Name: Alto Rendimiento de medición de ADN extracelular de salida y la formación neta cuantitativa en neutrófilos humanos In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Aprende a cuantificar trampas extracelulares de neutrófilos (NETs) en humanos mediante ensayos de alto rendimiento. Este método permite estudiar mecanismos de inflamación y vías de señalización en investigación inmunológica.

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Un agradecimiento especial al personal del laboratorio del Centro de Salud de la Universidad de Georgia por su continuo apoyo a nuestro trabajo en el aislamiento de neutrófilos humanos. Este trabajo fue apoyado por el fondo inicial del Dr. Rada proporcionado por la Oficina del Vicepresidente de Investigación de la UGA.

La Junta Institucional de la Universidad de Georgia Revisión aprobó el estudio de sujetos humanos para recoger la sangre periférica de voluntarios sanos (UGA # 2012-10769-06). 5,7,8 voluntarios firmaron el consentimiento informado necesario antes de la extracción de sangre. La investigación realizada en este artículo está en conformidad con las directrices éticas para la investigación médica en seres humanos de la Declaración de Helsinki. 1. Aislamiento de los neutrófilos de sangre periférica humana (Figura 1) Nota: Hay varias maneras de aislar los neutrófilos de sangre periférica. El siguiente protocolo proporciona una posibilidad. Este protocolo produce un gran número de neutrófilos no activadas humanos capaces de liberar TNE a la estimulación externa. Utilice 40 ml de sangre entera obtenida de voluntarios sanos por punción venosa. 7,9 <ol><li> Alícuota de sangre 20 ml en dos tubos cónicos de 50 ml. Añadir 10 ml de dextrano al 6%. Mezclar suavemente. </li><li> Después de 20 minutos, la transferencia de leucocitos-rich fase superior sin tomar ninguna glóbulos rojos sedimentados en limpios de 50 ml tubos cónicos, y llenarlo con PBS estéril. </li><li> Centrifugar a 400 xg 10 min. Resuspender pellet en 4 ml de PBS estéril. </li><li> Preparar un 5 a paso Percoll gradiente de 85% -80% -75% -70% -65% en dos tubos de 15 ml cónicos y capa 2 ml de suspensión de leucocitos en la parte superior de cada gradiente. </li><li> Centrifugadora 800 xg durante 30 min con frenos estarán desactivados. </li><li> Recoge todas las células (neutrófilos) en las capas en el 75% / 80% y la interfaz 70% / 75%. </li><li> Lavar las células dos veces en PBS (350 xg, 10 min, RT) y contar las células usando un hemocitómetro. </li></ol> 2. Medición de la Cinética de ADN extracelular de liberación utilizando una microplaca Fluorimétrico Nota: Este método permite la medición de cambios en la fluorescencia de una membrana impermeable al colorante indicativo de la liberación de ADN en un formato de microplaca de 96 pocillos de unión a ADN (Figura 2). <ol><li> Preparar una suspensión de neutrófilos en medio de ensayo (HBSS +(V / v) 1% de suero autólogo + glucosa 5 mM) a una concentración de 2 x 10 6 células / ml. </li><li> Añadir 5 mol / L del colorante de unión a ADN impermeable membrana. Mezclar suavemente. </li><li> neutrófilos humanos alícuota (50 l / pocillo) en 96 pocillos de fondo negro, transparente microplacas. Asegúrese de que el medio de ensayo cubre todo el fondo del pozo. Si no, toque suavemente la placa en el lateral. </li><li> Calentar los neutrófilos placa que contiene de 10 minutos a 37 ° C. </li><li> Mientras tanto preparar soluciones de estímulos al doble de sus concentraciones finales a utilizar (en 37 ° C medio de ensayo en caliente). Como control positivo neto utilizar los neutrófilos humanos con 100 nM de forbol-miristato-acetato (PMA) durante 4 horas para desencadenar la liberación máxima NET. 5,8 estimulación de PMA durante 4 horas asegura la liberación máxima NET NET mientras que la formación espontánea sigue siendo baja 5,8. </li><li> Preparar el fluorímetro de microplaca para la medición (4 hr, 37 ° C, 530 nm para la excitación y 590 nm para la emisión). &lt;/ Li&gt; <li> Estimular neutrófilos mediante la adición de solución de estímulo 50 l 50 l suspensiones de neutrófilos. Utilizar 0,5 mg / ml de saponina en un pocillo para medir la señal máxima de liberación de ADN. </li><li> Colocar la placa en el lector y medir los cambios en la fluorescencia durante 4 horas a cada 2 minutos sin agitación. </li><li> Para el análisis de datos, calcular los aumentos en la fluorescencia normalizados a través del tiempo. <ol><li> Restar de fluorescencia base de los valores de punto final para todos los pozos que incluye saponina (Figura 2A, B). Aumento de la fluorescencia saponina debe ser la señal más alta. Se conoce como &quot;la liberación de ADN máxima&quot; (Figura 2). </li><li> Calcular los porcentajes de liberación de ADN en muestras desconocidas dividiendo los aumentos en la fluorescencia de muestras desconocidas por la liberación máxima de ADN. </li><li> Los resultados promedio de las réplicas y los presentan como &quot;% de la liberación máxima de ADN&quot; (Figura 2C). </li></ol></li></ol> 3. La cuantificación de la Forma NETación por MPO-ADN y ADN-HNE ensayos ELISA Nota: Estos ensayos (MPO-ADN) modificado o establecido (HNE-ADN) en nuestro laboratorio cuantificar la formación neta midiendo los niveles de MPO-ADN y complejos de ADN HNE-5. <ol><li> Escudo de 96 pocillos de alta unión a placas de ELISA de capacidad durante la noche con anticuerpos de captura (50 l / pocillo): anti-MPO (dilución 1: 2000) o anti-HNE (1: 2000). </li><li> Lavar las placas de ELISA tres veces con PBS (200 l / pocillo) y bloquearlas con BSA al 5% y albúmina de suero humano 0,1% durante 2 horas a RT (200 l / pocillo). Lavar tres veces con PBS. </li><li> neutrófilos semilla en microplacas de 96 pocillos a una densidad de 100.000 células / pocillo en 100 l de medio de ensayo, y estimular la formación de NET. Se incuban las células: 4 h para 37 ° C. </li><li> Realizar una digestión DNasa limitada mediante la adición de 2 U de DNasa / ml de sobrenadante de neutrófilos, mezclarlos bien. Mantenerlos a temperatura ambiente. </li><li> Detener la DNasa después de 15 minutos mediante la adición de 11 l mM EGTA 25 (concentración final 2,5 mM). Mezclar bien. recoger supernatants en tubos de microcentrífuga limpios. muestras de giro para deshacerse de los restos de células a 300 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente. Transferir sus sobrenadantes en tubos de microcentrífuga limpios. Mantenerlos en hielo hasta que esté listo. </li><li> Se utiliza una alícuota de un preparado previamente &quot;estándar NET&quot;. Nota: El NET-estándar es una mezcla de sobrenadantes de DNasa-digerido de neutrófilos estimulados por PMA obtenidos a partir de al menos 5 donantes humanos diferentes e independientes. <ol><li> Para utilizar el mismo estándar para un largo tiempo, recoger y alícuota un gran volumen de sobrenadantes de neutrófilos de cada donante individual. El cobro por ejemplo 2 ml de sobrenadantes de DNasa-digerido de neutrófilos estimulados por PMA dará lugar a alícuotas de 200 (10 l cada uno) suficientes para 200 placas de ELISA. Datos que caracterizan el estándar NET se encuentran en la Figura 5. </li><li> Estimular los neutrófilos humanos con PMA 100 nM durante 4 horas y aplicar DNasa digerir a sus sobrenadantes europea Según los pasos 3.4-3.5. </li><li> Recoger, piscina, alícuota (10 l) y libresobrenadantes ze (-20 ° C) de neutrófilos. </li><li> Para preparar el &quot;NET-estándar&quot;, descongelar una alícuota / donante obtenida de al menos cinco donantes por separado, mezclar y mantenerlos en hielo. </li><li> Desechar las muestras descongeladas y el uso de los frescos para el siguiente experimento. </li><li> Preparar una dilución 1: 2 en serie de la red estándar en PBS + EGTA. </li></ol></li><li> Diluir muestras digeridas-Dnase1 (estándar y los sobrenadantes desconocidos) 20 veces en PBS + EGTA y alícuota ellos en placas de ELISA recubiertas con anticuerpos de captura. </li><li> Incubar las placas de ELISA durante la noche a 4 ° C y los lavar tres veces con PBS. </li><li> Aplicar la solución de anticuerpo de detección (100 l / pocillo): peroxidasa de rábano picante conjugada con anticuerpo anti-ADN (1: 500, de ratón). Incubar durante 1 hora en la oscuridad. </li><li> Después de cuatro lavados con PBS añadir sustrato de peroxidasa TMB: 100 l / pocillo, 30 min. coloración azul es una indicación para la actividad de la peroxidasa (TNE) presentes. </li><li> Detener la reacción mediante la adición de 100 l / pocillo de HCl 1. lossoluciones azules se vuelven amarillas (Figura 5A). </li><li> Leer la absorbancia a 450 nm utilizando un fotómetro de microplacas. </li><li> Para el análisis de los datos, el cálculo de la cantidad de MPO-ADN o ADN-HNE complejos en comparación con el estándar NET. <ol><li> Restar el valor de densidad óptica de fondo del medio de ensayo de todas las muestras. </li><li> Representar gráficamente los valores de absorbancia (eje X) de las muestras patrón diluidas en contra de su contenido neto relativo (eje Y) (Figura 5). </li><li> El uso de la gama no saturado de esta curva estándar de establecer una línea de tendencia (utilizar mejor ajuste exponencial del software utilizado) (Figura 5). La ecuación de esta línea de tendencia determina la conversión de los valores de DO a lo cuantitativo cantidades de los TNE. </li><li> Introduzca los valores de DO medidos de las incógnitas en la ecuación de la línea de tendencia de 3.13.3 que le dará la cantidad de TNE en la muestra desconocida como porcentaje del precio neto estándar (Figura 5A). </li><li> Calcularpromedios de repeticiones (por triplicado) y presentar los datos finales como &quot;cantidad de MPO-ADN o complejos de HNE-ADN (%) de la norma&quot; (Figura 5C). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li>
<li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).</li>
<li>Kessenbrock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+neutrophils+in+autoimmune+small-vessel+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis.</a> Nat Med. 15, 623-625 (2009).</li>
<li>Leffler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+neutrophil+extracellular+traps+co-varies+with+disease+activity+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Degradation of neutrophil extracellular traps co-varies with disease activity in patients with systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Res Ther. 15, R34(2013).</li>
<li>Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NET+formation+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+isolates+measured+as+release+of+myeloperoxidase-DNA+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes.</a> Immunol Lett. 160, 186-194 (2014).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+hypercitrullination+mediates+chromatin+decondensation+and+neutrophil+extracellular+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation.</a> J Cell Biol. 184, 205-213 (2009).</li>
<li>Pang, L., Hayes, C. P., Buac, K., Yoo, D. G., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudogout-associated+inflammatory+calcium+pyrophosphate+dihydrate+microcrystals+induce+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Pseudogout-associated inflammatory calcium pyrophosphate dihydrate microcrystals induce formation of neutrophil extracellular traps.</a> J Immunol. 190, 6488-6500 (2013).</li>
<li>Yoo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+cystic+fibrosis+airway+inflammatory+markers+from+Pseudomonas+aeruginosa-stimulated+human+neutrophils+involves+NADPH+oxidase-dependent+extracellular+DNA+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Release of cystic fibrosis airway inflammatory markers from Pseudomonas aeruginosa-stimulated human neutrophils involves NADPH oxidase-dependent extracellular DNA trap formation.</a> J. Immunol. 192, 4728-4738 (2014).</li>
<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., Zychlinsky, C., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%2C+how+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps, how to generate and visualize them.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Rada, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyocyanin-enhanced+neutrophil+extracellular+trap+formation+requires+the+NADPH+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pyocyanin-enhanced neutrophil extracellular trap formation requires the NADPH oxidase.</a> PLoS One. 8, e54205(2013).</li>
<li>Neumann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antimicrobial+peptide+LL-37+facilitates+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">The antimicrobial peptide LL-37 facilitates the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Biochem J. 464, 3-11 (2014).</li>
<li>Leon, S. A., Shapiro, B., Sklaroff, D. M., Yaros, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+DNA+in+the+serum+of+cancer+patients+and+the+effect+of+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy.</a> Cancer Res. 37, 646-650 (1977).</li>
<li>Raptis, L., Menard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+and+characterization+of+plasma+DNA+in+normals+and+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus.</a> J Clin Invest. 66, 1391-1399 (1980).</li>
<li>Chang, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+cell-free+serum+DNA+detected+in+patients+with+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction.</a> Clin Chim Acta. 327, 95-101 (2003).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

TNE representan un fascinante nuevo mecanismo por el cual los neutrófilos matar los agentes patógenos. 1 Aunque la literatura de los TNE ha sido cada vez más importante en los últimos diez años desde su descubrimiento, varias cuestiones importantes relacionadas con su papel en la biología, el mecanismo y la regulación siguen sin estar claros. metodología adecuada tiene que ser desarrollado para medir los TNE, este mecanismo antimicrobiano muy singular. Este artículo describe métodos que se pueden utilizar par...

La formación de NET es un mecanismo novedoso por el cual los neutrófilos luchan contra los patógenos. 1 El núcleo de las redes electrónicas es el ADN nuclear. 1 Esta red de ADN está asociada con proteínas granulosas de neutrófilos e histonas. 1 La forma principal de formación de NET requiere la muerte de los neutrófilos caracterizada por la descondensación de la cromatina, la desaparición de las membranas granulares y nucleares, la translocación de la elastasa de los neutrófilos al núcleo, la citrulinación de las histonas y, finalmente, el derrame de NET basados en el ADN. número arábigo Los NET atrapan y matan una amplia variedad de microbios y son una parte esencial del repertorio de armas inmunes innatas. Sin embargo, la formación incontrolada de NET se ha relacionado con numerosas enfermedades autoinflamatorias. 3,4 A pesar de su relevancia cada vez más establecida, se sabe poco sobre el mecanismo y la regulación de la liberación de NET. 
Los neutrófilos que mueren por liberación de NETs son diferentes de los neutrófilos apoptóticos o necróticos. 3,5 Los neutrófilos liberadores de NET muestran varias características que son características de la formación de NET. Los componentes de los gránulos están asociados con el ADN en los NET. 1 La mieloperoxidasa (MPO) y la elastasa de neutrófilos humanos (HNE) se encuentran en gránulos primarios en las células en reposo, pero se translocan al núcleo para unirse al ADN en los NET. 1 Los complejos MPO-DNA y HNE-DNA son específicos para los NETs, no ocurren en neutrófilos apoptóticos o necróticos. La descondensación de la cromatina 1,3,5 es otra característica típica de NETosis. número arábigo La liberación de NET también requiere la citrulinación de las histonas por la peptidil aminidasa 4 (PAD4). 6 Las histonas citrulinadas son características distintivas de los neutrófilos que se sometieron a la liberación de NET. 6
Aquí se introducen tres métodos que, en combinación, proporcionan excelentes herramientas para cuantificar NETs en una escala de alto rendimiento. El primer ensayo se ha utilizado en el campo con diferentes cambios y cuantifica la liberación de ADN extracelular en formato de microplaca. El segundo y tercer ensayo proporcionan la confirmación de los NET mediante la medición de los complejos MPO-DNA y HNE-DNA específicos de NET.

<table><tbody><tr><td>Elastasa de neutrófilos antihumanos&nbsp; Conejo Ab&nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>481001</td><td>1:2,000x</td></tr><tr><td>recubierto Anti-mieloperoxidasa Ab (Conejo)</td><td>Millipore</td><td>07-496</td><td>1:2,000x</td></tr><tr><td>recubierto DNasa-1</td><td>Roche</td><td>10-104-159-001</td><td>1 &#181; g/ml utilizado para la digestión</td></tr><tr><td>20 mM EGTA/ PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>2.5 mM EGTA/PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>Detección de muerte celular ELISA Anti-DNA POD</td><td>Roche</td><td></td><td>11544675001 1:500x&nbsp;</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro de microplacas Eon</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 Software de microplacas todo en uno</td> Herramienta analítica <td>Biotek</td><td></td><td>(ELISA)</td></tr><tr><td>Sytox orange</td><td>Life Technology</td><td>S11368</td><td>0,2% concentración final/volumen</td></tr><tr><td>1 M Hepes</td><td>Cellgro</td><td>25-060-Cl</td><td>Uso 10 mM concentración final</td></tr><tr><td>1 M de glucosa</td><td>Sigma</td><td></td><td>Utilice 5 mM de concentración final.</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning</td><td>21-023-CM</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan Flash Ver.2.4.3</td><td>Thermoscientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma</td><td>P 8139</td><td>100 nM final usado</td></tr><tr><td>Placa ELISA</td><td>Greiner bio-one</td><td>655061</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos 15 ml</td><td>Thermoscientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos 50 ml</td><td>Thermoscientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (pH 8,5-9,5)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P 1644</td><td>Cloruro de sodio, Sigma, S7653-250G</td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Spectrum</td><td>D1004</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medios</td><td>Corning Cellgro</td><td>17-105-CV</td><td></td></tr><tr><td>96 placa de ensayo de pocillo placa negra fondo transparente</td><td>Costar</td><td>3603</td><td></td></tr></tbody></table>

alto rendimiento de medición de adn extracelular de salida y la formación neta cuantitativa en neutrófilos humanos<em&gt; in vitro</em

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Los granulocitos neutrófilos son los leucocitos más abundantes en la sangre humana. Los neutrófilos son los primeros en llegar al sitio de la infección. Los neutrófilos desarrollaron varios mecanismos antimicrobianos, como la fagocitosis, la degranulación y la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET). Los NET consisten en un andamio de ADN decorado con histonas y varios marcadores de gránulos, como la mieloperoxidasa (MPO) y la elastasa de neutrófilos humanos (HNE). La liberación de NET es un proceso activo que implica cambios morfológicos característicos de los neutrófilos que conducen a la expulsión de su ADN al espacio extracelular. Los tumores neuroendocrinos son esenciales para combatir los microbios, pero la liberación incontrolada de tumores neuroendocrinos se ha asociado con varios trastornos. Para aprender más sobre la relevancia clínica y el mecanismo de formación de NET, existe la necesidad de contar con herramientas confiables capaces de cuantificar NET. 
Aquí se presentan tres métodos que pueden evaluar la liberación de NET de neutrófilos humanos in vitro. El primero es un ensayo de alto rendimiento para medir la liberación de ADN extracelular de neutrófilos humanos utilizando un tinte de unión al ADN impermeable a la membrana. Además, se describen otros dos métodos capaces de cuantificar la formación de NET mediante la medición de los niveles de los complejos MPO-DNA y HNE-DNA específicos de NET. Estos métodos basados en microplacas, en combinación, proporcionan excelentes herramientas para estudiar de manera eficiente el mecanismo y la regulación de la formación de NET de neutrófilos humanos.

Las cifras en este manuscrito se describe el método de aislamiento de neutrófilos, los procedimientos experimentales, y presentar los resultados representativos con la explicación de análisis de datos. La figura 1 muestra las etapas secuenciales de la preparación de neutrófilos humanos. Este protocolo representa sólo una manera posible de aislamiento de neutrófilos. Se produce grandes cantidades de neutrófilos en reposo capaces de liberar TNE a la estimulación. L...

Se presentan ensayos de alto rendimiento que, en combinación, proporcionan excelentes herramientas para cuantificar la liberación neta de neutrófilos humanos.

Alto Rendimiento de medición de ADN extracelular de salida y la formación neta cuantitativa en neutrófilos humanos<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar las trampas extracelulares de neutrófilos, o NET, liberadas por neutrófilos humanos a gran escala y con alto rendimiento. Los métodos presentados aquí pueden ayudar a responder preguntas clave en los campos de la inflamación y de las enfermedades inflamatorias mediante el estudio del mecanismo y la regulación de la formación in vitro de trampas extracelulares de neutrófilos en neutrófilos humanos. Las implicaciones de esta técnica incluyen la identificación de vías de señalización centrales que median las NET, así como moléculas inhibidoras o estimuladoras de las NET.Para aislar neutrófilos de la sangre, alícuota 20 mililitros de sangre humana en tubos cónicos de 250 mililitros. Añada 10 mililitros de dextrana al 6%, luego mezcle suavemente y deje reposar las soluciones a temperatura ambiente durante 20 minutos. Transfiera cuidadosamente la fase superior rica en leucocitos a tubos cónicos limpios de 50 mililitros, y use PBS estéril para llenar el tubo hasta arriba.Luego, centrifugue la muestra a 400 veces G durante diez minutos y utilice 15 mililitros de PBS estéril para resuspender el precipitado. Repita este paso de lavado una vez más. A continuación, prepare cinco gradientes de percoll en pasos del 85, 80, 75, 70 y 65 por ciento en tubos cónicos de 215 mililitros y coloque dos mililitros de la suspensión de leucocitos encima de cada gradiente.Luego, centrifugue los gradientes a 800 veces G durante 30 minutos con el freno desactivado. Tras la centrifugación, recolecte las células en las capas correspondientes a las interfaces del 75-80 % y del 70-75 %. Lave las células dos veces utilizando PBS y luego cuente las células utilizando un hemocitómetro.Para medir la cinética de liberación de ADN extracelular, prepare una suspensión de neutrófilos en medio de ensayo a una concentración de dos por diez a la seis células por mililitro. Añada cinco micromoles por litro de naranja SYTOX, que es un colorante impermeable a la membrana que se une al ADN, y mezcle suavemente. Aliquote neutrófilos humanos en microplacas de 96 pocillos negras con fondo transparente estériles, asegurándose de que el medio de ensayo cubra completamente todo el fondo del pocillo.Si no es así, golpee suavemente la placa por el costado. Incube la placa a 37 grados celsius durante 10 minutos. Mientras tanto, utilice medio de ensayo a 37 grados celsius para preparar soluciones que contengan los estímulos a doble de sus concentraciones finales para su uso.Como control positivo de NET, prepare 100 nanomolar de acetato de forbol miristato, o PMA, para tratar neutrófilos humanos durante cuatro horas y desencadenar la liberación máxima de NET. A continuación, prepare el fluorómetro de microplaca para la medición. Estimule los neutrófilos añadiendo 50 microlitros de solución estimulante a 50 microlitros de suspensiones de neutrófilos.Agregue una concentración final de 0,5 miligramos por mililitro de saponina a un pocillo, para medir la señal máxima de liberación de ADN. Coloque la placa en el lector y mida los cambios en la fluorescencia a intervalos de dos minutos durante cuatro horas sin agitación. Para analizar los datos, calcule los aumentos normalizados en la fluorescencia a lo largo del tiempo restando la fluorescencia basal de los valores finales para todos los pocillos, incluyendo saponina.El aumento en la fluorescencia de las esaponinas debe ser la señal más alta y se denomina liberación máxima de ADN. Promedie los resultados de los réplicas y preséntelos como porcentaje de la liberación máxima de ADN. Para cuantificar la formación de NET mediante ensayos ELISA de MPO-ADN y HNE-ADN, agregue anticuerpos captadores anti-MPO o anti-HNE a placas ELISA de 96 pocillos de alta capacidad de unión, e incúbelos durante la noche para recubrir.A la mañana siguiente, use 200 microlitros por pocillo de PBS para lavar las placas de ELISA tres veces. Luego use 200 microlitros de albúmina sérica bovina al 5%, o BSA, y albúmina sérica humana al 0,1%, o HSA, para bloquear los pocillos a temperatura ambiente durante dos horas. Mientras tanto, siembre neutrófilos en 100 microlitros de medio de ensayo en una placa de 96 pocillos a una densidad de 100.000 células por pocillo e induzca la formación de NET mediante la adición de estímulos, incubando a 37 grados Celsius durante cuatro horas.A continuación, realice una digestión limitada con DNasa añadiendo dos unidades por mililitro de DNasa a los sobrenadantes de neutrófilos, luego mezcle bien e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos. A continuación, detenga la reacción añadiendo 15 microlitros de EGTA 25 milimolar y mezcle bien. Recopile los sobrenadantes en tubos limpios para microcentrífuga y centrifugue las muestras para eliminar los restos celulares a 300 × g y temperatura ambiente durante cinco minutos.La recolección de NETs sin digestión limitada produce datos inconsistentes. El paso de digestión limitada del ADN es fundamental para obtener resultados reproducibles. Por lo tanto, se ha optimizado la concentración de la enzima DNasa I y la duración de la digestión.Transfiera el sobrenadante a tubos microcentrífugos limpios y manténgalos sobre hielo. Luego, utilizando una alícuota del estándar NET previamente preparado, prepare una dilución de uno a dos en PBS y EGTA. A continuación, use PBS con EGTA para diluir veinte veces las muestras digeridas con DNasa I y distribúyalas en placas de ELISA recubiertas con anticuerpos de captura.Incube las placas durante la noche a cuatro grados centígrados. Antes de lavar las placas con PBS tres veces, agregue 100 microlitros por pozo de una solución de anticuerpo de detección, como un anticuerpo anti ADN conjugado con peroxidasa de rábano picante, y luego incube en la oscuridad durante una hora. Después de cuatro lavados con PBS, añada 100 microlitros por pozo de sustrato TMB para peroxidasa y incube durante 30 minutos.La coloración azul indica actividad de peroxidasa y la presencia de NETs. Para detener la reacción, agregue 100 microlitros de HCl uno molar. Las soluciones azules se volverán amarillas.Mediante un fotómetro de microplaca, lea la absorbancia a 450 nanómetros. Para comparar la cantidad de complejos MPO-DNA o HNE-DNA medidos en relación con el estándar de NET, reste la densidad óptica de fondo de todas las muestras y represente los valores de absorbancia de las muestras estándar diluidas frente a su contenido relativo de NET. Utilizando el rango no saturado de esta curva estándar, establezca una línea de tendencia mediante el mejor ajuste exponencial proporcionado por el software utilizado.Introduzca los valores de DO medidos de las muestras desconocidas en la ecuación de la línea de tendencia, lo que dará la cantidad de ETN en la muestra desconocida como porcentaje del estándar de ETN. Finalmente, calcule los promedios de los réplicas y presente los datos finales como la cantidad de complejos MPO-ADN o HNE-ADN. Aquí se muestran datos representativos de un ensayo de liberación de ADN basado en fluorescencia de neutrófilos humanos dejados sin estimular o activados con PMA o P-aeruginosa.P-aeruginosa induce la formación de NET en PMN humanos. Esta gráfica muestra que los promedios del aumento en fluorescencia de pozos replicados se calculan, se normalizan respecto a la fluorescencia máxima y se expresan como liberación de ADN. Estas imágenes de fluorescencia representan neutrófilos dejados sin tratamiento o estimulados con PMA.Se muestran aquí imágenes de inmunofluorescencia de neutrófilos humanos no estimulados, activados con PMA y con PA01, procedentes de un ensayo Elisa de MPO-DNA y HNE-DNA. El ADN extracelular muestra una morfología típica de NET y colocaliza con MPO y la histona H4 citrulinada, un marcador de la formación de NET. Este experimento muestra la liberación de MPO-DNA y HNE-DNA en neutrófilos humanos mediante el mismo ensayo.El estándar de NET contiene en promedio 19,5 microgramos por mililitro de ADN extracelular, 399 nanogramos por mililitro de MPO y 103,4 nanogramos por mililitro de HNE. Basado en los pesos moleculares de MPO y HNE, y en que un microgramo de ADN contiene 9,91 veces 10 a la 14 nucleótidos, el estándar de NET contiene 109 moléculas de HNE y 147 moléculas de MPO por cada 1.000 nucleótidos. Finalmente, experimentos de dilución seriada por duplicado del estándar de NET revelan que los rangos dinámicos de los ensayos ELISA de MPO-ADN y HNE-ADN oscilan entre 19 y 609 nanogramos por mililitro de ADN.Una vez dominado, el ácido basado en naranja SYTOX puede ensamblarse fácilmente y de forma rápida en una hora, dando como resultado datos al día siguiente. El ensayo de cuantificación de NET también es sencillo de realizar y proporcionará datos al día siguiente si se realiza correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar la naturalasa en neutrófilos humanos de manera de alto rendimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra una técnica in vitro para generar y aislar trampas extracelulares (NETs) de neutrófilos. Los neutrófilos se aíslan de la sangre periférica y se estimulan con acetato de forbol miristato (PMA) para producir NET. Durante la incubación, los neutrófilos se someten a un proceso de muerte celular (NETosis) para liberar NETs que comprenden cromatina descondensada mezclada con proteínas citoplasmáticas granulares.

Una técnica in vitro para generar trampas extracelulares de neutrófilos humanos

Adherencia de los neutrófilos al endotelio activado en los sitios de infección es un componente integral de la respuesta inflamatoria del huésped. Se describe en el presente informe es un ensayo de unión de neutrófilos, que permite...

Cuantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensayo para medir la adhesión de neutrófilos al Activado Primaria células endoteliales microvasculares humanas en condiciones estáticas

trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) son redes de ADN, histonas y proteínas de neutrófilos. Aunque un componente de la respuesta inmune innata, redes están implicados en la autoinmunidad y la trombosis. Este protocolo describe un método simple para el aislamiento de neutrófilos canino y cuantificación de los TNE utilizando un ensayo de fluorescencia de microplacas.

Un simple ensayo de fluorescencia para la cuantificación de los neutrófilos extracelular canina Trampa de lanzamiento

Se describen métodos para aislar caninas neutrófilos de la sangre entera y visualizar la formación neta en vivo neutrófilos mediante microscopía de fluorescencia. También se describe son protocolos para cuantificar la formación neta y citrulinado histona H3 (citH3) expresión usando microscopia de la inmunofluorescencia.

In Vitro Formación de la trampa extracelular neutrófilo canino: Análisis dinámico y cuantitativo por microscopía de fluorescencia

Aquí, presentamos un protocolo para generar trampas extracelulares de neutrófilos (NET) y operar NETQUANT, una opción de software totalmente automática para la cuantificación de NETs en imágenes de inmunofluorescencia.

Cuantificación automatizada basada en imágenes de trampas extracelulares de neutrófilos mediante NETQUANT

Este protocolo describe un ensayo de neutrófilos trampa extracelular (red) altamente sensible y de alto rendimiento para la cuantificación semiautomática de ex vivo red formación por microscopia confocal tridimensional de la inmunofluorescencia. Este protocolo puede utilizarse para evaluar la red formación y degradación después de diferentes estímulos y se puede utilizar para estudiar terapias potenciales orientada en la red.

Un análisis de alto rendimiento para evaluar y cuantificar la formación de neutrófilos trampa extracelular

Presentamos un protocolo para una técnica modificada de ensayo de inmunoadsorción enzimática sándwich para medir cuantitativamente dos componentes de los remanentes de trampas extracelulares de neutrófilos, los complejos de ADN conjugado con mieloperoxidasa y ADN conjugado con elastasa de neutrófilos, derivados de neutrófilos activados.

Cuantificación de complejos mieloperoxidasa-ADN y neutrófilos elastasa-ADN a partir de trampas extracelulares de neutrófilos mediante el uso de un ELISA sándwich modificado

Presentamos un método automatizado de alto rendimiento para cuantificar las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) utilizando el sistema de análisis de células vivas, junto con un enfoque de doble colorante dependiente de la permeabilidad de la membrana.

Técnica de alto rendimiento en tiempo real para cuantificar la formación de trampas extracelulares de neutrófilos en neutrófilos humanos

Este protocolo definido describe un enfoque de microscopía de alto rendimiento en tiempo real para visualizar y cuantificar la liberación de trampas extracelulares (NET) de neutrófilos humanos in vitro. El método reproducible permite la investigación de las características y la cinética de la liberación de NET tras la estimulación con distintos inductores de NETosis y permite la evaluación de la farmacología de los antagonistas de NETosis.

Cuantificación microscópica en tiempo real y de alto rendimiento de la liberación de trampas extracelulares de neutrófilos humanos y evaluación de la farmacología de los antagonistas

Se muestra, cómo el uso de 2-fotón microscopio para la observación de la dinámica de los granulocitos neutrófilos en los pulmones infectados, mientras que fagocitan los agentes patógenos o producir trampas de neutrófilos extracelular (NET).

La observación directa de la fagocitosis y la formación de NET-por los neutrófilos en los pulmones infectados con dos fotones Microscopía

Aprende a cuantificar trampas extracelulares de neutrófilos (NETs) en humanos mediante ensayos de alto rendimiento. Este método permite estudiar mecanismos de inflamación y vías de señalización en investigación inmunológica.

Alto Rendimiento de medición de ADN extracelular de salida y la formación neta cuantitativa en neutrófilos humanos

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