Name: Imagen no invasiva de la respuesta inmune innata en un modelo de larvas de pez cebra de Streptococcus iniae Infección (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Aprende a realizar microinyección de Streptococcus iniae en la vesícula ótica de larvas de pez cebra para estudiar la respuesta inmune innata mediante imagen no invasiva en vivo.

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Los autores desean agradecer a los miembros del laboratorio para el cuidado y mantenimiento de pez cebra. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud, Premio Nacional de Servicio de Investigación A155397 a EA Harvie y NIH R01GM074827 a Anna Huttenlocher.

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El método de infección utilizado aquí es útil para el estudio de la respuesta inmune del huésped a una infección localizada inicialmente en 2-3 embriones y larvas dpf. El enfoque de un estímulo inflamatorio, como una infección, en una cavidad cerrada, como la vesícula ótica permite el estudio de neutrófilos y macrófagos quimiotaxis y la fagocitosis. Una advertencia de la inyección de bacterias en la vesícula ótica es que la capacidad de los neutrófilos para fagocitar eficazmente las bacterias en cavidades llenas de líqu...

Streptococcus iniae es un importante patógeno acuático que es capaz de causar enfermedad sistémica en peces y seres humanos 1. Aunque S. iniae es responsable de grandes pérdidas en el sector de la acuicultura, también es un potencial patógeno zoonótico, capaces de causar enfermedad en huéspedes humanos inmunocomprometidos con patologías clínicas similares a las causadas por otros patógenos humanos estreptocócicas. Habida cuenta de sus similitudes con patógenos humanos, es importante para estudiar S. iniae patogénesis de la enfermedad en el contexto de un huésped natural. Un modelo de pez cebra adultos de S. infección iniae reveló la infiltración de leucocitos robusta host al sitio localizado de infección, así como un rápido tiempo de acoger la muerte, un tiempo demasiado corto para involucrar al sistema inmune adaptativo 7. Con el fin de obtener una mirada en profundidad sobre la respuesta inmune innata a S. iniae infección in vivo, es necesario utilizar un modelo que es más susceptible de nen invasiva de imágenes en directo. El larvas de pez cebra tiene una serie de ventajas que lo hacen un modelo vertebrado cada vez más atractivo para el estudio de las interacciones huésped-patógeno. El pez cebra son relativamente barato y fácil de usar y de mantener en comparación con los modelos de mamíferos. La inmunidad adaptativa no es funcionalmente maduro hasta 4-6 semanas después de la fecundación, pero las larvas tienen un sistema inmune innato de vertebrados muy conservada con complemento, receptores tipo Toll, citocinas y los neutrófilos y macrófagos con capacidades antimicrobianas incluyendo la fagocitosis y el estallido respiratorio 2-6, 8-11. Además, la tratabilidad genética y la transparencia óptica de las etapas embrionarias y larvarias de desarrollo permiten la generación de líneas transgénicas estables con las células inmunes marcados con fluorescencia por lo que es posible examinar la interacción huésped-patógeno en tiempo real en vivo. La generación de estas líneas transgénicas utilizando una proteína fotoconvertible tales como DenDRA2 permite el seguimiento de origen célula huésped individual y el destino en el transcurso de la infección 12. Cuando se desarrolla un modelo de infección de larvas de pez cebra, el sitio elegido de microinyección determinará si una infección es inicialmente localizado o sistémico. Infecciones de la sangre sistémica en la vena caudal o conducto de Cuvier son los más utilizados para estudiar los patógenos microbianos en el pez cebra y son útiles para el estudio de las interacciones entre el huésped y las células microbianas, las respuestas de citoquinas, y las diferencias en la virulencia entre cepas de patógenos. Para los microorganismos de crecimiento más lento, inyección temprana en el saco vitelino de un embrión en la etapa de 16-1,000 célula puede ser usado para generar una infección sistémica 13,14, con la etapa de desarrollo óptimo para la microinyección de un microorganismo de crecimiento lento encontrado que entre la etapa de 16-128 células 15. Sin embargo, la yema inyecciones saco de muchos microbios en las etapas posteriores del desarrollo de acogida tienden a ser letal en tél huésped debido al medio ambiente rico en nutrientes para el microbio y la falta de infiltración de leucocitos 16-18. Una infección localizada generalmente resulta en la migración dirigida de los leucocitos hacia el sitio de la infección que puede ser fácilmente cuantificó con imagen no invasiva. Este tipo de infección puede permitir para la disección de los mecanismos que median la migración de leucocitos así como la investigación de diferentes capacidades migratorias y fagocíticas de diversas poblaciones de leucocitos. Las infecciones localizadas también son útiles al examinar las diferencias de virulencia entre las cepas bacterianas, así como el estudio de los mecanismos de invasión de microbios ya que las barreras host físicos deben ser cruzados por una infección localizada para convertirse en sistémica. El pez cebra se eleva típicamente a temperaturas de 25-31 ° C 19, sino que también puede mantenerse a temperaturas tan altas como 34-35 ° C para los estudios de la invasividad de ciertos patógenos humanos con requisitos estrictos de temperaturapara la virulencia 20, 21. Muchos sitios diferentes se han utilizado para generar una infección bacteriana localizada inicialmente como el ventrículo cerebro posterior 22, músculo dorsal de la cola 18, cavidad pericárdica 23, y vesícula ótica (oreja) 5, 16, 24. Sin embargo, se ha encontrado que la inyección de bacterias en el músculo de la cola puede causar daños en los tejidos y la inflamación independiente de las bacterias, que pueden sesgar los resultados en la investigación de la respuesta de leucocitos 13. Aunque menos daño está asociado con la inyección en el cerebro posterior y aunque es inicialmente desprovista de leucocitos en los embriones jóvenes, el ventrículo rombencéfalo gana constantemente más células inmunes con el tiempo como microglia toman la residencia. El ventrículo posterior del cerebro es también un lugar más difícil de imagen. La vesícula ótica es una cavidad hueca cerrada, sin acceso directo a la vasculatura 25, 26. Es normalmente desprovista de leukocytes, pero los leucocitos pueden ser reclutados a la vesícula ótica en respuesta a estímulos inflamatorios, como la infección. También es un sitio preferido de la microinyección de bacterias en 2-3 días de edad después de la fertilización de pez cebra (dpf) debido a la facilidad de formación de imágenes y la visualización de la inyección. Por lo tanto, se optó por la vesícula ótica como nuestro lugar de la infección bacteriana localizada.

<table><tbody><tr><td>1,7 ml Eppendorfs</td><td>MidSci</td><td>AVSS1700</td><td></td></tr><tr><td>14 ml Tubo Falcon</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>27 G x &frac12; pulg. aguja</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos</td><td>Corning Incorporated</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Sondas</td><td>moleculares rojas, Invitrogen</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>CNA agar</td><td>Dot Scientific, Inc</td><td>7126A</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia desechables</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7m</td><td></td></tr><tr><td>Visor de disección</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 a prueba</td><td>MDS</td><td>2292</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas finas</td><td> Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Peine de gel</td><td>VWR</td><td>27372-482</td><td>4,2 mm de ancho, 1,5 mm de grosor</td></tr><tr><td>Platos</td><td></td><td></td> con fondo de vidrio <td>Hecho a medida perforando un orificio de 16 a 18 mm en el centro de un fondo de placa de cultivo de tejidos de 35 mm y colocando un cubreobjetos redondo #1 de 22 mm en el orificio y sellando con una fina capa de adhesivo óptico Norland 68 curado con luz ultravioleta.</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa de alto punto de fusión</td><td>Denville Scientific, Inc.</td><td>CA3510-6</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal de barrido láser</td><td>Olympus</td><td>con sistema</td><td></td>FV-1000</tr><tr><td>Agarosa de bajo punto de fusión</td><td>Fisher</td><td>BP165-25</td><td></td></tr><tr><td>Soporte magnético</td><td>Tritech (Narishige)</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de microinyección</td><td>Parker</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta con microcargador</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Tritech (Narishige)</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Flaming/Brown P-97</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop spectrophotmeter</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea (PTU)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldheyde</td><td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>FB0875712 100 x 15 mm</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-4557</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Ricca Chemoical Company</td><td>572516</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-6310</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Roche 165921</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptona proteasa</td><td>Fluka Biochemika</td><td>29185</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo de células pequeñas</td><td>Corning Incorporated</td><td>430165</td><td>35 x 10 mm</td></tr><tr><td>Sudán Negro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2380</td><td></td></tr><tr><td>Agujas de inyección capilar de vidrio de pared delgada</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100-3</td><td></td></tr><tr><td>Todd Hewitt</td><td>Sigma Aldrich/Fluka Analytical</td><td>T1438</td><td></td></tr><tr><td>Tricaína (3-aminobenzoato de etilo)</td><td>Argent Chemical Laboratory/Finquel</td><td>C-FINQ-UE-100G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Fluka Biochemika</td><td>92144</td><td></td></tr></tbody></table>

imagen no invasiva de la respuesta inmune innata en un modelo de larvas de pez cebra de<em&gt; streptococcus iniae</em&gt; infección

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

El patógeno acuático, Streptococcus iniae, es responsable de más de 100 millones de dólares en pérdidas anuales para la industria de la acuicultura y es capaz de causar enfermedad sistémica en ambos peces y los seres humanos. Una mejor comprensión de S. iniae patogénesis de la enfermedad requiere un sistema modelo apropiado. La maleabilidad genética y la transparencia óptica de las etapas tempranas del desarrollo de pez cebra permiten la generación y proyección de imagen no invasiva de las líneas transgénicas con marcados fluorescentemente células inmunes. El sistema inmune adaptativo no es completamente funcional hasta varias semanas después de la fecundación, pero las larvas de pez cebra tienen un sistema inmune innato vertebrados conservadas con neutrófilos y macrófagos. Por lo tanto, la generación de un modelo de infección de larvas permite el estudio de la contribución específica de la inmunidad innata en el control de S. infección iniae. El sitio de microinyección determinará si hay una infecciónsistémica o localizada inicialmente. A continuación, presentamos nuestros protocolos para inyección vesícula ótica de pez cebra edad de 2-3 días después de la fecundación, así como las técnicas de imagen confocal de fluorescencia de la infección. Un sitio de infección localizada permite la observación de la invasión inicial microbio, el reclutamiento de células huésped y la difusión de la infección. Nuestros resultados utilizando el modelo de larvas de pez cebra de S. infección iniae indican que el pez cebra puede ser usado para examinar las diferentes contribuciones de los neutrófilos y los macrófagos de acogida en las infecciones bacterianas localizadas. Además, se describe cómo photolabeling de las células inmunes puede ser usado para rastrear el destino de la célula huésped individual durante el curso de la infección.

La microinyección de S. iniae en la vesícula ótica (Figura 1 y Figura 2) resulta en una respuesta del huésped localizado inicialmente. Cuando se inyecta correctamente, las bacterias sólo deben verse en la vesícula ótica y no en el tejido circundante o de la sangre. Esto puede ser visualizado durante la microinyección usando fenol colorante rojo (Figura 1A). Alternativamente, si se inyectan bacterias marcadas, un análisis rápido de las larvas infectadas publicar...

Aquí, presentamos un protocolo para la generación y obtención de imágenes de una infección bacteriana localizada en la vesícula ótica del pez cebra.

Imagen no invasiva de la respuesta inmune innata en un modelo de larvas de pez cebra de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infección

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

El objetivo general de este procedimiento es microinyectar larvas de pez cebra con un patógeno bacteriano, Streptococcus IEA, para realizar imágenes en vivo y no invasivas de la respuesta inmune del huésped. Esto se logra primero cargando la aguja de microinyección con una suspensión bacteriana y alineando larvas de pez cebra anestesiadas sobre el molde de agarosa para inyección. A continuación, se microinyecta la suspensión bacteriana en la vesícula ótica de las larvas.Luego, las larvas inyectadas se montan en agarosa de baja fusión. Finalmente, las células inmunitarias del hospedador se marcan con fotoetiquetas para facilitar su seguimiento y la infección se visualiza mediante microscopía confocal. En definitiva, la microinyección de Streptococcus iniae en la vesícula ótica y el posterior marcado con fotoetiquetas y la microscopía confocal se utilizan para estudiar la respuesta inmunitaria del hospedador en larvas de pez cebra.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la inyección en la vena caudal, es que la inyección en la vesícula ótica genera una infección bacteriana localizada que permite la obtención de imágenes no invasivas de las interacciones

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Embriones de pez cebra transparentes han demostrado ser útiles los ejércitos de modelo para visualizar y las interacciones funcionales de estudio entre las células inmunes y los patógenos bacterianos intracelulares, tales...

La infección de embriones de pez cebra con patógenos bacterianos intracelulares

El rápido desarrollo de tamaño pequeño y la transparencia del pez cebra son grandes ventajas para el estudio del control inmunitario innato de la...

La imagen no invasiva de la candidiasis diseminada en larvas de pez cebra

Fuente: Zhang, X., et al. Un modelo de embrión de pez cebra para la visualización in vivo y el análisis intravital de la infección por Staphylococcus aureus asociada a biomateriales. J. Vis. Exp. (2019)Este video muestra imágenes de fluorescencia de embriones de pez cebra inyectados con Staphylococcus aureus, lo que permite cuantificar la progresión de la infección y la distribución bacteriana para evaluar el impacto de las microesferas de biomateriales en las interacciones huésped-patógeno in...

 Imágenes de fluorescencia de infección bacteriana asociada a biomateriales en embriones de pez cebra

Fuente: Zhang, X. et. al., Un modelo de embrión de pez cebra para la visualización in vivo y el análisis intravital de la infección por Staphylococcus aureus asociada a biomateriales. J. Vis. Exp. (2019)Este video muestra un modelo de embrión de pez cebra para estudiar infecciones relacionadas con biomateriales implantados. La inyección de microesferas de poliestireno de Staphylococcus aureus mejora la supervivencia bacteriana, lo que confirma el papel promotor de infecciones de los materiales...

Análisis in vivo de infecciones bacterianas asociadas a implantes utilizando embriones de pez cebra

Este video muestra el seguimiento del reclutamiento de leucocitos utilizando larvas de pez cebra transgénicas que expresan proteína fluorescente verde fotoconvertible. La preinyección de bacterias marcadas con colorante fluorescente rojo en la vesícula ótica e inducción de la fotoconversión permite observar la migración, fagocitosis y dispersión de los leucocitos en todo el cuerpo, lo que proporciona información valiosa sobre la dinámica de la respuesta inmunitaria.

Seguimiento de leucocitos basado en fotoconversión en pez cebra transgénico infectado por bacterias

El video muestra una técnica de dispositivo de herida y atrapamiento de pez cebra para observar la infección por patógenos fúngicos marcados con fluorescencia en larvas de pez cebra. La infección inicial atrae a los macrófagos y, a medida que la infección persiste, el reclutamiento de neutrófilos progresa en el lugar de la inyección.

Una técnica zWEDGI para visualizar larvas de pez cebra infectadas con patógenos fúngicos

La respuesta inmune innata protege a los organismos contra la infección por patógenos. Un componente fundamental de la respuesta inmune innata, el estallido respiratorio de fagocitos, genera especies reactivas del oxígeno que matan los microorganismos invasores. Se describe un ensayo de estallido respiratorio que cuantifica las especies reactivas del oxígeno producido cuando la respuesta inmune innata es inducida químicamente.

Cuantificación de la respuesta estallido respiratorio como un indicador de la salud inmune innata en el pez cebra

El estudio de los primeros eventos de la progresión de células preneoplásicas y la interacción célula inmune innata es fundamental para entender y tratar el cáncer. Aquí se describe un método para inducir condicionalmente transformaciones de células epiteliales y la formación de imágenes en directo posterior de la interacción de células inmune innato con HRAS G12V expresando células de la piel en las larvas de pez cebra.

Imágenes en vivo de inmune innata y preneoplásicas Interacciones de celda que utilizan un sistema de expresión / UAS Inducible Gal4 en larvas de pez cebra de la piel

Los embriones de pez cebra ópticamente transparentes se utilizan ampliamente para estudiar y visualizar en tiempo real las interacciones entre los microorganismos patógenos y las células inmunitarias innatas. La microinyección de Mycobacterium abscessus, combinada con imágenes de fluorescencia, se utiliza para examinar las características patógenas esenciales, como la formación del cordón en los embriones de pez cebra.

Descifrar e imagen Patogénesis y Cording de<em&gt; Abscessus Mycobacterium</em&gt; En embriones de pez cebra

Se demuestran modelos de infección sistémica y localizada del pez cebra por el virus de la influenza A humana. Utilizando un modelo de infección sistémica, el pez cebra se puede utilizar para detectar medicamentos antivirales. Utilizando un modelo de infección localizada, el pez cebra puede utilizarse para caracterizar las respuestas de las células inmunitarias del huésped.

El uso de modelos de pez cebra de Infecciones por Virus de la Influenza Humana A a la pantalla medicamentos antivirales y caracterizar inmune del huésped respuestas de las células

El presente estudio describe un modelo de embrión de pez cebra para visualización in vivo y análisis intravital de infecciones asociadas a biomateriales en el tiempo basado en microscopía de fluorescencia. Este modelo es un sistema prometedor complementando modelos animales mamíferos como los modelos de ratón para el estudio de las infecciones asociadas a biomateriales en vivo.

Un modelo de embrión de pez cebra para In Vivo visualización y análisis Intravital de Biomaterial asociados Staphylococcus aureus infección

Aprende a realizar microinyección de Streptococcus iniae en la vesícula ótica de larvas de pez cebra para estudiar la respuesta inmune innata mediante imagen no invasiva en vivo.

Imagen no invasiva de la respuesta inmune innata en un modelo de larvas de pez cebra de

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