Método para medir la actividad de enzimas deubiquitinating en líneas celulares y muestras de tejido

El objetivo general del siguiente experimento es visualizar la actividad de las enzimas desubiquitinadas en células. Esto se logra cultivando las células hasta alcanzar una alta confluencia y luego recolectándolas para facilitar la producción de un lisado concentrado como segundo paso. Se utiliza una lisis mecánica suave para producir un lisado que mantenga un panorama metabólico del citoplasma celular.

A continuación, las enzimas se incuban con sondas derivadas de hemaglutinina para marcar las enzimas desubiquitinasa mediante la reacción con el residuo de cisteína del sitio activo; los resultados muestran los perfiles de actividad de muchas enzimas desubiquitinasa basados en inmunotransferencia (Western blotting) y la detección quimioluminiscente subsiguiente. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la inmunotransferencia convencional es que permite al usuario visualizar las actividades de múltiples enzimas. En un experimento, prepare medio de cultivo celular por Ali, citando 30 mililitros de dobe docos, medio de Eagle modificado u DMEM más 10% de suero bovino fetal en un tubo cónico de 50 mililitros para cultivo.

Las células para el experimento transfieren M 17 congeladas o células he A del almacenamiento en nitrógeno líquido a un vaso pequeño con agua tibia. Luego, transfiera las células al tubo cónico de 50 mililitros que contiene 30 mililitros de medio. A continuación, agregue algo de medio al vial de células y transfiera las células resuspendidas dentro de los cinco segundos posteriores al descongelamiento.

Centrifugue la suspensión celular a 450 G durante cinco minutos para obtener un botón celular. A continuación, agregue 20 mililitros de medio en un matraz T 75. Retire el medio de las células mediante succión.

Añada cinco mililitros de medio fresco al sedimento celular y resuspenda. Transfiera los cinco mililitros de suspensión celular al medio de veinte mililitros en el matraz T75 e incube a 37 grados Celsius. Cambie el medio cada tres días para cosechar las células.

Retire el medio mediante succión, teniendo cuidado de no tocar las células. Lave las células con cinco mililitros de solución salina tamponada con fosfato o PBS. Retire el PBS utilizando succión.

A continuación, agregue tres mililitros de tripsina-EDTA al frasco T 75 e incube a 37 grados Celsius durante tres minutos. Tras la incubación, agregue seis mililitros de medio fresco al frasco y resuspenda las células.

Transfiera la suspensión a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue a 290 G durante cinco minutos, elimine el sobrenadante y agregue cinco mililitros de PBS. Toque suavemente el fondo del tubo para deshacer el precipitado antes de centrifugar a 290 G durante cinco minutos. Después de repetir el lavado con PBS tres veces, retire el PBS antiguo y resuspenda las células en un mililitro de PBS fresco.

Luego, transfiera las células a un tubo eppendorf y centrifugue a 290 ×g durante cinco minutos. Para realizar la lisis celular, mida el volumen aproximado del botón celular utilizando una pipeta y pese perlas de vidrio en una relación masa a volumen de uno a uno. Añada tampón de lisis al botón celular en un volumen dos veces mayor que el del botón.

Luego, agregue las perlas de vidrio al pellet y lisar. Lise las células en el tubo einor con agitación máxima durante 30 minutos a cuatro grados Celsius mediante vortex en una cámara fría. Centrifugue brevemente a 200 GS durante 30 segundos.

Para sedimentar las perlas y recolectar el sobrenadante. Añada al sobrenadante el mismo volumen de perlas de vidrio que antes, y vortexee nuevamente a agitación máxima durante 30 minutos a cuatro grados Celsius, tras centrifugar brevemente a 200 Gs durante 30 segundos. Para asentar las perlas de vidrio, recoja el sobrenadante.

Finalmente, centrifugue a 5.030 ×g durante cinco minutos. Para eliminar los núcleos, membranas y células no rotas, recoja el sobrenadante, que es el lisado celular para la derivatización del tejido, realizada mediante ácido pícrico o análisis BCA. En una placa de 96 pocillos, determine la concentración de proteína del lisado utilizando un lector espectrofotométrico de placas de 96 pocillos según lo especificado en el protocolo del kit de ensayo de proteína BCA.

Después de determinar la concentración de proteína, alicuote una cantidad correspondiente a 20 microgramos de proteína total y aforar a 50 microlitros con agua desionizada. A continuación, añada dos microlitros de 1,35 micromolar de HAUB vinilo para teléfono celular a la solución. El resultado es 20 microgramos de lisado en 50 nanomolar de sonda en la mezcla final de reacción.

Esto está en gran exceso molar. Para asegurar la marcación de enzimas desubiquitinasa funcionales o DUBs, deje que la solución incube durante una hora a 37 grados Celsius. A continuación, agregue buffer de muestra laly a la solución.

Para un volumen de reacción de 52 microlitros, utilice 26 microlitros de tampón de muestra 2x, 13 microlitros de tampón de muestra 4x o 8,87 microlitros de tampón de muestra 6x. Incube la muestra durante cinco minutos a 95 grados Celsius. Enfríe en hielo.

Antes de cargar el gel para realizar el inmunotransferencia, cargue primero una gel de tris-glicina de 12 pocillos, 4-20 %, con 40 microlitros de la muestra preparada. Corra el gel a 95 voltios hasta que el frente iónico alcance la parte inferior. Luego, realice una transferencia nocturna del gel a una membrana de fluoruro de polivinilideno o membrana PVDF siguiendo.

Primero, transfiera, incube la membrana en la tinción negra AMDO y escanee la membrana para obtener una imagen que muestre la cantidad de proteína en cada carril. A continuación, detenga la membrana e incúbela en leche al 5 % en PBS durante una hora para bloquear. Después, incube la membrana en el anticuerpo primario anti-HA a una concentración de uno a 10 000 en leche al 5 % en PBS, ya sea durante la noche a cuatro grados Celsius o durante cuatro horas a temperatura ambiente.

Después de la incubación, realice tres lavados de cinco minutos cada uno en PBS con 0,1 % de detergente tween 20. A continuación, incube la membrana en peroxidasa de rábano picante de ratón a una concentración de uno a 10.000 en 5 % de leche en PBS durante al menos dos horas. Realice tres lavados como antes, seguidos de un lavado de cinco minutos en PBS.

Finalmente, incubar la membrana en un reactivo de detección quimioluminiscente durante 10 minutos y detectar utilizando un detector de luminiscencia. Utilizar la configuración de exposición automática en el detector. La carga de proteína se verificó utilizando la tinción negra mito AM.

Este paso de control asegura que las diferencias en la actividad se deban a procesos celulares reales y no a una carga desigual de proteínas. Las bandas mostradas aquí indican que se utilizaron cantidades iguales de proteína en el primer experimento. En el segundo experimento, se cargaron cantidades desiguales de proteína debido a las diferencias esperadas en los perfiles de actividad de las líneas celulares distintas.

Esto se realizó para asegurar la detección de un perfil de actividad para la célula M 17. Los lisados se incubaron con etil maide, que es un inhibidor de cistina y debería provocar una señal reducida en el Western blot. Las membranas se incubaron en anticuerpo primario anti HA.

Una peroxidasa de rábano picante de ratón y luego se detectó mediante imágenes quimioluminiscentes. La marcación exitosa de las dubs utilizando las sondas da como resultado un perfil en cada carril de la membrana. La intensidad de las bandas a diferentes pesos moleculares corresponde al nivel de actividad de la enzima dub.

Las diferencias en los niveles de actividad de diversas dubs entre líneas celulares se hacen evidentes al comparar proteínas similares como U CHL uno en las células he a y M 17. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la fraccionamiento subcelular para responder preguntas como: ¿cómo afectan los procesos patológicos la actividad de la enzima ubiquitina en orgánulos unidos a la membrana?

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la actividad enzimática desubiquitinada utilizando sondas dirigidas al sitio activo.