Imagen no invasiva de la respuesta inmune innata en un modelo de larvas de pez cebra de Streptococcus iniae Infección

El objetivo general de este procedimiento es microinyectar larvas de pez cebra con un patógeno bacteriano, streptococcus IEA, para obtener imágenes en vivo y no invasivas de la respuesta inmunitaria del huésped. Esto se logra cargando primero la aguja de microinyección con una suspensión bacteriana y alineando las larvas de pez cebra anestesiadas en el molde de inyección de agarosa. A continuación, la suspensión bacteriana se microinyecta en la vesícula ótica de las larvas.

Luego, las larvas inyectadas se montan en agarosa de bajo punto de fusión. Finalmente, las células inmunitarias del huésped Gus se etiquetan con fotos para facilitar el seguimiento y se obtienen imágenes de la infección con un microscopio confocal. En última instancia, la microinyección de estreptococo IEA en la vesícula ótica y el posterior fotomarcaje y microscopía confocal se utilizan para estudiar la respuesta inmunitaria del huésped de las larvas de pez cebra.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la inyección de venas de cuo, es que la inyección de vesículas óticas genera una infección bacteriana localizada para permitir la obtención de imágenes no invasivas de las interacciones entre el huésped y el patógeno en la larva transparente del pez cebra. Para comenzar, prepare una solución de 1.5 a 2% de alto punto de fusión en medio E tres y cocine en el microondas hasta que la solución esté clara. Una vez enfriado, vierta algunos de los aros en una placa de Petri, agregando lo suficiente para cubrir el fondo del plato y revolver.

Una vez que el aros se haya solidificado, coloque un peine de gel enjuagado y seco en la parte superior de modo que el extremo sólido descanse sobre la parte superior de la placa de Petri y el extremo con muescas toque el aros. Asegúrese de que el peine esté lo más horizontal posible, creando un ángulo de 30 grados con respecto a la capa inferior de aros. Vierta una pequeña cantidad adicional de aros en la interfaz entre el peine y la capa inferior de aros para que la capa de aros frescos cubra los pocillos del peine.

Deje que se enfríe por completo antes de quitar el peine. Luego, con la punta de una pipeta, retire los trozos de aros que sobresalgan de los pocillos. Vierta E tres medios encima del molde de inyección y almacene a cuatro grados centígrados.

Después de preparar el inóculo SNEA y las larvas de pez cebra para las inyecciones de acuerdo con el protocolo de texto, encienda el microinyector y establezca el rango de tiempo en milisegundos. Abra la válvula del tanque de dióxido de carbono para permitir que el gas ingrese a la línea. La presión del microinyector debe leer aproximadamente 20 PSI vórtice el cultivo SNEA preparado en rojo de fenol y PBS y usar una punta de microcargador para cargar dos o tres microlitros del cultivo en una aguja de inyección capilar tirada, montar la aguja cargada en un micromanipulador conectado a un soporte magnético y colocarla debajo de un microscopio estereoscópico de modo que la aguja esté en un ángulo aproximado de 45 a 65 grados con respecto a la base del microscopio.

Primero rompa la punta de la aguja con un par de pinzas finas, presione el pedal del microinyector para dispensar una gota del inóculo en la punta de la aguja. Utilice la barra de escala en la lente ocular del microscopio para medir el diámetro de la gota. El diámetro de la gota debe ser de aproximadamente 0,10 milímetros, lo que equivale a un volumen aproximado de un nanolitro.

Para ajustar el tamaño de la gota, ajuste la configuración de duración en el microinyector o use pinzas finas para cortar más de la punta de la aguja. El tiempo de inyección debe ser de entre 20 y 35 milisegundos para evitar demasiado daño tisular. A continuación, utilizando una pipeta de transferencia de plástico, transfiera un pez por pocillo a cada uno de los 12 pocillos del molde de inyección.

Luego, con una varilla de vidrio, un lazo para el cabello o una punta de plástico, coloque suavemente las larvas de modo que las cabezas apunten hacia la parte posterior del microscopio y los sacos de yema estén contra el lado izquierdo del pocillo. Apunte la oreja izquierda de las larvas hacia el techo. Cuando las larvas estén listas para la inyección, utilice las perillas del micromanipulador para alinear la aguja cargada con la vesícula ótica de modo que ambas estén en el mismo campo de visión.

Con la punta de la aguja, perfore la capa epitelial externa de la vesícula ótica de modo que la punta quede justo dentro de la vesícula. Ahora, usando una presión lo suficientemente baja para no romper la cavidad, presione el pedal para inyectar un nanolitro de la dosis deseada de SNEA. Si la inyección tiene éxito, la vesícula ótica, pero no el tejido circundante, deben llenarse con un inóculo de rojo fenol.

Retraiga con cuidado la aguja fuera de las larvas y, con un aumento de cinco aumentos, mueva la placa de inyección con la mano para que las larvas estén a la vista. Si inyecta bacterias marcadas con fluorescencia bajo un microscopio fluorescente, escanee visualmente las larvas inyectadas y mantenga solo aquellas en las que se ha producido la deposición de bacterias solo dentro de la vesícula ótica para asegurarse de que el volumen de inyección permanezca igual en el transcurso del experimento. Después de inyectar cada 48 embriones, inyecte una gota de suspensión bacteriana en un tubo de centrífuga de 1,7 mililitros que contenga 100 microlitros de PBS estéril.

A continuación, coloque los 100 microlitros en placas de barrena THY plus P e incube a 37 grados centígrados durante la noche. Para determinar la UFC en el volumen de inyección, cuando se haya inyectado un grupo completo de 12 larvas en la rampa de inyección, use cuidadosamente una pipeta de transferencia de plástico para eliminar las larvas de los pocillos y colocarlas en una nueva placa de Petri. Retire la solución trica y reemplácela con aproximadamente dos mililitros de medio E tres frescos para permitir que las larvas se recuperen.

Incubar los embriones de acuerdo con el protocolo de texto. Después de preparar aros con trica, de acuerdo con el protocolo de texto en la etapa del microscopio estereoscópico, use una pipeta de transferencia para colocar de cuatro a cinco larvas anestesiadas en un plato con fondo de vidrio. Retire la solución de trica y aro del baño de agua a 55 grados centígrados y deje que se enfríe a temperatura ambiente durante uno o dos minutos.

Mientras tanto, retire la mayor cantidad posible de líquido de las larvas anestesiadas. A continuación, vierta los agros enfriados en el plato hasta que se cubra aproximadamente la mitad de la superficie. Luego agite el plato para esparcir los aros.

Recoja las larvas que hayan flotado a los lados del plato y pílelas de regreso al centro. Luego, bajo el microscopio estereoscópico, use una punta de pipeta larga para colocar suavemente las larvas como desee para la obtención de imágenes. La vesícula ótica coloca las larvas de modo que la vesícula ótica derecha quede hacia arriba y la vesícula ótica izquierda quede plana contra el fondo de la placa.

Deje que los aros se enfríen durante unos 10 minutos antes de mover el plato. A continuación, pipetee suavemente un poco de solución de trica y E three sobre la capa de aros para mantenerla húmeda. Para visualizar las muestras, utilice un escaneo Zack con los láseres de 488 nanómetros y 543 nanómetros.

Utilice el escaneo continuo de líneas para ajustar la potencia del láser y la ganancia del detector. Verifique que no haya ninguna fluorescencia roja convertida accidentalmente en la ventana de control de adquisición de imágenes. En la configuración de estímulo, seleccione la herramienta usar escáner y elija principal, seleccione el láser de 405 nanómetros y configúrelo en 70% de potencia.

Luego, usando la opción de círculo, defina la región de interés en la vesícula ódica bajo la configuración de inicio del estímulo, seleccione la activación en serie con una preactivación de un marco y un tiempo de activación de 60, 000 milisegundos en la ventana de configuración de adquisición. En el encabezado de escaneo de tiempo, elija dos intervalos de un minuto cada uno, uno para la conversión de fotos previa y otro para la conversión posterior a la foto. Inicie la serie de lapso de tiempo para iniciar la conversión de fotos de la región de interés definida.

Finalmente, escanee la muestra con un Zack y los láseres de 488 y 543 nanómetros. Para visualizar la fluorescencia roja fotoconvertida, así como cualquier fluorescencia verde restante, la microinyección de SNEA en rojo de fenol en la vesícula ótica da como resultado una respuesta del huésped inicialmente localizada que, cuando se inyecta correctamente, solo debe verse en la vesícula ótica y no en el tejido o la sangre circundantes. Alternativamente, si se inyectan bacterias marcadas, un escaneo rápido de las larvas infectadas inmediatamente después de la inyección puede confirmar que las bacterias solo están en el scle ótico y no en el tejido circundante.

sitios de microinyección de infección inicialmente localizada son útiles para estudiar la quimiotaxis leucocitaria, como se muestra aquí. El reclutamiento de leucocitos se puede cuantificar mediante la tinción negra de gránulos de neutrófilos o la fijación de formaldehído de líneas transgénicas fluorescentes utilizando líneas de pez cebra transgénicas que expresan la proteína fluorescente verde. Dendra dos, específicamente en macrófagos o neutrófilos, reveló que la inyección de NEA en la vesícula ótica desencadenó el reclutamiento de neutrófilos y macrófagos y la fagocitosis de bacterias dentro de los 60 minutos posteriores a la infección.

En esta figura, dos macrófagos marcados con DRA que fueron reclutados para la vesícula ótica a las cinco horas después de la infección fueron fotoconvertidos y luego rastreados durante las siguientes 24 horas. Aunque algunas células fotoconvertidas permanecen en la vesícula ótica o en la región de la cabeza, también se encontraron algunas diseminadas por todo el cuerpo de las larvas, como se ve aquí. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo microinyectar estreptococos n EEA en la vesícula ótica del pez cebra envejecido tres días después de la fertilización.

Esto incluye alinear las larvas anestesiadas en el molde de inyección y cargar la aguja con el inóculo bacteriano. Dos micro bacterias inyectadoras en la vesícula ótica. Tres, el montaje de larvas infectadas en aerosistemas de bajo punto de fusión, y cuatro, el uso de un microscopio confocal para fotoetiquetar los leucocitos del huésped e imágenes de las interacciones entre los leucocitos y los patógenos in vivo.