Modelo de ratón de rechazo vascular inducida por aloinmune y Arteriosclerosis Trasplante

El objetivo general de este procedimiento es realizar un trasplante heterotópico de aorta de extremo a extremo en ratones para estudiar el rechazo vascular y la arteriosclerosis del injerto. Esto se logra primero obteniendo un segmento de la aorta abdominal del ratón donante. Luego, el segmento se injerta ortotópicamente en la aorta intrarrenal de un receptor alogénico que es genéticamente distinto al donante.

En el paso final, se extirpa el segmento vascular trasplantado y se analiza el desarrollo de la arteriosclerosis del trasplante. En última instancia, la magnitud de la arteriosclerosis del trasplante y el rechazo vascular del aloinjerto mediado por el sistema inmunitario pueden evaluarse mediante la medición del engrosamiento íntimo y el estrechamiento luminal, así como mediante el análisis inmunohistoquímico del tejido para detectar la acumulación de células inmunitarias.

Por lo general, las personas nuevas en este procedimiento necesitan tiempo para familiarizarse con la técnica microquirúrgica, ya que requiere un alto nivel de destreza y mucha práctica para dominarla. Sin embargo, el método debería ser alcanzable para la mayoría de los investigadores con práctica y diligencia en pacientes. A continuación se muestra el procedimiento realizado por la Sra. Winnie, una neurocirujana talentosa, y Adam Roso, un estudiante de doctorado talentoso en mi laboratorio. Comience colocando al ratón donante en posición supina sobre una placa delgada y limpia de plexiglás envuelta en un campo estéril, bajo el microscopio quirúrgico con un aumento de 30x.

Después de confirmar una anestesia quirúrgica adecuada mediante la compresión del dedo del pie, use tijeras estériles para realizar una incisión media única desde el pubis hasta el proceso ZipID. A continuación, use un pequeño retractor para abrir las paredes abdominales y exponer la cavidad abdominal. Luego, use aplicadores de algodón estériles para retraer suavemente los intestinos hacia la parte superior del animal, hacia la izquierda.

Cubra el tejido con una gasa humedecida con solución salina y desplace los órganos reproductivos hacia la parte inferior para localizar la aorta infrarrenal y la vena cava inferior o VCI. Ahora utilice fórceps médicos número cinco para separar la aorta de la VCI en la arteria renal izquierda cerca de la bifurcación. Luego use suturas de poliamida monofilamento 10-0 para ligar las ramas pequeñas cercanas a la aorta.

Una vez que se haya separado la aorta donante y la VCI, sature el vaso con solución salina, cubra la cavidad expuesta con gasa humedecida y coloque al donante aparte en un área estéril. Ahora, coloque el ratón receptor bajo el microscopio y separe la aorta receptora de la VCI tal como se acaba de demostrar. A continuación, coloque dos pinzas microvasculares de cuatro milímetros, proximal y distal al segmento de interés, aproximadamente a cinco milímetros de distancia entre sí.

A continuación, utilizando microtijeras para disección de tubos, realice una aortotomía horizontal única y reseque no más de 0,5 milímetros de la aorta abdominal para acomodar el injerto aórtico del donante. Regrese al microscopio con el donante y seccione un segmento del injerto de tres a cuatro milímetros como se acaba de demostrar. Luego, utilice una aguja de calibre 25 y cinco octavos para lavar la aorta extirpada con solución salina heparinizada.

Teniendo cuidado de que la punta de la aguja no entre en contacto con el vaso, coloque el vaso en un recipiente con solución salina con heparina sobre hielo. Dentro de los 30 minutos posteriores a la escisión, coloque el injerto aórtico del donante en posición ortotópica en el receptor, haciendo coincidir la orientación anatómica respectiva del injerto con la del receptor. Luego, sujete suavemente la túnica externa del vaso y utilice la pinza número cinco para desviarlo ligeramente.

Ahora use la pinza para introducir una aguja unida a una sutura monofilamento de poliamida 10-0 a través de todo el grosor de la pared vascular, a fin de fijar el injerto aórtico del donante al vaso resecado del receptor para la colocación de puntos continuos. Coloque suturas de fijación a las nueve en ambos extremos, superior e inferior, del injerto. A continuación, comience en el extremo superior del injerto, desde las tres, con la anastomosis.

Cierre los extremos resecados con dos suturas continuas y asegure la sutura a la sutura de fijación. Luego gire el injerto y continúe la sutura continua hacia la parte dorsal del vaso. Encuentre el origen.

Punto de sutura de sujeción. Asegure la sutura sin aplicar mucha presión sobre el vaso, y repita la sutura para la anastomosis inferior. Una vez que la anastomosis esté completa.

Suelte la pinza microvascular distal para permitir el flujo sanguíneo retrógrado a través del vaso. Si no se observa sangrado, suelte la pinza proximal. Si no se observan obstrucciones sanguíneas, use un par de pinzas para agarrar suavemente un extremo de las suturas de fijación y desviar ligeramente el vaso para inspeccionar la pared posterior del vaso.

No se debe observar arrugamiento si se aprecia un patrón de pulso vigoroso en ambos vasos, donante y receptor; use aplicadores con punta de algodón para devolver los intestinos a la cavidad abdominal. Finalmente, utilice un portagujas y pinzas grof para cerrar la pared abdominal con suturas de polipropileno número cinco cero y puntada continua. Cierre la capa cutánea con las mismas suturas mediante una técnica de cierre subcuticular.

Se puede observar la función motora de las extremidades posteriores para evaluar el éxito de la cirugía. Se examina la cantidad de daño vascular del injerto mediado por el sistema inmunitario, cuantificando el engrosamiento íntimo y el estrechamiento luminal en los segmentos aórticos injertados al día 30 posterior al trasplante.

De hecho, como se observó, los segmentos arteriales alogénicos desarrollan un engrosamiento íntimo significativo y una oclusión luminal, mientras que no se observan cambios en los segmentos arteriales de control con injerto ISO. Además, el reclutamiento de leucocitos hacia la arteria alogénica puede evaluarse mediante el análisis de la acumulación de linfocitos T positivos para CD cuatro y CD ocho, así como de macrófagos, mediante inmunohistoquímica. Como era de esperar, los tres tipos de células inmunitarias se detectaron dentro de la íntima de los tejidos arteriales donantes tras el desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del trasplante exploraran la reducción vascular mediada por aloinmunidad y la esclerosis arterial del trasplante.