo y la producción de bilis; mediciones en tiempo real, tales como el análisis de gas de la perfusión, y las mediciones post-hoc que se realizan después de la recogida de la muestra incluyendo el análisis bioquímico del perfundido y el tejido y el análisis histológico. Resultados mencionados aquí son de 22 hígados humanos perfundidos. Los hígados fueron rechazados para el trasplante, por diversas razones, incluyendo la edad del donante, excesivo tiempo de isquemia caliente, resultados de la biopsia (esteatosis, inflamación, fibrosis) y por razones logísticas. 18 hígados fueron adquiridos después de la muerte cardiaca y 4 después de la muerte cerebral. En ambos casos, los donantes se pretrataron con 30 000 unidades de heparina y se lavó abundantemente in situ y en la mesa del fondo con solución UW. Tiempo de isquemia fría medio fue de 531 ± 237 (SD) min y el tiempo medio cálido isquémico fue 27 ± 10 (SD) min, medido a partir de la retirada de la vidaapoyo a ras frío. Observaciones en tiempo real y las mediciones se pueden utilizar para evaluar el hígado durante la perfusión, mientras que las mediciones post-hoc se revelaron después de la perfusión. Observaciones en tiempo real Flujo a través del hígado comienza inferiores a las tasas de flujo objetivo, como resultado de una mayor resistencia en el hígado frío. Usando una presión de 3 mmHg en el PV y 30 mmHg en el HA de los flujos de objetivo se puede conseguir generalmente una vez que el hígado se ha calentado hasta 21 &#160; ° C después de 60 minutos de perfusión (Figura 1A). El flujo biliar generalmente se puede observar dentro de 10 min de perfusión y se produce de manera constante durante la perfusión (Figura 1B). La bilis cantidad depende de la calidad del hígado y oscila entre 0,3 ml / h / kg de hígado de 18 ml / min / kg. En hígados con mayor tiempo de isquemia caliente, el flujo de la bilis tenderá a disminuir, mientras más cortos calientes resultados en tiempo de isquemia en un más estable o incluso ha aumentadola producción de bilis. Mediciones en tiempo real La medición directa y frecuente del perfundido por análisis de gases en sangre en esencial tanto para fines experimentales, así como el mantenimiento de condiciones de perfusión adecuados, de manera importante la oxigenación y pH. Presión parcial de oxígeno disuelto debe ser mayor de 700 mmHg en la entrada tanto de la PV y HA. Presión de oxígeno de salida, medido en la vena cava, generalmente disminuye con la perfusión más tiempo, lo que refleja un aumento de la absorción de oxígeno. Las tasas de captación de oxígeno pueden calcularse como se ha descrito previamente 13 y osciló desde 0,5 hasta 2,2 ml O 2 / min / kg al comienzo de la perfusión de 2.4 a 9.7 ml O2 / min / kg en t = 3 horas (Figura 1C). Una gota en el pH se observa en la primera 30 min (Figura 1D), principalmente como resultado de la liberación de lactato en el perfundido. Esto puede ser apoyado por la suplementación con 8,4% bicarbo sodionate y después de unos 90 minutos, el pH cae de nuevo en rango normal. Comúnmente, se requiere 30 a 50 ml de 8,4% de bicarbonato de sodio. Aumenta la concentración de lactato rápidamente en los primeros 15 a 30 minutos, pero comienza a decease después de la primera hora (Figura 1E). Mediciones post-hoc Transaminasas hepáticas tales como ALT se pueden medir en el perfundido. En los primeros 30 minutos de un gran aumento de la ALT se observa en general que refleja el lavado de ALT que fue lanzado durante la isquemia (Figura 1F). ALT mostró una buena correlación con el tiempo de isquemia caliente 13. Máquina de perfusión se incrementó el contenido de ATP 2,8 veces, lo que refleja un estado de recuperación de energía (Figura 1G). H &amp; E análisis histológico revela ninguna lesión adicional sostenida durante máquina de perfusión (Figura 1 H, I). Cabe señalar que el régimen de biopsia propuesto en este protocolo es para resfines earch y pueden no ser aplicables para fines clínicos. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52777/52777fig1.jpg" /> Figura 1:. Evaluación de hígados humanos durante máquina de perfusión de flujo a través de la PV y HA durante SNMP (A), la producción de bilis, cuantificado por hora de perfusión (B), la tasa de aumento de potencia de oxígeno (OUR), calculada a partir de la diferencia en el flujo de entrada (PV + HA) y de salida (vena cava), interrumpieron líneas muestran las presiones parciales de oxígeno en la entrada y salida durante la perfusión (C), el pH y el lactato durante la perfusión (D, E), liberación de ALT en el líquido de perfusión (F), ATP contenido medido en el tejido a partir de biopsias por hora (G) y H &amp; E manchas del hígado (54 años de edad DCD, 19 min de isquemia caliente, 559 min de isquemia fría) antes (H) y después (I) de perfusión. Los resultados se presentan como media ± SEM. <ahref = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52777/52777fig1large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Se describe un método ex vivo de la máquina de perfusión de injertos de hígado humano a temperatura subnormothermic (21 ° C).

Funcional hígado humano Conservación y Recuperación de Medios de Subnormothermic máquina de perfusión

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation.  Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of ...

El objetivo general de este procedimiento es realizar una máquina térmica subnormal, perfusión del hígado humano para la preservación, recuperación y evaluación del órgano. En un entorno de investigación preclínica, esto se logra primero preparando el hígado para su conexión al dispositivo. En el segundo paso, se ceba el sistema de perfusión por máquina, se conecta el hígado y se inicia la perfusión en el paso final. El hígado perfundido mediante máquina se volverá funcionalmente activo en un estado térmico subnormal y producirá bilis. En última instancia, las muestras recogidas del hígado durante la perfusión pueden analizarse para estudiar la recuperación metabólica y la función del órgano. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos de preservación existentes, como la perfusión en frío y la perfusión térmica normal, es que la perfusión en máquina térmica subnormal permite la recuperación funcional y la evaluación de la viabilidad del hígado, sin necesidad de satisfacer las altas demandas metabólicas de la perfusión a temperatura corporal.Muchos aspectos de esta técnica requieren experiencia o una demostración para su correcta realización. Por ejemplo, resulta útil una demostración sobre cómo realizar la preparación en mesa fría del hígado, que incluye la disección de la arteria, la vena y el conducto biliar, especialmente para investigadores sin entrenamiento quirúrgico previo. Al recibir el hígado, coloque un recipiente para órganos lleno de hielo sobre una superficie estéril cubierta con campo quirúrgico y saque el hígado de la caja de transporte, manteniéndolo mayormente sumergido en la bolsa con solución fría de preservación. A continuación, utilice tijeras Metzenbaum para exponer las distintas ramas del suministro arterial al hígado, desde la aorta hasta la arteria hepática propia.Luego, disecar cuidadosamente el resto de la arteria para evitar seccionar cualquier vaso que suministre al hígado, sin cortar ni ligar ramas que no tengan un extremo visible. Una vez aislada la arteria, utilizar suturas de seda de calibre cero a cuatro cero para ligar todas las ramas arteriales que no suministren al hígado. Ligar y cortar las arterias esplénica y gástrica cerca de su origen en el tronco celíaco.Corte un parche aórtico alrededor del tronco celíaco. Luego, utilice una cánula de perfusión arterial para canular el tronco celíaco. A continuación, diseccione libre la vena porta, ligando cualquier rama o suturando orificios en la vena, y cánulela con una cánula de perfusión para la vena porta.Retire secciones del diafragma desde la vena cava suprahepática sin cortar la vena misma. Luego, corte dos muestras de tejido de dos a tres milímetros de longitud y circunferencia completa desde el extremo del conducto biliar común. Las muestras deben manipularse con delicadeza.Congele rápidamente una muestra en nitrógeno líquido para su almacenamiento a menos 80 grados Celsius, y almacene la otra en formalina tamponada al 10%. A continuación, canule el conducto biliar común con una cánula para vasos y conecte un tubo de drenaje hecho de tubo de pequeño diámetro. Luego, ligue el conducto cístico con una ligadura de seda número cero.Conecte el conjunto de tubos de lavado a bolsas de solución de Ringer con lactato enfriadas con hielo y purgue los tubos para eliminar el aire. Ajuste el regulador de flujo del tubo de lavado a un goteo lento y ocluya la vena porta en el hilio para eliminar cualquier aire presente en el vaso. A continuación, llene la cánula en la vena con la solución de lavado para extraer el aire de la vena porta, teniendo cuidado de no elevar la bolsa más de 20 centímetros por encima de la altura del hígado, para evitar una presión excesiva sobre la vena.Luego, lave el hígado con un total de dos litros de solución fría de Ringer con lactato ICEC. Durante el lavado, ocluya brevemente la vena porta en el punto más bajo para verificar fugas, y luego repita el lavado para la arteria hepática con un litro de solución como se acaba de demostrar. Mientras el hígado se está lavando, prepare el sistema de perfusión añadiendo dos litros de perfusión a temperatura ambiente ocho al recipiente del órgano e inicie el dispositivo para cebado de los tubos. Ajuste la temperatura a 21 grados Celsius.Luego, establezca una presión de tres milímetros de mercurio en la vena porta y de 30 milímetros de mercurio en la arteria hepática. Abra el tanque de gas carbógeno y ajústelo a un flujo de tres litros por minuto. A continuación, tome una muestra de gas sanguíneo de los puertos de muestreo de entrada de la vena porta y de la arteria hepática, y analice las muestras en el equipo de análisis de gases sanguíneos según las instrucciones del fabricante para confirmar una oxigenación y pH adecuados.Utilice bicarbonato de sodio o ácido clorhídrico para corregir el pH según sea necesario. Luego, antes de conectar el hígado, recoja una muestra de un mililitro del perfusado como una medición de tiempo cero y almacénela a 80 grados centígrados bajo cero. Utilice una hoja de acero de filo único para cortar dos biopsias en forma de cuña de aproximadamente 250 miligramos cada una del hígado en este momento también.Congele rápidamente una muestra en nitrógeno líquido para su almacenamiento a menos 80 grados Celsius y fije la otra en formalina tamponada al 10 %. Antes de comenzar la perfusión, pese el hígado, luego transfiera el órgano a la cámara del órgano del dispositivo y retire el aire de las cánulas. Como se acaba de demostrar.Una vez que las cánulas estén colocadas, conecte las entradas de la vena porta y la arteria hepática a las cánulas correspondientes. Inicie la perfusión y asegúrese de que el hígado esté sumergido en el perfusato; cubra cualquier superficie seca, incluidos los vasos de entrada, con gasa estéril húmeda. Para prevenir la deshidratación, permita que el tubo biliar drene en un recipiente de recolección.Asegurándose de que la abertura del drenaje biliar esté al nivel del hígado o más baja para permitir que la bilis fluya libremente. Una vez que el hígado alcance 21 grados Celsius, dirija los caudales a entre 275 y 325, y entre 50 y 100 mililitros por minuto por kilogramo para la vena porta y la arteria hepática, respectivamente. Durante la perfusión, tome muestras del tejido hepático perfundido y de la bilis según sea apropiado.Continúe la perfusión durante tres horas, monitoreando la presión, el pH y la oxigenación, y ajustando el pH con bicarbonato de sodio según sea necesario. Al final de la perfusión, recoja las muestras finales, desconecte el hígado y retire la cánula del conducto biliar. Finalmente, recoja dos muestras de tejido posteriores a la perfusión del conducto biliar como se acaba de demostrar y deseche el hígado humano.Tras seguir las pautas adecuadas de eliminación de riesgos biológicos. El flujo comienza bajo como resultado de una mayor resistencia en el hígado frío, utilizando una presión de tres milímetros de mercurio en la vena porta y 30 milímetros de mercurio en la arteria hepática. Generalmente, se pueden alcanzar los flujos objetivo una vez que el hígado se ha calentado hasta 21 grados Celsius tras 60 minutos de perfusión. La medición frecuente del perfusado mediante análisis de gases en sangre es esencial tanto para fines experimentales como para mantener condiciones adecuadas de perfusión.Por ejemplo, la presión parcial de oxígeno disuelto debe ser mayor de 700 milímetros de mercurio en la entrada tanto de la vena porta como de la arteria hepática. Mientras que la presión de oxígeno en la salida, medida en la vena cava, generalmente debería disminuir con una perfusión más prolongada, lo que refleja una mayor captación de oxígeno. Las transaminasas hepáticas también se pueden medir en el PERFU ocho, por ejemplo.Generalmente se observa un aumento de alanina, transaminasa o una LT en los primeros 30 minutos de la perfusión, con un incremento mínimo adicional durante el resto del procedimiento. La evaluación adicional de la producción de ATP en hígados perfundidos mediante máquina revela un aumento de 2,8 veces en el contenido de ATP hepático, lo que refleja un estado energético en recuperación. Además, el análisis histológico con hematoxilina y eosina revela la ausencia de lesiones adicionales sufridas durante el procedimiento.Este procedimiento permite un análisis exhaustivo del hígado aislado, proporcionando conocimientos únicos sobre la fisiología y la patología hepática. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo mantener un hígado humano durante la perfusión mecánica suberica para facilitar la evaluación de su función fuera del cuerpo.

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Research

Investigación

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Medicine

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Injertos marginales, tales como hígados grasos, los injertos procedentes de donantes de edad avanzada, o hígados recuperados después de la muerte cardíaca (DCD) toleran el almacenamiento estático convencional, fría solamente mal. Hemos desarrollado un novedoso modelo de subnormothermic vivo de perfusión ex hígado para su conservación, evaluación y reparación de los injertos hepáticos marginales antes del trasplante.

Técnica de Subnormothermic<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusión hepática para el Almacenamiento, Evaluación y Reparación de marginales injertos hepáticos

Aquí se presenta un protocolo que describe ex situ oxigenada máquina de perfusión de los injertos de hígado de donantes. Este artículo contiene un paso a paso el protocolo para adquirir y preparar el injerto hepático para la máquina de perfusión, preparar el líquido de perfusión, cebar la máquina de perfusión y realizar oxigenada máquina de perfusión normotérmica del injerto hepático.

Ex Situ Normotérmica máquina de perfusión de hígados de donantes

Hay una escasez de donantes de hígado significativa, y se han ampliado los criterios de los donantes de hígado. Perfusión normotérmica ex vivo hígado (NEVLP) ha sido desarrollada para evaluar y modificar la función del órgano. Este estudio muestra un modelo de rata de NEVLP y pone a prueba la capacidad de pegilado-catalasa, para mitigar la lesión hepática de preservación.

Un pequeño modelo de la perfusión hepática normotérmica Ex Vivo

El modelo porcino de máquina de perfusión normotérmica hepática (NMP), descrito aquí, se puede utilizar con éxito para estudiar la NMP como estrategia de preservación, una herramienta para la evaluación de la viabilidad y una plataforma para la reparación de órganos. Tiene un alto valor traslacional, sin embargo, es técnicamente desafiante y requiere mucha mano de obra.

Perfusión hepática aislada normomermica porcina

Se creó un sistema normotérmico de perfusión hepática ex vivo (NEVLP) para hígados de ratón. Este sistema requiere experiencia en microcirugía, pero permite resultados de perfusión reproducibles. La capacidad de utilizar hígados de ratón facilita la investigación de vías moleculares para identificar nuevos aditivos de perfusión y permite la ejecución de experimentos centrados en la reparación de órganos.

Normothermic ex vivo liver machine perfusión en ratón

Este protocolo describe la metodología para establecer un modelo porcino que utiliza perfusión mecánica (MP) a temperatura variable controlada para la preservación del hígado del donante, seguido de un trasplante hepático ortotópico (OLTx). Su objetivo es promover la tasa de éxito de OLTx utilizando la donación de hígado después de la muerte circulatoria (DCD) de un donante y establecer un modelo estable.

Preservación del hígado de donación porcina después de la muerte circulatoria (DCD) por perfusión y trasplante hepático ortotópico

Aquí, presentamos un protocolo para un sistema de perfusión ex vivo normotérmico modificable de código abierto diseñado para superar el alto costo y la flexibilidad limitada de las plataformas existentes, lo que permite un uso más accesible, rentable e iterativo en la investigación biomédica preclínica.

Un sistema de perfusión normotémica de código abierto diseñado para científicos investigadores

El propósito es presentar un nuevo método, la respiración de control de la estimulación eléctrica (BreEStim) para la gestión del dolor neuropático y espasticidad.

Respiración controlada por la estimulación eléctrica (BreEStim) para el manejo del dolor neuropático y espasticidad

Los mecanismos que conducen al desarrollo de hiperplasia de la íntima (IH) y la insuficiencia injerto de vena son aún poco conocidos. Este estudio describe un sistema ex vivo para perfundir venas humanos bajo flujo y presión controladas. Además, la eficiencia de refuerzo de malla externa para limitar el desarrollo de la IH se evaluó.

Procedimiento para safena humana Venas Ex Vivo Perfusión y refuerzo externo

Aquí, presentamos un protocolo para realizar una perfusión hepática aislada (IHP) con melfalán y también discutimos la IHP como una opción de tratamiento para las metástasis hepáticas del melanoma uveal.

Aislado hepática de perfusión como un tratamiento para las metástasis hepáticas de melanoma uveal

Aprende la perfusión subnormotérmica de hígado humano a 21 °C para preservación y evaluación funcional. Este método permite recuperación metabólica y producción de bilis sin altas demandas energéticas.

Funcional hígado humano Conservación y Recuperación de Medios de Subnormothermic máquina de perfusión

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