Name: Ensayo Invasión polluelo corazón para probar la invasividad de las células del cáncer y de la actividad de los compuestos potencialmente anti-invasivos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Aprende un método de cultivo de órganos para estudiar la invasión tumoral en tres dimensiones utilizando fragmentos de corazón de pollo embrionario. Esta técnica permite evaluar compuestos antiinvasivos potenciales.

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Agradecemos a Marleen De Meulemeester por demostrar la técnica de ensayo en la película de vídeo. B. I. R. es investigadora postdoctoral de la Fundación de Investigación de Flandes (FWO – Vlaanderen). L.M.M. ha recibido una beca Emmanuel van der Schueren de la Liga Flamenca contra el Cáncer (Vlaamse Liga tegen Kanker).

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Durante la preparación de PHFs, los fragmentos no pueden permanecer en suspensión, pero se adhieren a la pared del vaso; esto se puede superar mediante el aumento del volumen del medio de cultivo. Si el número de PHFs es demasiado bajo y su tamaño es demasiado grande, disminuir el volumen del medio de cultivo. El fallo de las células de ensayo a agregarse puede ser debido a las fluctuaciones en la temperatura o a la infección microbiana. Alternativamente, una incapacidad para agregado puede ser una característica intrín...

Invasion es el sello de tumores malignos. Esta actividad no sólo lleva a la destrucción de los tejidos circundantes, pero también está implicada en la formación de metástasis. Dado que los pacientes de cáncer mueren a causa de la invasión y la metástasis, y tratamientos anti-invasivos eficientes son todavía escasos, ensayos de laboratorio que imitan la invasión de las células tumorales se han desarrollado. El objetivo del ensayo de corazón de pollo es ofrecer un método de cultivo de órganos relevante para estudiar la invasión tumoral en tres dimensiones. El ensayo puede distinguir entre células invasivas y no invasivas, y permite estudiar los efectos de los compuestos de ensayo sobre la invasión tumoral. La razón detrás de la utilización del ensayo es el concepto actual de que los tumores son ecosistemas donde las células neoplásicas interactúan continuamente con su estroma (células huésped y la matriz extracelular), y que a través de estas interacciones invasión molecular es afinado 1. Así, en el ensayo de células tumorales se enfrentan a Livifragmentos ng embrionarias corazón polluelo 2, que sirven no sólo como sustratos para la invasión por las células tumorales, sino también como una fuente de diferentes tipos de células del estroma y elementos de la matriz. El corazón de pollo contiene miocitos, fibroblastos y células endoteliales, y la matriz extracelular se compone de laminina, fibronectina y diferentes tipos de colágeno. De esta manera, la técnica de cultivo de órganos tridimensional cubre muchas interacciones celulares y moleculares implicados en la invasión de los tumores de los pacientes. La principal ventaja del ensayo de corazón de pollo es la implementación de los efectos del estroma. Este aspecto es más completa que en otros ensayos de invasión in vitro que se basan en invasión de células tumorales en geles no vivos compuestas de membrana basal o matriz intersticial 3 4 moléculas. El concepto de la confrontación entre las células tumorales y tejidos normales huésped vivo como se encuentra en cultivo de órganos experimentación se ha introducido por variosautores como Wolff y Schneider en Francia 5, Easty y Easty en el Reino Unido el 6 y 7 Schleich en Alemania. Dos ventajas técnicas de la invasión de ensayo corazón polluelo en los métodos citados es que el volumen de los fragmentos puede ser fácilmente estandarizada, y que permanecerá contráctil, que permite la monitorización integridad funcional durante el cultivo de órganos. Además, se prefieren los embriones de aves, ya que fácilmente pueden ser diseccionados desde el contenido estéril del huevo. El ensayo tiene semejanza conceptual para el ensayo de membrana corioalantoidea de pollo 8 ofreciendo un complejo del estroma que rodea a las células tumorales. El ensayo se ha aplicado con éxito para distinguir entre variantes de células invasivas y no invasivas de los mismos tumores humanos, tales como en el MCF-7 (mamaria) 9 y HCT-8 (colon) 10 familias línea celular. La técnica es útil para ensayar compuestos potencialmente anti-invasivos, así <sup&gt; 11,12. Como se explica más, que puede ser utilizado para el establecimiento de las relaciones estructura-actividad de pequeñas moléculas orgánicas. El ensayo, sin embargo, no toma en cuenta la contribución de las células inmunológicas de la invasión del cáncer. Cabe destacar que la técnica no puede considerarse como un sistema de análisis de alto rendimiento, debido al alto número de manipulaciones, el número limitado de pistas de ensayo (máximo 30 culturas) y el largo tiempo de vuelco (alrededor de 1 mes).

<table><tbody><tr><td>Solución salina de Ringer</td><td>Braun</td><td>CEO123</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-agar</td><td>Becton Dickinson</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Tris-(hidroximetil)-aminometano Analar</td><td>VWR</td><td>103157P</td><td></td></tr><tr><td>BSA : albúmina de suero bovino, cohn V fract.</td><td>Sigma</td><td>A4503-500G</td><td></td></tr><tr><td>MEM-Rega 3</td><td>Tecnologías de la Vida&nbsp;</td><td></td><td></td>19993013</tr><tr><td>Agitadores giratorios</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>G10 y G33</td><td></td></tr><tr><td>Frascos Erlenmeyer 50 ml</td><td>Novolab</td><td>92717</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de vidrio</td><td>Novolab</td><td>68516</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de iridectomía</td><td>Rumex</td><td>11-0625</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio con rejilla ocular calibrada</td><td>Wild</td><td>157702</td><td></td></tr><tr><td>Cera de parafina</td><td>International Medical products</td><td>8599956</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma</td><td>230251-25g</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina de Harris</td><td>Sigma</td><td>HHS32-1L</td><td></td></tr><tr><td>Resina de recubrimiento (Tissue-Tek)</td><td>Sakura</td><td>4494</td><td></td></tr><tr><td>Aparato de fusión de parafina</td><td>GFL</td><td>1052</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo para el corte de parafina</td><td>Reichert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stppers para matraces Erlemeyer con entradas y salidas de gas</td><td>Novolab</td><td>2602421 y 260243</td><td></td></tr><tr><td>Diaminobenzidina</td><td>Sigma</td><td>D8001</td><td></td></tr><tr><td>MECEDORA REAX</td><td>Heidolph</td><td>54131</td><td></td></tr><tr><td>Platos de papel tisú de 24 pocillos</td><td>VWR</td><td>NUNC142475</td><td></td></tr><tr><td>cuchara de enucleación oftalmológica</td><td>Rumex</td><td>16-060</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas afiladas</td><td>Rumex</td><td>4-111T</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas romas</td><td>Nickel-Electro LTD</td><td>7112</td><td></td></tr><tr><td>Matraces Erlenmeyer 5 ml</td><td>Novolab</td><td>211901</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio lavados y desengrasados</td><td>International Medical Products</td><td>8613908</td><td></td></tr></tbody></table>

ensayo invasión polluelo corazón para probar la invasividad de las células del cáncer y de la actividad de los compuestos potencialmente anti-invasivos

Chick Heart Invasion Assay for Testing the Invasiveness of Cancer Cells and the Activity of Potentially Anti-invasive Compounds

El objetivo del ensayo de corazón de pollo es ofrecer un método de cultivo de órganos relevante para estudiar la invasión tumoral en tres dimensiones. El ensayo puede distinguir entre células invasivas y no invasivas, y permite el estudio de los efectos de los compuestos de ensayo sobre la invasión tumoral. Las células cancerosas - ya sea en forma de agregados o células individuales - se enfrentan a fragmentos de corazón de embriones de pollo. Después de cultivo de órganos en suspensión durante unos pocos días o semanas los cultivos que se enfrenta son fijos y embebidos en parafina para análisis histológico. La interacción tridimensional entre las células cancerosas y el tejido normal es entonces reconstruida a partir de secciones en serie teñidas con hematoxilina-eosina o después de la tinción inmunohistoquímica para epítopos en el tejido del corazón o las células cancerosas que se enfrentan. El ensayo es consistente con el concepto reciente que la invasión del cáncer es el resultado de interacciones moleculares entre las células cancerosas y sus elementos de acogida del estroma vecina (miofibroblastos, endothElial células, componentes de la matriz extracelular, etc.). Aquí, este entorno estromal se ofrece a las células del cáncer como un fragmento de tejido vivo. Apoyo a los aspectos a la pertinencia del ensayo son múltiples. Invasión en el ensayo es de acuerdo con los criterios de la invasión del cáncer: ocupación progresiva y servicios de sustitución en el tiempo y el espacio del tejido del huésped, y la invasividad y no invasividad in vivo de las células que se enfrentan generalmente se correlaciona con el resultado del ensayo. Además, el patrón de invasión de las células in vivo, tal como se define por los patólogos, se refleja en las imágenes histológicas en el ensayo. Cuantitativa relación estructura-actividad (QSAR) el análisis de los resultados obtenidos con numerosos compuestos congéneres orgánicos potencialmente anti-invasivos permitió el estudio de las relaciones estructura-actividad de los flavonoides y chalconas y medicamentos anti-metastásicos conocidos utilizados en la clínica (por ejemplo, inhibidores de microtúbulos ) inhibir la invasión en el ensayo como bien. However, el ensayo no tiene en cuenta las contribuciones inmunológicas a la invasión del cáncer.

Las secciones histológicas como se presenta en la Figura 5 muestran el resultado final de un número de ensayos exitosos. La histología sonido de las culturas indica células viables y permite interpretar la interacción entre las células tumorales y tejido normal. Además, ninguna reacción inmune del tejido normal se puede observar, lo que confirma la edad correcta de los embriones de pollo utilizados por ejemplo, antes de que se desarrolló el sistema de rechazo inmunológico. No hay bacterias visibles, lo que indi...

A continuación, presentamos un protocolo para estudiar la invasión de las células tumorales en fragmentos de tejido normal que vive en tres dimensiones. Esta técnica de cultivo de órganos se aplica principalmente para probar fármacos potencialmente anti-invasivos in vitro.

Ensayo Invasión polluelo corazón para probar la invasividad de las células del cáncer y de la actividad de los compuestos potencialmente anti-invasivos

The goal of the chick heart assay is to offer a relevant organ culture method to study tumor invasion in three dimensions. The assay can distinguish ...

El objetivo general de este procedimiento es ofrecer un método de cultivo de órganos relevante para estudiar la invasión tumoral en tres dimensiones. Esto se logra primero preparando fragmentos de tejido normal obtenidos de corazones de pollos embrionarios. En el segundo paso, se preparan agregados de células tumorales en suspensión.Los agregados de células tumorales se confrontan luego individualmente con fragmentos de tejido normal sobre una base de agar semisólido para su incubación en cultivo de suspensión. En la etapa final, los cultivos confrontados se fijan para inclusión en parafina y seccionado histológico. Finalmente, la invasión de las células tumorales en los fragmentos de tejido puede visualizarse mediante análisis microscópico seriado de las secciones tisulares.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como los ensayos de invasión con geles, es que con este método las células tumorales se enfrentan a fragmentos de tejido vivo tridimensionales. Las implicaciones de esta técnica se extienden al tratamiento del cáncer, ya que existe una necesidad insatisfecha de fármacos antiinvasores. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades, y la razón es que pasan por alto la importancia de utilizar las dimensiones específicas del fragmento de tejido y de los agregados de células tumorales.Aunque este método puede proporcionar información sobre la invasión cancerosa, también puede aplicarse a otros sistemas. Por ejemplo, estudiar la invasión de tejidos periféricos por células inflamatorias o la integración de células madre en tejido cardíaco. En cultivo supremo, los fragmentos de corazón de pollo comienzan incubando un huevo fertilizado a 37 grados Celsius durante nueve días.En el día nueve, desinfecte el cascarón con etanol al 70%. Luego, en un gabinete de cultivo de tejidos, use pinzas romas para abrir el cascarón. A continuación, coloque una cuchara de enucleación alrededor del cuello del embrión y extraiga el embrión del cascarón.Coloque el embrión en una placa de Petri de vidrio de cinco centímetros de diámetro que contenga cinco mililitros de solución salina de Ringer. Luego, sosteniendo una pinza fina en cada mano, abra la piel torácica ventral, retire el esternón y use tijeras de iridectomía para extraer el corazón y desconectar sus principales vasos sanguíneos.Transfiera el corazón a un nuevo recipiente de vidrio de cinco centímetros de diámetro que contenga cinco mililitros de medio de cultivo, suplementado con 5% de suero bovino fetal, bajo un microscopio con una cuadrícula ocular calibrada. Utilizando tijeras de microdisección, reseque el tercio craneal superior del corazón para eliminar las aurículas y los vasos asociados.Luego, use pinzas finas para diseccionar el pericardio de los ventrículos. A continuación, realice un corte hemisagital en los ventrículos y elimine la sangre. Posteriormente, transfiera los ventrículos a otra placa de Petri de cinco centímetros con cinco mililitros de medio de cultivo fresco y suero bovino fetal, y corte el tejido en fragmentos de 0,4 milímetros de diámetro.Una vez que se hayan cortado todos los ventrículos, gire suavemente el recipiente para dirigir todos los fragmentos hacia el centro del mismo. A continuación, utilice una aguja de acero inoxidable para mover todas las Cora Eliana hacia la periferia de la placa de Petri. Ahora use una pipeta de Pasteur de vidrio para transferir los fragmentos cardíacos a un matraz Erlenmeyer de 50 mililitros cubierto con una fina película de cultivo.Gasificar el matraz con un 5% de dióxido de carbono e incubar los fragmentos en un agitador rotatorio a 37 grados Celsius con 70 revoluciones por minuto durante 24 horas. Al día siguiente, transferir los fragmentos a una placa de Petri y usar una aguja para descartar el Corporal Eliana, los fragmentos necróticos oscuros y cualquier conglomerado de tejido. Incubar los fragmentos en un matraz erlenmeyer de 50 mililitros que contiene seis mililitros de medio de cultivo en el agitador rotatorio durante otras 60 horas; dos días y medio después, usar el microscopio y las agujas para seleccionar los fragmentos esteroideos que presenten una capa delgada y homogénea de células fibroblásticas y un diámetro de 0,4 milímetros.Luego, transfiera los fragmentos de corazón precultivados a otra placa de Petri que contenga medio de cultivo fresco. Tres días antes del inicio del cultivo confrontante, suspenda 100.000 células de prueba por mililitro en seis mililitros del medio de cultivo adecuado en un matraz erlenmeyer de 50 mililitros. A continuación, incube el matraz en un agitador giratorio a 37 grados Celsius y 70 revoluciones por minuto con el porcentaje adecuado de dióxido de carbono.Después de 72 horas, observe los agregados al microscopio y seleccione los agregados celulares esteroideos con un diámetro de 0,2 milímetros. A continuación, transfiera ocho de los fragmentos cardíacos precultivados de 0,4 milímetros, suspendidos en una cantidad mínima de medio de cultivo, a una placa de reloj de vidrio que contenga medio de agar semisólido.Mueva los fragmentos hacia un círculo y utilice un pequeño trozo de papel de filtro para aspirar el medio en exceso. Coloque 10 de los agregados de células esteroides de 0,2 milímetros dentro del círculo. Después de eliminar el medio en exceso, desplace un agregado hacia cada uno de los fragmentos cardíacos previamente cultivados hasta que entren en contacto entre sí.Ahora, selle la tapa del vidrio de reloj con parafina e incube el cultivo conjunto a 37 grados Celsius durante cuatro a 24 horas, dependiendo de las propiedades adhesivas de las células de prueba a los fragmentos cardíacos precultivados. Al final de la incubación, sumerja un par confrontado en medio de cultivo precalentado a 37 grados Celsius, y utilice una pipeta Pasteur para transferir cada par a frascos individuales de Erlenmeyer de cinco mililitros que contengan 1,5 mililitros de medio de cultivo cada uno. Luego, incube los frascos en un agitador rotatorio a 37 grados Celsius y 120 revoluciones por minuto, con el porcentaje adecuado de dióxido de carbono burbujeado. Dos frascos Erlenmeyer suplementarios de cinco mililitros llenos con dos mililitros de solución salina de Ringer para el análisis histológico de las confrontaciones.Al final del período de incubación, transfiera los cultivos a solución salina de Ringer durante unos segundos para eliminar las proteínas séricas. A continuación, transfiera las peras a placas de Petri individuales de tres centímetros que contengan tres mililitros de solución Bowen Holland. Después de dos horas, enjuague los cultivos tres veces con tres mililitros de agua desmineralizada antes de incubarlos en agua del grifo durante dos horas para eliminar la mayor cantidad posible de solución fijadora.Finalmente, transfiera los pares a tres mililitros de etanol al 70% cada uno durante varios días como máximo. En estas imágenes de cultivos exitosos, no se observa ninguna reacción inmunitaria por parte del tejido normal ni en el tejido tumoral ni en el cardíaco, lo que confirma que los embriones de pollo se utilizaron antes del desarrollo del sistema de rechazo inmunitario. Asimismo, no hay bacterias visibles, lo que indica ausencia de contaminación evidente durante el período de cultivo.Además, la periferia redondeada de las secciones confirma que los cultivos existieron en suspensión sin signos de adherencia temporal a la pared del matraz erla mire. Muchos compuestos han sido probados con este ensayo de invasión de corazón de pollo. Para aquellos que eran estructuralmente relacionados, se estableció una relación cuantitativa entre la estructura y la actividad basada en los resultados del ensayo, con datos que demuestran una clara correlación entre las actividades antiinvasivas predichas y experimentales.De hecho, esta matriz de confusión puede utilizarse para resumir las debilidades y fortalezas del ensayo, proporcionando una expresión aproximada de la precisión y la reproducibilidad del experimento. Al intentar este nuevo procedimiento, es extremadamente importante adherirse estrictamente a las dimensiones prescritas de los fragmentos de tejido siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la confrontación con células no cancerosas, para responder preguntas adicionales, como ¿invaden las células inflamatorias?Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo discriminar entre células tumorales invasivas y no invasivas. No olvide que trabajar con fijadores puede ser extremadamente peligroso y que se deben tomar precauciones, como la ventilación de aire, al realizar este procedimiento.

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Este video muestra la forma de medir la invasión de las células a través de insertos de cultivo celular utilizando una metodología basada en fluorescencia.

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A tiempo real Técnica de Impedancia Eléctrica base para medir la invasión de monocapa de células endoteliales de las células cancerosas

El flujo de fluido intersticial es elevada en los tumores sólidos y puede modular la invasión de células tumorales. Aquí se describe una técnica para aplicar el flujo de fluido intersticial a las células embebidas en una matriz y luego medir sus efectos sobre la invasión de células. Esta técnica se puede adaptar fácilmente para estudiar otros sistemas.

Tridimensional de la célula modelo de cultivo para medir los efectos del flujo del fluido intersticial en la invasión de células tumorales

Este video describe un ensayo de invasión utilizando una matriz de tres cámaras basada en la impedancia eléctrica. Esta técnica mide el potencial invasivo de las células cancerosas bajo la influencia de factores solubles secretados por las células estromales residentes en microambientes tumorales.

Ensayo de impedancia basado en matrices de tres cámaras: una técnica de análisis en tiempo real para evaluar el potencial invasivo de las células cancerosas mediante la medición de la impedancia eléctrica

De uso general, se describen métodos muy accesibles para el examen de la migración celular y la invasión in vitro. El primer método es el ensayo de cierre de la herida de células que mide la motilidad celular. El segundo método es la migración y la invasión de ensayo Transwell que evalúa la quimiotaxis y la capacidad invasiva de las células.

En la migración celular y la invasión ensayos in vitro

Este artículo de video describe un método in vitro modificado para examinar el papel de las hormonas, citocinas y/o factores de crecimiento en la invasión de células cancerosas.

Un Modificado<em&gt; In vitro</em&gt; Invasión Ensayo para determinar el papel potencial de hormonas, citoquinas y / o factores de crecimiento en la invasión de células del cáncer de Mediación

Este método evalúa la invasión de células cancerosas desde esferoides a una matriz 3D circundante.  Los esferoides se generan mediante el método de cultivo de gota colgante y luego se incrustan en una matriz compuesta por materiales de membrana basal y colágeno tipo I.  Posteriormente, se monitorea la invasión de los esferoides.

Un Cancer Cell esferoide Ensayo para evaluar la invasión en un entorno 3D

Este protocolo describe un ensayo de invasión vertical invertido que podría ser utilizado para cuantificar la capacidad de migración y la invasión de las células en un entorno tridimensional conservando el microambiente celular. Este ensayo es adecuado para las células raras o sensibles.

Mover hacia arriba: Un Simple y Flexible In Vitro invasión tridimensional protocolo

El ensayo de invasión celular in vitro se utiliza para medir el potencial de la metástasis del cáncer mediante la cuantificación del potencial celular de invasión y migración utilizando inserciones de cultivo celular que contienen matriz proteica. Las células tienen el desafío de migrar a través de la matriz proteica y una membrana porosa, hacia un quimioatractor, y luego cuantificadas por microscopía ligera.

El uso de células tumorales mamarias de ratón en un ensayo de invasión in vitro como medida del comportamiento de las células oncogénicas

Este es un método eficaz para detectar supresores o impulsores de metástasis del cáncer. Las células, transducidas con una biblioteca de expresión, se inyectan en la vasculatura de la membrana corioalantoica del pollo para formar colonias metastásicas. Las colonias que han disminuido o aumentado la invasividad se extirpan, se expanden, se reinyectan para confirmar su fenotipo y, finalmente, se analizan mediante secuenciación de alto rendimiento.

Descubrimiento de reguladores metastásicos utilizando un modelo de membrana corioalantoica intravital de pollitos rápido y cuantitativo

Describimos un enfoque para detectar y capturar subpoblaciones celulares invasivas en tiempo real. El diseño experimental utiliza el análisis celular en tiempo real mediante el monitoreo de los cambios en la impedancia eléctrica de las células. Se pueden capturar células invasivas de cáncer, inmunes, endoteliales o estromales en tejidos complejos y se puede evaluar el impacto de los cocultivos.

Detección y captura en tiempo real de subpoblaciones celulares invasivas a partir de cocultivos

Aprende un método de cultivo de órganos para estudiar la invasión tumoral en tres dimensiones utilizando fragmentos de corazón de pollo embrionario. Esta técnica permite evaluar compuestos antiinvasivos potenciales.

Ensayo Invasión polluelo corazón para probar la invasividad de las células del cáncer y de la actividad de los compuestos potencialmente anti-invasivos (Video) | JoVE Journal

Ensayo Invasión polluelo corazón para probar la invasividad de las células del cáncer y de la actividad de los compuestos potencialmente anti-invasivos

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