Método para medir la actividad de enzimas deubiquitinating en líneas celulares y muestras de tejido

El objetivo general del siguiente experimento es visualizar la actividad de las enzimas deuquitinadas en las células. Esto se logra cultivando células a alta fluidez y cosechando para facilitar la producción de un lisado concentrado como segundo paso. La lisis mecánica suave se utiliza para producir un lisado que mantiene una imagen metabólica del citoplasma de la célula.

A continuación, las enzimas se incuban con sondas derivadas de la hemaglutinina con el fin de marcar las enzimas de dibiquitina reaccionando con el residuo de cisteína del sitio activo, los resultados muestran los perfiles de actividad de muchas enzimas de ubiquitina basados en la transferencia de Western y la posterior detección quimioluminiscente. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el Western blot regular, es que permite al usuario visualizar las actividades de múltiples enzimas. En un experimento, Prepare medios de cultivo celular de Ali, citando 30 mililitros de dobe docos, medio de águilas modificado o DMEM más un 10% de suero bovino fetal en un tubo cónico de 50 mililitros para cultivar.

Las células para el experimento transfieren las células M 17 congeladas o las células A del almacenamiento de nitrógeno líquido a un pequeño vaso de precipitados con agua tibia. A continuación, transfiera las células al tubo cónico de 50 mililitros que contiene 30 mililitros de medio. A continuación, agregue algunos medios al vial de celdas y transfiera las celdas resuspendidas dentro de los cinco segundos posteriores a la descongelación.

Centrifugar la suspensión celular a 450 Gs durante cinco minutos para obtener un pellet celular. A continuación, añada 20 mililitros de medio en un matraz T 75. Retire los medios de las celdas mediante succión.

Agregue cinco mililitros de medio fresco a la celda pellet y vuelva a susponer. Transfiera los cinco mililitros de suspensión celular a los 20 mililitros de medio en el matraz T 75 e incube a 37 grados centígrados. Cambiar el medio cada tres días para recolectar las células.

Retire el medio por succión, teniendo cuidado de no tocar las celdas. Lave las células con cinco mililitros de solución salina tamponada con fosfato o PBS. Retire el PBS mediante succión.

A continuación, añada tres mililitros de tripin EDTA al matraz T 75 e incube a 37 grados centígrados durante tres minutos. Después de la incubación, agregue seis mililitros de medio fresco al matraz y resus. Suspende las celdas.

Transfiera la suspensión a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue a 290 Gs durante cinco minutos, retire el sobrenadante y agregue cinco mililitros de PBS. Golpee suavemente la parte inferior del tubo para romper el pellet antes de la centrifusión a 290 Gs durante cinco minutos. Después de repetir el lavado de PBS tres veces, retire el PBS viejo y vuelva a suspender las células en un mililitro de PBS fresco.

A continuación, transfiera las células a un tubo de einor y gire a 290 GS durante cinco minutos. Para realizar la lisis celular, mida el volumen aproximado del pellet con una pipeta y pese las perlas de vidrio y una relación masa-volumen de uno a uno. Agregue tampón de lisis al pellet al doble del volumen del pellet.

Luego agregue las perlas de vidrio al pellet y lisis. Tamponar las células en el tubo de einor a máxima agitación durante 30 minutos a cuatro grados centígrados mediante vórtice en una cámara fría. Centrifugar brevemente a 200 GS durante 30 segundos.

Para asentar las cuentas y recoger el sobrenadante. Agregue el mismo volumen de perlas de vidrio que antes al vórtice sobrenadante, una vez más a máxima agitación durante 30 minutos a cuatro grados Celsius después de la centrifusión brevemente a 200 Gs durante 30 segundos. Para asentar las cuentas de vidrio, recoja el sobrenadante.

Finalmente centrifugar a 5, 030 GS durante cinco minutos. Para eliminar los núcleos, las membranas y las células intactas, recoja el sobrenadante, que es el lisado celular para la derivación de tejidos, realizado por análisis de ácido quínimico o BCA. En una placa de 96 pocillos para determinar la concentración de proteínas del lisado utilizando un lector de placa de 96 pocillos métrico chole según lo especificado por el protocolo del kit de ensayo de proteínas BCA.

Después de determinar la concentración de proteína, lleve una alícuota correspondiente a 20 microgramos de proteína total a 50 microlitros usando agua desionizada. A continuación, añada a la solución dos microlitros de 1,35 micromolares de teléfono móvil de vinilo HAUB. El resultado son 20 microgramos de lisado por 50 nano molares de sonda en la mezcla de reacción final.

Esto es en exceso de molares grandes. Para asegurar el marcaje de las enzimas funcionales de ubiquitina o dubs, deje incubar la solución durante una hora a 37 grados centígrados. A continuación, agregue un tampón de muestra laly a la solución.

Para un volumen de reacción de 52 microlitros, utilice 26 microlitros de dos tampones de muestra, 13 microlitros de cuatro tampones de muestra u 8,87 microlitros de seis tampones de muestra. Incubar la muestra durante cinco minutos a 95 grados centígrados. Enfriar sobre hielo.

Antes de cargar el gel para realizar la Western blot, primero cargue un gel de triglicina de 12 pocillos de cuatro a 20% con 40 microlitros de la muestra preparada. Haga funcionar el gel a 95 voltios hasta que el frente iónico llegue al fondo. A continuación, realice una transferencia nocturna del gel a una membrana de fluoruro DI o PVDF de polivina.

Transferencia Primero, incube la membrana en la tinción negra AMDO y escanee la membrana para obtener una imagen que muestre la cantidad de proteína en cada carril. A continuación, detenga la membrana e incube en leche al 5% en PBS durante una hora para bloquear. A continuación, incubar la membrana en el anticuerpo primario anti HA a una concentración de uno a 10.000 en leche al 5% en PBS, ya sea durante la noche a cuatro grados centígrados o durante cuatro horas a temperatura ambiente.

Después de la incubación, realice tres lavados durante cinco minutos cada uno en PBS con detergente al 0,1% entre 20. A continuación, incubar la membrana en peroxidasa de rábano picante de ratón a una concentración de uno a 10.000 en leche al 5% en PBS durante al menos dos horas. Realice tres lavados como antes, seguidos de un lavado durante cinco minutos en PBS.

Finalmente, incubar la membrana en un reactivo de detección quimioluminiscente durante 10 minutos y detectar usando un detector luminiscente. Utilice el ajuste de exposición automática en el detector. La carga proteica se controló mediante la tinción AM mito black.

Este paso de control asegura que las diferencias en la actividad se deban a procesos celulares reales y no a una carga desigual de proteínas. Los carriles que se muestran aquí indican que se utilizaron cantidades iguales de proteína en el primer experimento. En el segundo experimento, se cargaron cantidades desiguales de proteína debido a las diferencias esperadas en los perfiles de actividad de las líneas celulares diferentes.

Esto se hizo para garantizar la detección de un perfil de actividad para la célula M 17. Los lisados se incuban con etilo maide, que es un inhibidor de la cistina y debería conducir a una señal reducida en el Western blot. Las membranas se incubaron en anticuerpo primario anti HA.

Un ratón de rábano caballo peroxidasa, y luego se detectó mediante imágenes quimioluminiscentes. El etiquetado exitoso de los doblajes utilizando las sondas da como resultado un perfil en cada carril de la membrana. La intensidad de las bandas a diferentes pesos moleculares corresponde al nivel de actividad de la enzima dub.

Las diferencias en los niveles de actividad de varios dubs a través de líneas celulares se hacen evidentes cuando se comparan proteínas similares como U CHL one en las células he a y M 17. Después de este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como el fraccionamiento subcelular, para responder a preguntas como, ¿cómo afectan los procesos patológicos a la actividad de la enzima ubiquitina en los orgánulos unidos a la membrana?

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la actividad de la enzima dibiquitinada utilizando sondas dirigidas al sitio activo.