Alto Rendimiento de medición de ADN extracelular de salida y la formación neta cuantitativa en neutrófilos humanos In Vitro

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar las trampas extracelulares de neutrófilos, o NET, liberadas por neutrófilos humanos a una escala de alto rendimiento. Los métodos presentados aquí pueden ayudar a responder preguntas clave en los campos de la inflamación y la alteración de las enfermedades inflamatorias a través del estudio del mecanismo y la regulación de la formación de trampas extracelulares de neutrófilos in vitro en neutrófilos humanos. Las implicaciones de esta técnica implican la identificación de una vía de señalización mediadora central de NET y moléculas inhibidoras o estimulantes de NET.

Para aislar los neutrófilos de la sangre, se colocan 20 mililitros de sangre humana en tubos cónicos de 250 mililitros. Agregue 10 mililitros de dextrano al 6%, luego mezcle suavemente y deje reposar las soluciones a temperatura ambiente durante 20 minutos. Transfiera con cuidado la fase superior rica en leucocitos a tubos cónicos limpios de 50 mililitros y use PBS estéril para llenar el tubo hasta la parte superior.

A continuación, centrifugar la muestra a 400 veces G durante diez minutos y utilizar 15 mililitros de PBS estéril para resuspender el pellet. Repite este paso de lavado una vez más. A continuación, prepare cinco gradientes de percoll de 85, 80, 75, 70 y 65 por ciento en tubos cónicos de 215 mililitros y superponga dos mililitros de la suspensión de leucocitos encima de cada gradiente.

A continuación, centrifugar los gradientes a 800 veces G durante 30 minutos con la pausa apagada. Después de la centrifugación, recoja las células en las capas en las interfaces 75-80% y 70-75%. Use PBS para lavar las células dos veces y luego use un hemocitómetro para contar las células.

Para medir la cinética de la liberación de ADN extracelular, prepare una suspensión de neutrófilos en un medio de ensayo a una concentración de dos veces diez a seis células por mililitro. Agregue cinco micromoles por litro de naranja SYTOX, que es un tinte de unión al ADN impermeable a la membrana y mezcle suavemente. Aliquot neutrófilos humanos en microplacas de fondo transparente negras estériles de 96 pocillos, lo que garantiza que el medio de ensayo cubra todo el fondo del pocillo.

De lo contrario, golpee suavemente la placa en el costado. Calienta el plato a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Mientras tanto, utilice un medio de ensayo de 37 grados centígrados para preparar soluciones que contengan estímulos al doble de sus concentraciones finales que se utilizarán.

Como control positivo de NET, prepare 100 nanomolares de acetato de miristato de forbol, o PMA, para tratar a los neutrófilos humanos durante cuatro horas para desencadenar la liberación máxima de NET. A continuación, prepare el fluorómetro de microplaca para la medición. Estimula los neutrófilos añadiendo 50 microlitros de solución estimulante a 50 microlitros de suspensiones de neutrófilos.

Agregue una concentración final de 0,5 miligramos por mililitro de saponina a un pocillo, para medir la señal máxima de liberación de ADN. Coloque la placa en el lector y mida los cambios en la fluorescencia a intervalos de dos minutos durante cuatro horas sin agitar. Para analizar los datos, calcule los aumentos normalizados de la fluorescencia a lo largo del tiempo restando la fluorescencia de referencia de los valores del punto final para todos los pocillos, incluida la saponina.

El aumento de la fluorescencia de las saponinas debe ser la señal más alta y se conoce como la liberación máxima de ADN. Promedie los resultados de las réplicas y preséntelos como porcentaje de la liberación máxima de ADN. Para cuantificar la formación de NET mediante ensayos MPO-DNA y HNE-DNA ELISA, agregue anticuerpos de captura anti-MPO o anti-HNE a placas ELISA de alta capacidad de unión de 96 pocillos e incube durante la noche para recubrir.

A la mañana siguiente, use 200 microlitros por pocillo de PBS para lavar las placas ELISA tres veces. A continuación, utilice 200 microlitros de albúmina sérica bovina al 5%, o BSA, y albúmina sérica humana al 0,1%, o HSA, para bloquear los pocillos a temperatura ambiente durante dos horas. Mientras tanto, siembra neutrófilos en 100 microlitros de medio de ensayo en una placa de 96 pocillos a una densidad de 100.000 células por pocillo e induce la formación de NET después de la adición de estímulos incubando a 37 grados centígrados durante cuatro horas.

A continuación, realice una digestión limitada de la DNasa añadiendo dos unidades por mililitro de ADNasa a los sobrenadantes de los neutrófilos, luego mezcle bien e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos. Luego, detenga la reacción agregando 15 microlitros de EGTA de 25 milimolares y mezcle bien. Recoja los sobrenadantes y los tubos de microfuga limpios y centrifuga las muestras para deshacerse de los restos celulares a 300 veces G y temperatura ambiente durante cinco minutos.

La recolección de NETs sin digestión limitada da como resultado datos inconsistentes. El paso limitado de la digestión del ADN es fundamental para obtener resultados reproducibles. Por lo tanto, se ha optimizado la concentración de la enzima DNasa I y la duración de la digestión.

Transfiera el sobrenadante a tubos de microfuga limpios y manténgalos en hielo. A continuación, utilizando una alícuota de patrón NET previamente preparado, prepare una dilución de uno a dos en PBS y EGTA. Ahora, use PBS con EGTA para diluir las muestras digeridas de DNasa I veinte veces y alícuotas en placas ELISA recubiertas con anticuerpos de captura.

Incubar las placas durante la noche a cuatro grados centígrados. Antes de usar PBS para lavar las placas tres veces, aplique 100 microlitros por pocillo de una solución de anticuerpos de detección, como el anticuerpo anti ADN conjugado con peroxidasa de rábano picante, e incube en la oscuridad durante una hora. Después de cuatro lavados con PBS, añadir 100 microlitros por pocillo de sustrato de peroxidasa TMB e incubar durante 30 minutos.

La coloración azul indica actividad peroxidasa y la presencia de TNE. Para detener la reacción, agregue 100 microlitros de HCL molar. Las soluciones azules se volverán amarillas.

Usando un fotómetro de microplaca, lea la absorbancia a 450 nanómetros. Para comparar la cantidad de complejos MPO-DNA o HNE-DNA medidos en comparación con el estándar NET, reste la densidad óptima de fondo de todas las muestras y trace los valores de absorbancia de las muestras estándar diluidas contra su contenido NETO relativo. Utilizando el rango no saturado de esta curva estándar, establezca una línea de tendencia utilizando el mejor ajuste exponencial del software utilizado.

Inserte los valores de OD medidos de las incógnitas en la ecuación de la línea de tendencia que dará la cantidad de NETs en la muestra desconocida como porcentaje del estándar NET. Finalmente, calcule los promedios de las réplicas y presente los datos finales como la cantidad de complejos MPO-DNA o HNE-ADN. Aquí se muestran datos representativos de un ensayo de liberación de ADN basado en fluorescencia de neutrófilos humanos que no fueron estimulados o activados con PMA o P-aeruginosa.

La P-aeruginosa desencadena la formación de NET en las PMN humanas. Este gráfico ilustra que los promedios de aumento en la fluorescencia de los pozos replicados se calculan, se normalizan en la fluorescencia máxima y se expresan como liberación de ADN. Estas imágenes de fluorescencia representan neutrófilos que no han sido tratados o estimulados con PMA.

Aquí se muestran imágenes de inmunofluorescencia de neutrófilos humanos no estimulados, PMA y PA01 activados de un ensayo MPO-DNA y HNE-DNA Elisa. El ADN extracelular muestra una morfología típica de NET y se colocaliza con MPO e histona H4 citrulinada, un marcador de formación de NET. Este experimento muestra la liberación de MPO-DNA y HNE-DNA en neutrófilos humanos utilizando el mismo ensayo.

El estándar NET contiene en promedio 19,5 microgramos por mililitro de ADN extracelular, 399 nanogramos por mililitro de MPO y 103,4 nanogramos por mililitro de HNE. Sobre la base de los pesos moleculares de MPO y HNE, y de que un microgramo de ADN contiene 9,91 veces 10 por 14 nucleótidos, el estándar NET contiene 109 moléculas de HNE y 147 moléculas de MPO por cada 1.000 nucleótidos. Por último, dos experimentos de dilución en serie del estándar NET revelan que los rangos dinámicos de los ensayos MPO-DNA y HNE-DNA ELISA están entre 19 y 609 nanogramos por mililitro de ADN.

Una vez dominado, el ácido a base de naranja SYTOX se puede ensamblar fácil y rápidamente en una hora, lo que lleva a resultados al día siguiente. El ensayo de cuantificación NET también es fácil de realizar y dará lugar a datos al día siguiente si se realiza correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar la naturalasa en neutrófilos humanos de una manera de alto rendimiento.