Name: Qué hacer y qué no hacer en la preparación de Muscle criosecciones de Análisis histológico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Aprende a preparar secciones congeladas de biopsias musculares evitando artefactos de congelación mediante congelación rápida, inclusión en OCT y tinción histológica. Este método preserva la integridad tisular para análisis precisos.

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Nos gustaría agradecer a Alex Miller por las revisiones de los manuscritos. Este trabajo fue apoyado con las becas de investigación otorgadas a M.G. de Cure CMD, Struggle Against Muscular Dystrophy (SAM) y Muscular Dystrophy Association (218938).

1. Tejido Cosecha y congelación de los tejidos musculares <ol><li> La eutanasia del ratón con una sobredosis de isoflurano (2-cloro-2- (difluorometoxi) -1,1,1-trifluoro-etano). Realice este paso en una campana de extracción y el uso de un método de contención secundaria, como un secador o una campana de vidrio que contiene un hisopo de algodón empapado en isoflurano. </li><li> Confirmar la muerte apretando firmemente la almohadilla plantar. Use un método secundario de la eutanasia como la dislocación cervical. </li><li> Humedezca la piel con alcohol al 70% para reducir la adherencia de los cabellos sueltos sobre los músculos. Pelar la piel de la extremidad utilizando unas pinzas finas como el # 5. </li><li> Separar cuidadosamente el músculo de interés (tibial anterior (TA) en este caso) de los huesos por debajo, a partir de tendón y quitar. </li><li> Extirpar el músculo, cubrirlo en octubre (compuesto temperatura óptima de corte), y déjelo sobre un molde de congelación desechables etiquetados. Asegúrese de que el músculo está en su orientación fisiológica normal (cabeza para tail) sin estirar. Alternativamente, congelar el músculo en pequeños cuadrados de espuma de poliestireno y el pin con alfileres de insectos para asegurar la longitud correcta de los músculos. </li><li> Chill 2-metilbutano (isopentano) en un vaso de precipitados de acero usando nitrógeno líquido. Esto toma en promedio 3-5 min. Mantener la agitación intermitente hasta precipitados blancos comienzan a formarse en la parte inferior y las paredes del vaso de precipitados. NOTA: Cuando esto ocurre, isopentano ha alcanzado la temperatura óptima de congelación (-150 ° C) </li><li> Sumerja los moldes que contienen músculos en el frío 2-metilbutano. Congele pequeños músculos como el diafragma y el extensor largo del dedo dedos (EDL) durante 6-12 segundos y músculos más grandes como el sóleo gastrocnemio (GS) y tríceps de 15 a 20 seg. No congelar los músculos durante demasiado tiempo ya que esto puede conducir a la rotura. </li><li> Transferir los tejidos congelados sobre hielo seco y dejar que se evapore isopentano (tenga en cuenta que este proceso toma en promedio alrededor de 15 a 20 min). Envuelva los tejidos en papel de aluminio y almacenarlos en ultra baja temperatura (-70 ° C a -80 ° C) hasta el corte. </li></ol> 2. Incorporación de los tejidos en octubre preparar Tissue Bloquear <ol><li> Tejidos Transporte en hielo seco para cyrostat para evitar la descongelación. Transferencia de tejido a criostato cámara (establecido a de -20 a -24 ° C para evitar la descongelación completa de los tejidos) y dejar que se equilibren durante 30 min. </li><li> Gire la bahía Peltier de enfriamiento en. Si el criostato no tiene este enfriamiento, utilice aerosol spray de refrigeración para congelar rápidamente la OCT. No deje que el deshielo del músculo en cualquier momento durante la incrustación ya que esto puede resultar en daños por congelación. </li><li> Añadir una fina capa uniforme de octubre en el disco muestra y dejar enfriar. Cuando la mayoría de la OCT se congela en el fondo mientras que todavía líquido en la parte superior, inserte el tejido en la orientación correcta (perpendicular a octubre para las secciones transversales y paralelas a octubre de secciones longitudinales). Utilice aerosol spray de refrigeración para congelar rápidamente octubre Toque la parte unembeded del tejido con el calor extractor y esperar 45 seg. </li><li> Añadir otra capa delgada de octubre alrededor del músculo, rociar con aerosol spray de enfriamiento y extraer el calor como en el paso anterior. </li><li> Mantenga la adición de octubre en pequeños incrementos y rápidamente congelar el octubre mediante una combinación de aspersión y extractor de calor de refrigeración aerosol hasta que el músculo está cubierto. </li><li> Ponga el extractor de calor en la parte superior del bloque de tejido y esperar 5 min. </li></ol> 3. Preparación de las secciones e identificación de las Secciones de Mid-vientre Región de los músculos <ol><li> Montar la muestra sobre la cabeza de la muestra. Apriete la perilla para asegurar el disco. Asegúrese de que el disco de la muestra se encuentra en buen contacto con la cabeza de la muestra. </li><li> Ajuste la temperatura de la cámara a entre -21 y -24 ° C y espere hasta que se alcanza la temperatura programada. </li><li> Ajuste los valores de espesor (7 micras); recortar el bloque mediante el avance o retroceso del bloque usando ajustes gruesos y finos. </li><li> Recoge las seccionesen pre-calentado portaobjetos cargados positivamente presionando la parte superior de la diapositiva en secciones, con la atracción entre cargas opuestas para facilitar la adherencia de las secciones cortadas a la diapositiva. </li><li> Identificar las secciones mediados de vientre mediante la medición de área de sección transversal (CSA) de las secciones. Para ello, el software de imágenes usando en el equipo que está conectado al microscopio. NOTA: Las imágenes de contraste de fase se toman y la circunferencia de todo el músculo se mide a través de una función de seguimiento del programa de software. Esto producirá tanto CSA así como hurón diámetro mínimo (medida de la fibra de tamaño de sección transversal que se expresa como la distancia más pequeña entre dos tangentes paralelas en lados opuestos de una partícula) mediciones. Nota: Cuando las mediciones CSA y diámetro mínimo hurón comienzan a estabilizarse, se ha llegado a mediados del vientre. </li><li> Inventario y archivar las diapositivas a -80 ° C para la tinción futuro. NOTA: octubre no tiene que ser eliminado antes de staininprocedimientos g. Una vez portaobjetos se cubrieron, que están listos para ser manchado inmediatamente. </li></ol> 4. La tinción NOTA: Si bien los procedimientos detallados paso a paso se pueden encontrar en la hoja de datos del producto y se deben seguir los procedimientos de tinción, la optimización del personal puede ser requerido para obtener la tinción óptima. <ol><li> Debido a que los medios de montaje (véase la tabla) no es miscible con agua, deshidratar diapositivas a través crecientes grados de alcohol (2 min cada uno en 70%, 95%, y 100% de etanol) y claro ellos con xileno (100% durante 5 min) para asegurar diapositivas no se vuelven opacas en el tiempo. </li><li> Cubreobjetos secciones y déjelos secar. Imagen con microscopio equipado con software de imágenes. </li></ol>

<ol><li>Bonnemann, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+approach+to+the+congenital+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+disorders+%3A+NMD%22%5BJournal%5D)">Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies.</a> Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).</li>
<li>Caughey, J. E., Pachomov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diaphragm+in+dystrophia+myotonica%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The diaphragm in dystrophia myotonica.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 22, 311-313 (1959).</li>
<li>Fetterman, G. H., Wratney, M. J., Donaldson, J. S., Danowski, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscular+dystrophy.+I.+History%2C+clinical+status%2C+muscle+strength%2C+and+biopsy+findings%5BTitle%5D)+AND+%22AMA+J+Dis+Child%22%5BJournal%5D)">Muscular dystrophy. I. History, clinical status, muscle strength, and biopsy findings.</a> AMA J Dis Child. 91, 326-338 (1956).</li>
<li>Platzer, A. C., Chase, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+Alterations+in+Preclinical+Mouse+Muscular+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Histologic Alterations in Preclinical Mouse Muscular Dystrophy.</a> The American journal of pathology. 44, 931-946 (1964).</li>
<li>Mercuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+magnetic+resonance+imaging+involvement+in+muscular+dystrophies+with+rigidity+of+the+spine%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Muscle magnetic resonance imaging involvement in muscular dystrophies with rigidity of the spine.</a> Ann Neurol. 67, 201-208 (2010).</li>
<li>Tasca, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+molecular+signatures+in+magnetic+resonance+imaging-staged+facioscapulohumeral+muscular+dystrophy+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Different molecular signatures in magnetic resonance imaging-staged facioscapulohumeral muscular dystrophy muscles.</a> PloS one. 7, e38779(2012).</li>
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<li>Kumar, A., Yamauchi, J., Girgenrath, T., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-specific+expression+of+insulin-like+growth+factor+1+improves+outcome+in+Lama2Dy-w+mice%2C+a+model+for+congenital+muscular+dystrophy+type+1A%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Muscle-specific expression of insulin-like growth factor 1 improves outcome in Lama2Dy-w mice, a model for congenital muscular dystrophy type 1A.</a> Human molecular genetics. 20, 2333-2343 (2011).</li>
<li>Mehuron, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+matricellular+proteins+is+an+early+signature+of+pathology+in+laminin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+muscle%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of matricellular proteins is an early signature of pathology in laminin-deficient muscular dystrophy.</a> Skeletal muscle. 4, 14(2014).</li>
<li>Yamauchi, J., Kumar, A., Duarte, L., Mehuron, T., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggering+regeneration+and+tackling+apoptosis%3A+a+combinatorial+approach+to+treating+congenital+muscular+dystrophy+type+1+A%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Triggering regeneration and tackling apoptosis: a combinatorial approach to treating congenital muscular dystrophy type 1 A.</a> Human molecular genetics. 22, 4306-4317 (2013).</li>
<li>Sheriffs, I. N., Rampling, D., Smith, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+wax+embedded+muscle+is+suitable+for+the+diagnosis+of+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+pathology%22%5BJournal%5D)">Paraffin wax embedded muscle is suitable for the diagnosis of muscular dystrophy.</a> Journal of clinical pathology. 54, 517-520 (2001).</li>
<li>Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde fixation.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33, 845-853 (1985).</li>
<li>Maccarty, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Diagnostic+Reliability+of+Frozen+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">The Diagnostic Reliability of Frozen Sections.</a> The American journal of pathology. 5, 377-380 (1929).</li>
<li>Shi, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+value+of+frozen+tissue+section+used+as+%27gold+standard%27+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the value of frozen tissue section used as 'gold standard' for immunohistochemistry.</a> Am J Clin Pathol. 129, 358-366 (2008).</li>
<li>Turan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+frozen+sections+for+intraoperative+diagnosis+of+complex+atypical+endometrial+hyperplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Pacific+journal+of+cancer+prevention+%3A+APJCP%22%5BJournal%5D)">Accuracy of frozen sections for intraoperative diagnosis of complex atypical endometrial hyperplasia.</a> Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP. 13, 1953-1956 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Histología e inmunohistoquímica se han utilizado como herramientas clave en la comprensión de la manifestación y la progresión de la patología en diversos trastornos neuromusculares. Clásicamente, las biopsias musculares se fijaron por primera vez en formaldehído y luego incrustados con cera de parafina. Si bien la fijación de formaldehído conserva la arquitectura del tejido y permite el almacenamiento y transporte del tejido a temperatura ambiente, también inactiva las enzimas y los entrecruzamientos proteínas que requ...

El examen de histología muscular juega un papel crítico en la comprensión de los diferentes tipos de trastornos neuromusculares 1-4. Cuando se combina con otras técnicas, permite a los investigadores para obtener una mejor idea de la manifestación y la progresión de la patología y también pueden ser esenciales para evaluar la eficacia de una intervención terapéutica 5-10. Sin embargo, para ser precisos, los tejidos necesitan ser conservado en la manera apropiada a fin de preservar el estado fisiológico inmediatamente antes de la escisión. Esto requiere gran cuidado durante la extracción, preservación, seccionamiento y tinción. Los tejidos pueden prepararse de dos maneras diferentes para estudio microscópico de luz. El primer método, formol fija en parafina (FFPE) secciones, requiere tejidos que se fijaron en formaldehído al 10% tamponada naturales antes de ser integrado con cera de parafina 11,12. La etapa de fijación ayuda a preservar la morfología mejor, pero también vínculos transversales pr endógenaoteins necesitando por lo tanto los procedimientos de recuperación de antígeno intrincada de inmunotinción y eliminando la posibilidad de tinción enzimática en tales secciones 12. Las secciones congeladas, por otra parte, no tienen que ser pre-fijo o procesados; por lo tanto, las proteínas son capaces de retener conformaciones biológicos nativos 13,14. Además, las secciones congeladas también permiten el tiempo de respuesta rápida, que a veces es necesario, por ejemplo en el diagnóstico intraoperatorio de los sarcomas y otros biopsias quirúrgicas 15. Sin embargo, si no se hace correctamente, este método es propenso a los daños por congelación, que introduce cambios en la arquitectura muscular haciendo las secciones no aptos para el examen histológico. En este trabajo se expondrá el método más eficaz para preparar las biopsias musculares para lograr tinción óptimo para examen adecuado.

<table><tbody><tr><td>Criostato</td><td>Leica CM 1850</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td>Buffalo Grove, IL 60089 U.S.A., teléfono de la oficina 1-800-248-0123 Alternativa: Richard Allen Scientific</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Nikon Eclipse 50i</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., Teléfono: 1-631-547-8500 Alternativa: Olympus</td></tr><tr><td>Software de análisis de imágenes</td><td>Nikon Software de imagen Investigación básica</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A., Teléfono: 1-631-547-8500 Alternativas: Imagen J, Metamorph</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>14043-220-05</td><td>JD Medical Dist. Co., Inc.</td><td>1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 U.S.A.</td></tr><tr><td>OCT</td><td>4583</td><td>Sakura Inc.</td><td>Torrence, CA 90501 U.S.A. Fuente alternativa: Leica Microsystem</td></tr><tr><td>Freeze It</td><td>23-022524</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. Fuente alternativa: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Molde de pañuelo desechable</td><td>22-363-554</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fuente alternativa: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Diapositivas Colorfrost plus</td><td>9991001</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fuente alternativa: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>650501-4L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Fuente alternativa: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Alcohol etílico</td><td>HC-1300-1GL</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fuente alternativa: VWR Scientific</td></tr><tr><td>2-metil butano</td><td>M 32631-SL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Fuente alternativa: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>HC-7001GA</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fuente alternativa: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Cytoseal 280</td><td>8311-4</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fuente alternativa: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Hematoxylin Gill #3</td><td>CS402-1D</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fuente alternativa: VWR</td></tr><tr><td>Scientific Eosin</td><td>6766007</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fuente alternativa: VWR Scientific</td></tr></tbody></table>

qué hacer y qué no hacer en la preparación de muscle criosecciones de análisis histológico

Do's and Don'ts in the Preparation of Muscle Cryosections for Histological Analysis

La evaluación histológica de las biopsias musculares ha servido como una herramienta indispensable en la comprensión del desarrollo y la progresión de la patología de los trastornos neuromusculares. Sin embargo, con el fin de hacerlo, el cuidado apropiado debe ser tomado cuando la escisión y la preservación de los tejidos para lograr tinción óptimo. Uno de los métodos de conservación de tejidos implica la fijación de tejidos en formaldehído y luego incrustarlos con cera de parafina. Este método preserva la morfología bien y permite el almacenamiento a largo plazo a temperatura ambiente pero es engorroso y requiere la manipulación de productos químicos tóxicos. Además, los resultados de fijación en formol antígeno entrecruzamiento, lo que requiere protocolos de recuperación de antígeno por inmunotinción eficaz. Por el contrario, seccionado congelado no requiere la fijación y por lo tanto retiene conformación antígeno biológica. Este método también proporciona una clara ventaja en vuelta rápida alrededor del tiempo, por lo que es especialmente útil en situaciones que requieren evaluación histológica rápida como intraoperaTIVE biopsias quirúrgicas. A continuación se describe el método más eficaz de preparar biopsias musculares para la visualización con diferentes tinciones histológicas e inmunológicas.

La puesta a punto para la cosecha y la congelación de los tejidos se puede ver en la Figura 1. Tejidos extirpados se deben almacenar en una gasa empapada en PBS para evitar el secado (Figura 1A). Cuando se seleccionan los tejidos a ser utilizado para el análisis histológico deben ser sumergidos en OCT y se presentarán en molde crio en la orientación adecuada y lo más cerca a la longitud fisiológica como sea posible para asegurar la morfología exacta (Figura 1B). Slurry ...

Aquí demostramos los métodos más eficientes para congelar, incrustar, crioseccionar y teñir biopsias musculares para evitar la congelación de artefactos.

Qué hacer y qué no hacer en la preparación de Muscle criosecciones de Análisis histológico

Histological evaluation of muscle biopsies has served as an indispensable tool in the understanding of the development and progression of pathology of ...

El objetivo general de este procedimiento es evitar errores al preparar secciones congeladas a partir de biopsias musculares, como la creación de artefactos por congelación. Esto se logra primero congelando rápidamente el músculo en dos butano metílico enfriado con nitrógeno líquido. Después de que las biopsias musculares se equilibran en el criostato, se incluyen en medio de temperatura óptima para corte a temperatura ambiente en pequeños incrementos, con congelación rápida mediante enfriamiento con aerosol y extracción de calor.A continuación, se cortan secciones de siete micrones y se transfieren a portaobjetos de vidrio cargados positivamente y tibios. El paso final consiste en teñir las secciones de tejido según sea necesario para evaluar la histología del tejido. En última instancia, las biopsias musculares correctamente preparadas dan como resultado una histología tisular bien preservada y sin artefactos por congelación.Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos existentes, como el corte de tejidos incluidos en parafina, es que es muy rápida y no altera la estructura ni la función del antígeno endógeno. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la biología muscular relacionadas con la salud y la enfermedad, tales como el crecimiento, la regeneración, la inflamación, la fibrosis y la necrosis. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico o tratamiento de trastornos musculares, ya que permite determinar el estado del músculo sano y enfermo.Aunque este método puede proporcionar información sobre diferentes formas de distrofia muscular, también puede aplicarse a otros sistemas, como la caquexia asociada con las etapas terminales del cáncer y el SIDA, y la pérdida de músculo en poblaciones ancianas. Comience por sacrificar un ratón con una sobredosis de isoflurano bajo una campana extractora y en un nivel secundario de contención, como un frasco de campana. Confirme la muerte del animal presionando firmemente su almohadilla plantar.Ahora, humedezca el pelaje con alcohol al 70 %. Esto evita que los pelos sueltos se adhieran a los músculos. Proceda retirando la piel de la extremidad utilizando una pinza fina número cinco.Separar cuidadosamente el músculo de interés del hueso comenzando desde el tendón. En este caso, se aísla el tibial anterior. Después de extirpar el músculo, cubrirlo con OCT y colocarlo plano sobre un molde desechable para congelación etiquetado.Se agregará más OCT posteriormente antes del corte. Asegúrese de que el músculo esté en su orientación fisiológica normal a lo largo del eje cabeza a cola y de que el músculo no esté estirado. Ahora enfríe.Coloque algo de isopentano en un vaso de acero inoxidable utilizando nitrógeno líquido. Agítelo intermitentemente durante tres a cinco minutos con una espátula de plástico. Cuando se forme un precipitado blanco, el isopentano estará a su temperatura óptima; en ese momento, sumerja los moldes cargados en la solución.Músculos pequeños como el diafragma y el extensor de los dedos más largo requieren de seis a 12 segundos. Los músculos más grandes requieren de 15 a 20 segundos, ya que la congelación excesiva puede provocar grietas. El siguiente paso consiste en colocar los tejidos congelados sobre hielo seco para permitir que el isopentano residual se evapore, lo cual tarda aproximadamente de 15 a 20 minutos.Una vez que el tejido esté seco, envuélvalo rápidamente en papel de aluminio y guárdelo en un congelador a menos 80 grados Celsius hasta que pueda seccionarse. Antes de la sección, transporte los tejidos congelados sobre hielo seco hasta el criostato.Transfiera el tejido a una cámara de criostato ajustada entre menos 24 y menos 20 grados Celsius, y déjelo equilibrar durante 30 minutos. Los tejidos no se descongelarán completamente a esta temperatura. A continuación, incluya primero el tejido.Si está disponible, encienda el enfriamiento de la cámara Peltier. En segundo lugar, aplique una capa fina y uniforme de OCT sobre el disco del espécimen y déjela enfriar. En tercer lugar, una vez que el OCT se haya congelado en la parte inferior pero aún esté líquido en la parte superior, inserte el tejido, orientando el tejido perpendicularmente al OCT para secciones transversales y paralelamente al OCT para secciones longitudinales.Ahora use un aerosol refrigerante para congelar rápidamente el OCT. Luego toque la parte no congelada del tejido con un extractor de calor y manténgalo en contacto con el tejido durante 45 segundos. No permita que el músculo se derrita en ninguna etapa de este proceso.Si el criostato no tiene refrigeración de bahía Peltier, utilice refrigeración con aerosol para congelar rápidamente el OCT alrededor del tejido. Ahora, agregue otra capa delgada de OCT alrededor del músculo rociando con aerosol refrigerante y extraiga el calor como en el paso anterior. Siga agregando OCT en pequeños incrementos y congele rápidamente el OCT utilizando una combinación de aerosol refrigerante y extractor de calor hasta que todo el músculo quede cubierto.Luego coloque el extractor de calor en la parte superior del bloque de tejido y espere cinco minutos antes de proceder con la sección. El espécimen ya está listo para montarse en la cabeza del espécimen. Primero, apriete el botón para asegurar el disco.Asegúrese de que el disco de la muestra esté en buen contacto con la cabeza del espécimen mientras la cámara alcanza entre menos 24 y menos 20 grados Celsius. Establezca el grosor del corte en siete micrones cuando la cámara esté a temperatura y comience a recortar el bloque. Utilice los ajustes grueso y fino para mover el bloque.Cuando los cortes estén listos para recolectarlos, presione sus lados superiores sobre portaobjetos cargados positivamente calentados con una lámpara. Si se congelaron correctamente, la cara del tejido debe ser blanca mate. Sin embargo, un tejido que se congeló incorrectamente o que se descongeló durante el proceso de montaje aparecerá de color rojo a rosado.Las muestras pueden almacenarse en el congelador profundo para análisis posteriores. La sección media del vientre del tejido puede identificarse midiendo el área de la sección transversal a partir de imágenes de contraste de fase, utilizando la función de trazado de un paquete de software de imágenes. Este análisis proporciona mediciones tanto del área como del diámetro mínimo de Feret.Cuando estas mediciones comienzan a estabilizarse, se ha alcanzado la parte media del vientre. Aunque los fabricantes proporcionan instrucciones paso a paso para la mayoría de los protocolos de tinción, puede ser necesario un ajuste personal para lograr intensidades óptimas de tinción. No es necesario eliminar el OCT.Para la tinción, con el fin de obtener una inmunotinción óptima, asegúrese de utilizar una cámara humidificada. Debe estar cubierta con perfil colocado sobre una toalla de papel húmeda y sellada en una caja pequeña para evitar el secado de las secciones. Durante el proceso de tinción para portaobjetos montados permanentemente sin inmunotinción, siga el protocolo de tinción y deshidrate los portaobjetos mediante concentraciones crecientes de alcohol.Dado que el medio de montaje no es compatible con el agua, limpie los portaobjetos sumergiéndolos durante cinco minutos en xileno al 100 %. Esto garantiza que los portaobjetos no se vuelvan opacos con el tiempo. A continuación, proceda al montaje e imagen de las secciones de la región media del vientre de los tibiales anteriores que fueron teñidas.Usando hematina y eosina. Las secciones que se procesan adecuadamente presentarán una morfología consistente y una tinción uniforme en toda la muestra. Los músculos procesados inadecuadamente, que presentan daño por congelación o descongelación prematura, parecen tener múltiples rupturas en la morfología y aspecto similar al del cereal desmenuzado.Se realizó también inmunohistoquímica en estas secciones. Las tinciones fueron satisfactorias. La fibronectina se tiñe en verde y la dapí se observa en azul.Después de ver este video, debería tener una comprensión completa de cómo preparar una buena sección congelada a partir de biopsias musculares para la evaluación de la arquitectura muscular. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente cuatro a cinco horas si todos estos pasos se realizan correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar prevenir el descongelamiento de los músculos tras seguir este procedimiento.Se pueden realizar otros métodos como la tinción inmunológica y la hibridación in situ para responder preguntas adicionales sobre crecimiento y regeneración.

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Investigación

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Medicina

Se demuestra en este vídeo son las técnicas de congelación para el flash y el corte del tejido cerebral de embriones de ratón. Consejos útiles para el uso del criostato se les da, incluyendo los métodos de solución de problemas que se pueden utilizar durante el corte para asegurar que las secciones de tejidos resultantes están libres de grietas y otras distorsiones.

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En este manuscrito, presentamos una plataforma de criohistología semiautomatizada de alto rendimiento para producir imágenes compuestas alineadas de múltiples medidas de respuesta a partir de varias rondas de imágenes fluorescentes en secciones congeladas de tejidos mineralizados.

De alto rendimiento, de múltiples imágenes Cryohistology de tejidos mineralizados

Este manuscrito describe un protocolo detallado para inducir la regeneración del músculo esquelético aguda en ratones adultos y posteriores manipulaciones de los músculos, tales como disección, congelación, corte, tinción de rutina, y miofibras análisis del área de la sección transversal.

La inducción de la regeneración muscular esquelético aguda por inyección Cardiotoxin

Consecutivos crio-secciones se recogen para permitir que las aplicaciones histológicas y enriquecimiento de ARN para mediciones de la expresión de genes usando las regiones adyacentes de un músculo esquelético solo ratón. ARN de alta calidad se obtiene a partir de 20 - 30 mg de cryosections y mediciones agrupadas están directamente comparación entre aplicaciones.

Cryosectioning de regiones contiguas de un músculo esquelético solo ratón para la expresión de genes y análisis histológicos

Este protocolo describe un procedimiento para congelar los tejidos musculares al sumergirse directamente en nitrógeno líquido. Este protocolo también pone de relieve un nuevo criovial que puede evitar el "efecto manta" de gas nitrógeno cuando los contactos de nitrógeno líquido la superficie del tejido de un espécimen.

A Multi-agujero criovial Elimina congelación Artifacts cuando los tejidos musculares se sumergen directamente en nitrógeno líquido

La autofagia activa se asocia con la regeneración muscular productiva, que es esencial para la activación de las células madre musculares (MuSC). Aquí, proporcionamos un protocolo para la detección in situ de LC3, un marcador de autofagia en MyoD-positivos MuSCs de secciones de tejido muscular de control y los ratones lesionados.

Tinción Inmunofluorescente In Situ de Autofagia en Células Madre Musculares

Aquí se describe un protocolo para el inmunoetiquetado directo de miofibers necróticas en criosecciones musculares. Las células necróticas son permeables a las proteínas séricas, incluyendo la inmunoglobulina G (IgG). Revelar la aceptación de IgG por miofibers permite la identificación y cuantificación de miofibers que sufren necrosis independientemente de la condición muscular.

Inmunoetiquetado Desgeneración de miofibra en biopsias musculares

Este protocolo describe los métodos utilizados para preparar las cuerdas vocales de las ratas para el estudio neuromuscular histoquímico.

Preparación de la cuerda vocal de la rata para análisis neuromusculares

La creciente evidencia indica que la infiltración excesiva de lípidos dentro del músculo esquelético resulta en lipotoxicidad y diabetes. Aquí, presentamos un protocolo completo, que incluye procesamiento de tejidos, tinción con Bodipy, adquisición de imágenes y análisis, para cuantificar el tamaño, la densidad y la distribución subcelular de las gotas lipídicas de una manera específica de tipo de fibra.

Tipo de fibra y análisis subcelular específico del contenido de gotas lipídicas en el músculo esquelético

Aprende a preparar secciones congeladas de biopsias musculares evitando artefactos de congelación mediante congelación rápida, inclusión en OCT y tinción histológica. Este método preserva la integridad tisular para análisis precisos.

Qué hacer y qué no hacer en la preparación de Muscle criosecciones de Análisis histológico

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