Name: Infusión estereotáxica de Oligomeric beta-amiloide en el hipocampo del ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Aprende a realizar infusión estereotáxica de beta-amiloide oligomérico en el hipocampo de ratón para estudiar efectos tóxicos neuronales. Este método permite investigar neurodegeneración en modelos animales vivos.

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares conceder NS081333 (a CMT), Asociación de Alzheimer subvención NIRG-10-171721 y el Instituto Nacional de Salud Mental de subvención MH096702 (a UH), y el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento financiados Investigación de la Enfermedad de Alzheimer Centro de la Universidad de Columbia subvención piloto AG008702 (a YYJ y JB).

Nota: Para todos los experimentos con animales, institucional y directrices nacionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio fueron seguidos. 1. Preparar instrumentos quirúrgicos y soluciones para la cirugía <ol><li> Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos de acero inoxidable. </li><li> Preparar etanol al 70% por dilución de 200 a prueba de etanol absoluto con el grado molecular de agua desionizada destilada estéril. </li><li> Coloque la aguja G 29 a la jeringa Hamilton. Limpie el interior de Hamilton jeringa y la aguja mediante la elaboración y el agua nanopura expulsión repetidamente durante 1 min. Repita este procedimiento con etanol al 70%. <ol><li> Retire el émbolo y la aguja de la jeringa Hamilton. Secar las partes en una campana de flujo laminar S / N. </li><li> Irradiar la aguja y jeringa con luz ultravioleta durante 30 minutos antes de su uso. </li></ol></li><li> Preparar la solución salina disolviendo NaCl en agua de calidad molecular hasta un peso final a la concentración de volumen de 0,9%. Esterilize la solución por filtración a través de filtro de 0,2 micras de poro. </li></ol> 2. Prepare Oligomeric Aß 1-42 <ol><li> Monomerize y resuspender recombinante humana 1-42 en DMSO a 5 mM exactamente como se describe en la publicación de Fa &#39;y otras 13 personas. </li><li> Diluir 5 mM 1-42 con (1x) PBS estéril a 100 mM en el día antes de la cirugía. </li><li> Mezclar la solución bien por trituración. </li><li> Incubar Aß 1-42 solución durante 12 horas a 4ºC. Nota: Las soluciones de control, tales como la dilución de DMSO en PBS o revueltos / inversa 1-42 péptido debe ser preparado de la misma manera como Aß 1-42. </li></ol> 3. Determinar Coordenadas Injection <ol><li> Utilice los adultos atlas del cerebro del ratón para determinar la exacta anterior-posterior (AP), medio-lateral (ML) y dorsal-ventral (DV) coordenadas de la región del cerebro de interés 14. Note: Para ilustrar la técnica que elegimos el giro dentado del hipocampo como el objetivo con las siguientes coordenadas del bregma: AP, -2,00 mm; ML, ± 1,3 mm; DV, -2,2 mm. El signo negativo que precede al valor AP indica que es 2,00 mm posterior del bregma. El signo ± anterior el valor ML indica la dirección izquierda y derecha del centro. Por último, el signo negativo que precede a la DV indica que se está moviendo desde la superficie ventral del cerebro. </li></ol> 4. Instalación de marco estereotáxica <ol><li> Use una máscara quirúrgica cara, bata de laboratorio limpia y guantes quirúrgicos estériles. </li><li> Limpie instrumento estereotáxico y adaptador de ratón con etanol al 70%. </li><li> Establecer paño quirúrgico estéril sobre el mostrador. </li><li> Coloque el instrumento estereotáxica con el adaptador del ratón encima de la sábana quirúrgica estéril. </li><li> Limpie la almohadilla del ratón con etanol al 70%. Coloque la almohadilla térmica sobre la cama marco estereotáxico. Utilice labora propósito generalcinta de etiquetado tory en cinta por la almohadilla térmica sobre la cama adaptador de ratón. <ol><li> Coloque la almohadilla eléctrica a la bomba de recirculación de agua caliente de acuerdo a las instrucciones del fabricante. </li><li> Encienda la bomba de recirculación de agua caliente y ajustar la temperatura a 37 ° C, y luego esperar hasta que alcance la temperatura. </li></ol></li><li> Fije la 50 l Hamilton jeringa con una aguja de 29 G en el marco estereotáxico atornillándolo en el eje vertical de inyección motorizada de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Encienda el esterilizador de cuentas y espere hasta que alcance la temperatura preestablecida por el fabricante. Nota: Esto se utiliza para la esterilización de instrumentos de acero inoxidable entre los animales. Se necesita instrumentos 20 seg de contacto con los granos para la esterilización. </li><li> Encienda el plato caliente y ponerlo a 42 ° C y colocar una jaula vacía limpia cima. </li><li> Mientras que la jeringa Hamilton se fija en el marco estereotáxico utilizar el i estereotáxico motorizadonjector elaborar la solución Aß 1-42. Nota: Elaborar más de 4 l de la solución en la jeringa y luego usar el inyector estereotáxica para establecer el volumen de inyección. Operar el inyector de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li></ol> 5. Preparación de los animales <ol><li> Determinar el peso del ratón utilizando la escala de pesaje. </li><li> Anestesiar ratón con cóctel de ketamina / xilazina a 100 mg / kg de ketamina y 10 mg / kg de xilazina mediante la inyección por vía intraperitoneal (IP). Monitorear la profundidad de la anestesia por la pérdida del reflejo pizca dedo del pie. </li><li> Una vez sedado el ratón tome la cortadora de cabello y afeitarse la cabeza para exponer la piel sobre el cráneo. </li><li> Coloca el ratón encima de la almohadilla térmica en la parte superior de la cama estereotáxica. </li><li> Utilice la espátula para abrir la boca y colocar los dientes incisivos dentro de la guardia de los dientes. Asegure el revólver sobre la cara del ratón. Sujete suavemente hacia abajo y no demasiado apretado. </li><li> Posición los travesaños del oído bilaterales en meato auditivo para asegurar la cabeza. Mueva cada travesaño hasta que golpea el cráneo, y luego gire el tornillo para fijarlo. <ol><li> Para asegurarse de que la cabeza está asegurado utilice su dedo índice para empujar suavemente hacia abajo en la cabeza. Si la cabeza está bien asegurado no va a dar o mover cuando se presiona. </li></ol></li><li> Aplique una gota de crema para los ojos o colirio para los ojos para mantenerlos húmedos. Asegúrese de que los ojos están húmedos durante todo el procedimiento quirúrgico. </li><li> Para desinfectar el sitio quirúrgico usar hisopos de algodón estériles para aplicar solución de betadine a la piel sobre el cráneo, seguido por etanol al 70%. Realice el betadine alterna y etanol 70% limpieza 2 veces más. </li></ol> 6. La cirugía y la Infusión <ol><li> Utilice un bisturí para realizar una incisión de 2-3 mm de la línea media del cuero cabelludo, y luego usar una escalera tijeras finas para extender la línea de incisión para 1,0 a 1,5 cm para exponer la sutura sagital, bregma y lambda del cráneo, señals que las coordenadas estereotáxicas se basan en. Utilice micro abrazaderas para mantener la piel a pedazos. Nota: Las posiciones bregma y lambda se explican en el atlas del cerebro de ratones &quot;el cerebro del ratón en estereotáxica Coordenadas&quot; 14. </li><li> Tome un bastoncillo de algodón, sumergirlo en una solución salina estéril, y lo utilizan para limpiar el cráneo. A continuación, utilice un hisopo de algodón limpio y seco para secar el cráneo. </li><li> Utilice una punta fina pluma estéril para marcar un punto en el bregma. Utilice el micromanipulador estereotáxico para colocar la jeringa Hamilton de modo que la punta de la aguja apenas toca el punto en el bregma. <ol><li> Graba el DV coordenadas. </li><li> Para comprobar si el eje AP del cráneo es de nivel se mueve la jeringa Hamilton posteriormente para que la punta de la aguja toca el punto lambda. </li><li> Anote la posición DV. Asegúrese de que el DV coordenadas de bregma y lambda están a 0,5 mm. Nota: El objetivo es reducir al mínimo la diferencia entre DV bregma y lambda. </li></ol></li><li> Úsalos a ellosicromanipulator para volver la punta de la aguja de la jeringa Hamilton de nuevo al punto bregma. </li><li> Anote la posición inicial AP. </li><li> Calcular la posición final AP restando 2,00 mm desde la AP a partir de coordenadas. </li><li> Utilice el micromanipulador para reposicionar la aguja de la jeringa Hamilton a la final AP coordenadas. </li><li> Graba la corriente ML coordenadas. </li><li> Calcular la izquierda y derecha que termina ML coordina mediante la adición o sustracción de 1,3 mm a partir de la ML de coordenadas. </li><li> Utilice el micromanipulador para mover la aguja de la jeringa Hamilton ya sea a la ML terminando de coordenadas. <ol><li> Toque la punta de la aguja a la superficie del cráneo en ambos terminan coordenadas ML y registrar las coordenadas DV y asegurarse de que los valores están dentro de 0,5 mm. Nota: El objetivo es reducir al mínimo la diferencia entre los dos DV terminando ML coordenadas. </li><li> Mientras que en un final coordinar tirar de la aguja hasta 0,5-1 cm por encima del cráneo. Tome una punta fina pluma estéril para marcar un punto en el the superficie del cráneo. Repita este paso para el lado contralateral del cráneo. </li></ol></li><li> Gire la jeringa Hamilton clara fuera del camino. </li><li> Adjuntar 0,8 mm cabeza de perforación a la perforación. Tome el taladro con ambas manos, ajuste los codos sobre la superficie de la mesa para la estabilidad, y la posición de la cabeza de perforación ligeramente por encima del punto sharpie en la izquierda o la derecha ML coordinan. Activar el taladro, bajar la punta de la broca sobre la superficie del cráneo para introducir un agujero en el cráneo. Repita este paso para el lado contralateral. Nota: Algunos sangrado puede ocurrir a partir de los orificios de reciente introducción. Si hay sangrado luego usar un hisopo de algodón limpio y seco para secarse la sangre. </li><li> Mueva la jeringa Hamilton de nuevo en su posición sobre cualquiera de los agujeros de LD de reciente introducción. Baje la aguja Hamilton justo después del cráneo. En este punto, tenga cuidado de no perforar el cerebro. Para asegurarse de que la aguja ha pasado el cráneo tome su dedo índice y empuje suavemente la aguja contra el cráneo para hacer sure la aguja no salir del agujero. </li><li> Graba el DV a partir de coordenadas. </li><li> Calcular el DV terminando coordinar restando 2,2 mm de la DV comenzando coordenadas. </li><li> Baje la aguja hasta el DV terminando de coordenadas. </li><li> Activar la bomba de inyección estereotáxica para bombear 4 l de 1-42 en la circunvolución dentada a una velocidad de 0,5 l / min. </li><li> Cuando la infusión se ha completado dejar que la aguja permanezca en su lugar por un adicional de 1 min para minimizar el reflujo de la solución fuera de la zona de inyección. </li><li> Mover la aguja al otro lado del cerebro y repita los pasos 6.13 a 6.18. </li></ol> 7. La eliminación de animales y Cuidado Postoperatorio <ol><li> Desatornille las barras de oído y protección para la cara / nariz. Retire el ratón del aparato. </li><li> Utilice un estudiante fórceps patrón estándar para tirar de cerrar el cuero cabelludo y luego sellar la herida con sutura. </li><li> Inyectar 1 ml de solución salina estéril en el ratón a través de IP para la hidratación. </li><li> Enbuprenorfina yecto (0,1 mg / kg) por vía subcutánea a aliviar el dolor. </li><li> Mantener el ratón en la jaula vacía limpio situado en la parte superior de 42 ° C placa caliente hasta que se despierta, y luego devolverlo a su jaula de la vivienda con mucha comida y agua. </li><li> Administrar buprenorfina por vía subcutánea cada 12 horas durante 3 días para el alivio del dolor. </li></ol> Remoción 8. Sutura <ol><li> Anestesiar el ratón con cóctel de ketamina / xilazina a 100 mg / kg de ketamina y 10 mg / kg xlyazine por IP. Nota: Esto se hace 7-10 días después de la cirugía. </li><li> Utilice un estudiante fórceps patrón estándar y tijeras finas rectas para eliminar la sutura. </li><li> Inyectar 1 ml de solución salina estéril en el ratón a través de IP para la hidratación. </li><li> Mantener el ratón en una jaula vacía limpio situado en la parte superior de 42 ° C placa caliente hasta que se despierta, y luego devolverlo a su jaula de la vivienda con mucha comida y agua. </li></ol> Sacrificio y Tejidos Procesamiento 9. Animal <ol><li> Anestesiar el ratón y el perfuse con paraformaldehído al 4% 15, retire el cerebro, y procesarlo para cryosectioning 16. Nota: El momento del sacrificio de los animales depende del experimentador. Sin embargo, para nuestros estudios hemos elegido los 7 y 14 días después de la cirugía. </li></ol>

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<li>Garcia-Osta, A., Alberini, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+beta+mediates+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+%26+memory%22%5BJournal%5D)">Amyloid beta mediates memory formation.</a> Learning & memory. 16 (4), 267-272 (2009).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Para lograr un éxito Aß 1-42 inyección experimentador o cirujano debe: 1) utilizar una técnica aséptica; 2) identificar correctamente la región del cerebro de intereses con coordenadas precisas; 3) ser capaz de asegurar adecuadamente el ratón en el marco estereotáxico con el cerebro nivelado en el eje AP y ML; 4) tener la capacidad de operar el micromanipulador con precisión; 5) garantizar la atención postoperatoria adecuada. Si se siguen estos pasos clave del ratón debe sobrevivir a la cirugía sin infección ...

Depósitos de placa amiloide, que se componen de beta-amiloide (Aß 1-42), son una característica clave de la patología de la enfermedad de Alzheimer (EA). Numerosos estudios han demostrado que los niveles elevados o tóxicos de oligomérica recombinante Aß 1-42 suscitar la muerte neuronal, distrofia sináptica, la pérdida y disfunción; así como los déficit de aprendizaje y memoria 1-4. Las regiones del cerebro afectadas incluyen el hipocampo, la corteza y las estructuras subcorticales tales como el cerebro anterior basal y el 5,6 amígdala. Hasta la fecha, hay varios modelos de ratones transgénicos que intentan simular la Aß 1-42 patología de la EA. Dependiendo de la cepa estos animales demuestran ser útiles para examinar seleccione características patológicas de la AD. Desafortunadamente, con la excepción de 2 líneas transgénicas, APP23 y 5XFAD, estos ratones no replicar completamente la pérdida neuronal, un aspecto clave de la EA. Incluso con la pérdida neuronal observada en APP23 y 5XFAD, la obser muerte neuronalved era sutil, dependiente de la edad, y aislada a una pocas regiones selectas 7,8. La infusión directa de oligómeros Aß 1-42 en el cerebro del ratón de tipo salvaje proporciona un excelente modelo in vivo que reproduce el aspecto de la muerte neuronal en amyloidopathy 1,9,10. A diferencia de los modelos de ratones transgénicos utilizados comúnmente el modelo de infusión de Aß 1-42 oligomérica es ideal para la elevación aguda Aß 1-42 niveles de una manera espacial y temporal. La ventaja de usar los ratones de tipo salvaje para este modelo evita potenciales de compensación o los efectos secundarios de las mutaciones introducidas en líneas de ratones transgénicos. Estudios anteriores han demostrado que la infusión de niveles tóxicos de 1-42 en el hipocampo provoca la muerte de neuronas en la vecindad del sitio de inyección dentro de 1 semana 1. Además, en consonancia con la observación de que Aß 1-42 es tóxico para las neuronas colinérgicas del cerebro anterior basal 11 lacolinérgicos neurona (BFCN) población que se proyecta en el hipocampo se reduce un 20-50% dentro de 7 a 14 días después de beta-amiloide infusión de 1,10 en ratones, lo que permite de manera efectiva para los exámenes de circuitos neuronales aisladas en el cerebro. Desde proyecto BFCN ipsilateralmente para el giro dentado del hipocampo 12, para el control de la parte / vehículo y oligómeros Aß 1-42 soluciones más se puede inyectar a cada lado del cerebro que permite realizar comparaciones entre los hemisferios derecho e izquierdo y 1. En este informe vamos a ofrecer una metodología quirúrgica e inyección detallada para adultos de tipo salvaje C57BL / 6J. Esta cepa de ratón se eligió debido a su amplio uso en la investigación. Técnicamente, cualquier región del cerebro puede ser dirigido para perfusión, sin embargo aquí usaremos el giro dentado del hipocampo como el objetivo de ilustrar la técnica.

<table><tbody><tr><td>Ketamina HCl (100 mg/ml)</td><td>Henry Schein Medical</td><td>1049007</td><td>100 mg de ketamina por 1 kg de animal</td></tr><tr><td>Xilacina (20 mg/ml)</td><td>Henry Schein Medical</td><td>no disponible</td><td>10 mg de xilacina por 1 kg de animal</td></tr><tr><td>Buprenex (0,3 mg/ml)</td><td>Henry Schein Medical</td><td>1217793</td><td>0,1 mg de buprenex por 1 kg de animal</td></tr><tr><td>A&beta; 1-42</td><td>David Teplow/UCLA</td><td>no disponible</td><td>100 &mu; M; Este amiloide se utilizó en el artículo</td></tr><tr><td>A&beta; 1-42</td><td>Bachem</td><td>H-1368</td><td>Se puede utilizar en lugar de amiloide del laboratorio Teplow</td></tr><tr><td>A&beta; 1-42</td><td>American Peptide</td><td>62-0-80B</td><td>Se puede utilizar en lugar de amiloide del laboratorio Teplow</td></tr><tr><td>Scrambled A y beta; 1-42</td><td>American Peptide</td><td>62-0-46B</td><td>Se puede utilizar como péptido de control para comparar A y beta; 1-42</td></tr><tr><td>Anticuerpo NU4 (anticuerpo oligomérico amiloide)</td><td>Regalo de William Klein/Northwestern U.</td><td>no disponible</td><td>1:2,000 dilución</td></tr><tr><td>Anticuerpo oligomérico anti-amiloide&nbsp; (Conejo policlonal)</td><td>EMD Millipore</td><td>AB9234</td><td>Puede usarse en lugar de Nu4; necesita ser probado por el usuario final</td></tr><tr><td>Anticuerpo 6E10 (ratón monoclonal) (anticuerpo amiloide)</td><td>Biolegend</td><td>sig-39320</td><td>dilución 1:1,000</td></tr><tr><td>Anticuerpo ChAT (cabra policlonal)</td><td>Millipore</td><td>AB144P</td><td>dilución 1:100</td></tr><tr><td>DeadEnd Sistema fluorométrico TUNEL</td><td>Promega</td><td>G3250</td><td>Siga las instrucciones del fabricante para use</td></tr><tr><td>el reactivo antidecoloración Prolong Gold con DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td>Úselo cuando cubra portaobjetos deslizantes</td></tr><tr><td>Fluorogold</td><td>Fluorochrome, LLC</td><td>no disponible</td><td>Solución al 2%</td></tr><tr><td>Etanol absoluto (200 grados)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-4</td><td>Para hacer etanol al 70% para higienizar y desinfectar</td></tr><tr><td>Novex 10-20% Gel de tricina</td><td>Life Technologies EC6625BOX</td><td></td><td>Para separar A y beta; 1-42</td></tr><tr><td>Novex Tricine SDS Tampón de funcionamiento (10X)</td><td>Life Technologies</td><td>LC1675</td><td>Para ejecutar geles de tricina al 10-20%</td></tr><tr><td>Tampón de transferencia de tris-glicina Novex (25X)</td><td>Life Technologies</td><td>LC3675</td><td>Para transferir geles de tricina al 10-20% SuperSignal</td></tr><tr><td>Western Blot Enhancer</td><td>Thermo Scientific</td><td>46640</td><td>Para mejorar A y beta; señal 1-42; siga el protocolo del fabricante</td></tr><tr><td>Protran BA79 Membrana de transferencia de nitrocelulosa, 0.1 &mu; m</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>10402088</td><td>Para transferir 10-20% de tricina geles</td></tr><tr><td>Xcell SureLock Mini-Cell</td><td>Life Technologies</td><td>EI0001</td><td>Aparatus de electroforesis para correr 10-20% de tricina geles</td></tr><tr><td>GenTeal Lubricante Eye Gel</td><td>Novartis</td><td>no disponible</td><td>Para mantener los ojos del ratón húmedos durante la cirugía; se puede encontrar en las farmacias locales &#160; </td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Refresh Gotas Oftálmicas Lubricantes Optivas</td><td>Allergan</td><td>no disponible</td><td>Para mantener los ojos del ratón húmedos durante la cirugía; se puede encontrar en las farmacias locales; Se puede usar en lugar de GenTeal</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Stoelting</td><td>50998</td><td>para higienizar y desinfectar</td></tr><tr><td>espátula redonda / cónica &nbsp;</td><td>VWR</td><td>82027-490</td><td>Para abrir la boca</td></tr><tr><td>de los animales Bulldog Serrefines Clamps (Dims. Jaw 9X1,6 mm; Longitud 28 mm)</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>18050-28</td><td>Opcional; Para mantener la piel del cuero cabelludo separada durante la inyección</td></tr>: <tr><td>Tijeras finas rectas (filo de corte de 25 mm; Longitud 11,5 cm)</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>14060-11</td><td>Para cortar cuero cabelludo</td></tr><tr><td>#3 Mango de bisturí</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>#11 Cuchilla quirúrgica Herramientas de</td><td>ciencia fina</td><td>10011-00</td><td>Para hacer incisión en el cuero cabelludo</td></tr><tr><td>Pinza de patrón estándar para estudiantes (punta dims. 2.5x1.5 mm; Longitud 11,5 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91100-12</td><td>Para mantener el cuero cabelludo cerrado durante la sutura</td></tr><tr><td>Trimmer Combo Kit Kent</td><td>Scientific</td><td>CL9990-1201</td><td>Para afeitar el pelo</td></tr><tr><td>T/Bomba Recirculador de agua tibia&nbsp;</td><td>Kent Scientific&nbsp;</td><td>TP-700</td><td>Para calentar animales durante la cirugía</td></tr><tr><td>Almohadilla de minería de guerra reutilizable (5" x 10")</td><td>Kent Scientific&nbsp;</td><td>TPZ-0510FEA</td><td>Para conectarlo al recirculador de agua tibia T/Pump para calentar al animal durante la cirugía</td></tr><tr><td>Micro Taladro Inalámbrico</td><td>Stoelting</td><td>58610</td><td>Utilice rebabas de acero de 0,8 mm para perforar agujeros en el cráneo</td></tr><tr><td>Instrumento estereotáxico estándar de laboratorio con ratón y Adaptador para ratas neonatales</td><td>Stoelting</td><td>51615</td><td></td></tr><tr><td>solo para ratón Stoelting de instrumentos estereotáxicos</td><td></td><td>51730</td><td>Puede usar esto en lugar de Stoelting Cat. #51615</td></tr><tr><td>Inyector estereotáxico por excelencia</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td></td></tr><tr><td>Esterilizador de perlas de vidrio seco</td><td>Stoelting</td><td>50287</td><td>Para esterilizar instrumentos de acero inoxidable</td></tr><tr><td>Paño quirúrgico estéril (18" x 26")</td><td>Stoelting</td><td>50981</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa Hamilton 50 ml, Modelo 705 RN SYR, NDL</td><td>Hamilton Company</td><td>7637-01</td><td>Para inyección cerebral; use diferentes jeringas para diferentes soluciones</td></tr><tr><td>Aguja 29 G, cubo pequeño RN NDL</td><td>Hamilton Company</td><td>7803-06</td><td>Para acoplar a la jeringa Hamilton para inyección cerebral</td></tr><tr><td>1 ml BD Jeringas de tuberculina</td><td>VWR BD309659</td><td></td><td>Para administrar anestesia y solución salina</td></tr><tr><td>Aguja de 30 g (0,5")</td> <td>VWR</td><td>BD305106</td><td>Para administrar anestesia y solución salina</td></tr><tr><td>Báscula electrónica portátil de la serie CS (Ohaus)</td><td>VWR</td><td>65500-202</td><td>Para pesar animales para determinar la dosis de anestesia</td></tr><tr><td>Placa calefactora (placa superior Dims. 7.25x7.25 in)</td><td>VWR</td><td>47751-148</td><td>Para calentar animales después de la cirugía</td></tr><tr><td>Sofsilk Sutura de seda C-1 Corte 3/8, 12 mm</td><td>Covidien</td><td>S1173</td><td>Para el cierre de heridas</td></tr><tr><td>Vetbond Tissue Adhesive (3M)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-361931</td><td>Opcional: para ayudar en el cierre de heridas; Úselo con sutura.</td></tr><tr><td>Aplicadores estériles de eje de madera con punta de algodón</td><td>Fisher scientific</td><td>22-029-488</td><td>Para la limpieza y el secado de heridas</td></tr><tr><td>quirúrgicas Fisherbrand Superfrost Plus Portaobjetos de microscopio</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12-550-15</td><td>Para la recogida de secciones cerebrales</td></tr><tr><td>VWR Micro Cover Glass 24 x 50 mm</td><td>VWR</td><td>48393241</td><td>Para el montaje de portaobjetos de microscopio</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene Syringe Filter 0.2 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>194-2520</td><td>Para esterilizar solución salina</td></tr><tr><td>Marcadores cutáneos estériles de doble punta de Viscot Medical</td><td>Medline</td><td>VIS1422SRL91</td><td>Para marcar coordenadas en el cráneo</td></tr></tbody></table>

infusión estereotáxica de oligomeric beta-amiloide en el hipocampo del ratón

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad neurodegenerativa que afecta a la población que envejece. Una característica clave neuropatológico de la enfermedad es la sobre-producción de beta-amiloide y la deposición de placas de amiloide-beta en regiones del cerebro de los individuos afectados. A lo largo de los años los científicos han generado numerosos modelos de ratón de la enfermedad de Alzheimer que intentan replicar la patología amiloide-beta. Por desgracia, los modelos de ratón solamente imitan selectivamente las características de la enfermedad. La muerte neuronal, un efecto prominente en los cerebros de pacientes con enfermedad de Alzheimer, se carece notablemente en estos ratones. Por lo tanto, nosotros y otros han empleado un método de infundir directamente especies oligoméricas solubles de beta-amiloide - formas de beta-amiloide que se han demostrado para ser más tóxico para las neuronas - estereotáxicamente en el cerebro. En este informe utilizamos machos C57BL / 6J para documentar esta técnica quirúrgica de aumento de los niveles de amiloide-beta en una región del cerebro seleccione. Losobjetivo de infusión es el giro dentado del hipocampo, porque esta estructura cerebro, junto con el cerebro anterior basal que está conectada por el circuito colinérgica, representa una de las áreas de degeneración en la enfermedad. Los resultados de la elevación de la beta-amiloide en el giro dentado mediante infusión estereotáxico revelan aumentos en la pérdida de neuronas en el giro dentado dentro de 1 semana, mientras que hay un incremento concomitante en la muerte celular y la pérdida de neuronas colinérgicas en el miembro vertical de la banda diagonal de Broca del cerebro anterior basal. Estos efectos se observan hasta 2 semanas. Nuestros datos sugieren que el actual modelo de infusión de amiloide-beta ofrece un modelo de ratón alternativa para hacer frente a la muerte de neuronas región específica en una base a corto plazo. La ventaja de este modelo es que el amiloide-beta puede ser elevado en una forma espacial y temporal.

El presente método de preparación humana recombinante oligomérica 1-42 produce especies oligoméricas solubles que consiste en monómeros, dímeros, trímeros, y tetrámeros (Figura 1A). Estos especies de bajo peso molecular 1-42, pero no las fibrillas y placas, se ha demostrado en numerosos entornos para ser más tóxico para las neuronas 1,4,9,17-19. Para determinar si es o no oligómeros Aß 1-42 induce la muerte de las neuronas en el cerebro del ratón Aß 1-42<...

Aquí, presentamos un protocolo para la infusión cerebral estereotáxica directa de beta-amiloide. Esta metodología proporciona un modelo de ratón alternativo in vivo para abordar los efectos a corto plazo de la beta-amiloide en las neuronas cerebrales.

Infusión estereotáxica de Oligomeric beta-amiloide en el hipocampo del ratón

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

El objetivo general de este procedimiento es inyectar estereotáxica una Liga meric a beta 1 42, en el giro dentado del hipocampo. Esto se logra preparando primero una liga meric, una solución beta 1 42. El segundo paso es determinar las coordenadas de inyección.A continuación, exponga quirúrgicamente el cráneo del animal e introduzca dos orificios en él para la inserción de la aguja. El paso final es mover la aguja de la jeringa a su posición final e infundir una beta 1 42. En última instancia, el método de inyección estereotáxico de Abeta 1 42 se utiliza para examinar los efectos tóxicos de Abeta 1 42 en un animal vivo.La principal ventaja de esta técnica sobre los modelos de ratón transgénicos Abeta 42 existentes es que el ALA 42 oligomérico puede elevarse de manera especial y temporal y reproducir de forma fiable la patología de muerte celular de la que carecen los modelos de ratón transgénicos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la enfermedad de Alzheimer, como cómo se propagan los procesos patológicos en la enfermedad de Alzheimer. Para comenzar este procedimiento, afeita la cabeza de un ratón anestesiado para exponer la piel.A continuación, coloque el mouse sobre una almohadilla térmica en un marco estereotáxico. A continuación, asegure sus incisivos en el protector dental y una pieza nasal sobre la cara del ratón. Después de eso, coloque las barras de la oreja en los mauss auditivos para asegurar la cabeza para verificar.Si la cabeza está asegurada, presiónela suavemente y asegúrese de que no se mueva. Luego aplique ungüento en ambos ojos para mantener la humedad. Después de eso, desinfecte el sitio quirúrgico aplicando Betadine en la piel sobre el cráneo, seguido de etanol al 70% con hisopos de algodón estériles.Realice la limpieza alterna de Betadine y etanol dos veces más. Ahora haz una incisión de dos a tres milímetros en la línea media del cuero cabelludo con un bisturí. Use tijeras finas rectas para extender la línea de incisión a aproximadamente 1.0 centímetros para exponer la sutura sagital bgma y lambda del cráneo.Después de eso, use fórceps para separar la piel. Limpie el cráneo con un hisopo de algodón estéril, empapado con solución salina estéril. Luego, use un hisopo de algodón limpio y seco para secar el cráneo.A continuación, marque un punto. En el Bre ma, coloque la jeringa Hamilton usando el micro manipulador de modo que la punta de la aguja toque el punto en el bgma. Luego registre la coordenada DV y marque un punto en el punto Lambda, asegúrese de que el eje AP del cráneo esté nivelado moviendo la jeringa posteriormente al punto Lambda.La punta de la aguja debe tocar el punto Lambda como lo hizo con el punto BGMA. Después de eso, registre la posición DV. Las coordenadas DV para Bre, MA y Lambda deben estar dentro de 0,5 milímetros.Ahora regrese la punta de la aguja al punto BMA. Registre la posición inicial del PA. A continuación, calcule la posición final del PA restando dos milímetros del PA inicial.Coordine y vuelva a colocar la aguja de la jeringa en la coordenada AP final. A continuación, registre la coordenada ML actual. Calcule las coordenadas ml finales izquierda y derecha sumando o restando 1,3 milímetros de la ml inicial.Coordine y mueva la aguja de la jeringa a las coordenadas ML finales. Toque la punta de la aguja con la superficie del cráneo en ambas coordenadas ML finales y asegúrese de que las coordenadas DV estén dentro de 0,5 milímetros. Mientras está en la coordenada ml final, tire de la aguja hacia arriba, de 0,5 a un centímetro sobre el cráneo.Marca un punto en el cráneo con un marcador de punta extra fina de color oscuro. Repita este paso para el lado contralateral del cráneo. A continuación, aleje la jeringa.Taladre un agujero en el ml izquierdo o derecho. Coordínese en el cráneo con una broca de 0,8 milímetros. Repita este paso para el lado contralateral.Después, mueva la jeringa a uno de los orificios recién introducidos. Baje la aguja hasta justo después del cráneo y tenga cuidado de no perforar el cerebro para asegurarse de que la aguja haya pasado por el cráneo. Empuje suavemente la aguja contra el cráneo para asegurarse de que la aguja no se salga del orificio.A continuación, registre la coordenada DV inicial. Calcula el dv final. Coordenada restando 2,2 milímetros del DV inicial. Coordenada y baja la aguja hasta el db final.Coordine y luego configure la bomba inyectora estereotáxica para infundir cuatro microlitros de un beta 1 42 en el giro dentado a una velocidad de 0,5 microlitros por minuto. Después de la infusión, deje que la aguja permanezca en su lugar durante un minuto adicional para minimizar el reflujo de la solución fuera del sitio de inyección. Después de eso, mueva la aguja al otro lado del cerebro y repita el procedimiento.Ahora, desenrosca las barras de los oídos. Use pinzas de patrón estándar de estudiante para cerrar el cuero cabelludo y sellar la herida con la sutura. Quítese el protector de la nariz y retire el mouse.Inyecte un mililitro de solución salina estéril en el ratón inicialmente para hidratarlo e inyecte buprenorfina a 0,1 miligramos por kilogramo por vía subcutánea para aliviar el dolor. Luego, transfiera el mouse a una jaula limpia y vacía colocada encima de una placa caliente a 42 grados centígrados hasta que se despierte. Luego, regrese al ratón a su jaula de alojamiento con abundante comida y agua.Esta figura muestra la infusión de un beta 1 42 y un vehículo en el giro dentado izquierdo y derecho respectivos de un ratón de nueve meses de edad. Las líneas discontinuas representan el tracto de inyección y las flechas muestran el giro dentado colapsado. Una semana después de la inyección de Abeta 1 42, el giro dentado exhibió niveles elevados de Abeta 1 42 en la capa molecular y en la capa de células polimórficas cerca del lugar de la inyección a los siete y 14 días.Abeta 1 42 provocó aumentos en la tinción de túnel positivo y disminuciones en el grosor del giro dentado, lo que confirma los efectos neurodegenerativos de Abeta 1 42. Aquí, un trazador retrógrado de oro fluorado se coinyectó con Abeta 1 42 en el giro dentado. Siete días después de la inyección, se detectó fluororo en el prosencéfalo basal, lo que sugiere el transporte retrógrado de la etiqueta a través de las neuronas colinérgicas.Se eligieron neuronas positivas para fluororo en el prosencéfalo basal para la cuantificación. Siete días después de la inyección, Abeta 1 42 provocó aumentos en el túnel y disminuciones en el chat. Neuronas positivas en el cerebro basal Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente 30 minutos si se realiza correctamente.Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos para responder a preguntas adicionales, como los estudios del mecanismo molecular para abordar el efecto mecanicista de la infusión de amiloide en el cerebro. Me gustaría agradecerles por ver nuestro video y espero que el método sea útil en sus experimentos.

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Investigación

JoVE Journal

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Neurociencia

Una de las características de la enfermedad de Alzheimer es la elevación de...

Preparación de oligómeros β-amiloide 1-42 Y la inducción del deterioro de plasticidad sináptica en rodajas de hipocampo

Este video muestra una técnica para la infusión continua de anticuerpos específicos del péptido beta amiloide (Aβ) en el hipocampo de una rata. El estudio emplea la implantación de un sistema de cánula bilateral para una infusión controlada de anticuerpos específicos del péptido Aβ junto con la infusión de oligómeros Aβ solubles (Aβo) en el hipocampo de la rata para estudiar las interacciones entre los oligómeros y los anticuerpos.

Infusión controlada de anticuerpos específicos del péptido Aβ y oligómeros Aβ en el hipocampo de la rata

Este video muestra la infusión estereotáxica precisa de beta amiloide en el giro dentado para establecer un modelo de ratón de la enfermedad de Alzheimer. La determinación precisa de las coordenadas y la administración controlada de las proteínas beta amiloides dan como resultado la degradación neuronal, lo que interrumpe el procesamiento de la memoria y contribuye al desarrollo de la enfermedad de Alzheimer.

Infusión cerebral estereotáxica directa de proteínas beta-amiloide para un modelo de enfermedad de Alzheimer

Fuente: Arango-Lievano, M. et. al., Imágenes longitudinales in vivo de la vasculatura cerebrológica: relevancia para las enfermedades del SNC. J. Vis. Exp. (2016)Este video demuestra imágenes in vivo de dos fotones para visualizar placas de amiloide marcadas con fluorescencia y vasculatura cerebral. La fluorescencia azul marca las placas, mientras que la fluorescencia verde resalta los vasos sanguíneos cerebrales. Un mapa 3D de la región de interés y un mosaico de imágenes de alta resolución...

Imágenes in vivo de vasos cerebrales y placas amiloides en un modelo de ratón con enfermedad de Alzheimer

Fuente: Slezia, A. et al. La administración electroforética de ácido γ-aminobutírico (GABA) en el foco epiléptico previene las convulsiones en ratones. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra la administración electroforética de ácido gamma-aminobutírico (GABA) para inhibir la actividad convulsiva en un ratón anestesiado. Describe los pasos involucrados en la implantación de la sonda, el registro de la actividad neuronal, la inducción de convulsiones y la administración controlada de GABA a...

Administración electroforética de GABA en el foco epiléptico de un ratón anestesiado

Los microARNs tienen funciones importantes en la estructura y función del cerebro. Aquí se describe un método para hacer cumplir miRNA hipocampo sobreexpresión mediante inyección estereotáxica de un lentivirus que expresan los genes miARN ingeniería. Este enfoque puede servir como una manera relativamente rápida para evaluar...

Inyección estereotáctica de microARN que expresan lentivirus al ratón hipocampo CA1 Región y evaluación de los resultados del comportamiento

El amiloide-β (Aß): se inyecta modelo animal permite la administración de una cantidad y especies de fragmentos Aß definido y reduce las diferencias individuales dentro de cada grupo de estudio. Este protocolo describe la inyección intracerebroventricular (ICV) de Aß sin instrumentos de estereotaxia, permitiendo la producción de anomalías en el comportamiento de Alzheimer como en ratones normales.

La inyección intracerebroventricular de péptidos beta-amiloide en ratones normales para inducir de forma aguda déficits cognitivos como la enfermedad de Alzheimer,

Este artículo ilustra cómo se puede cuantificar la expresión de receptores de neurotransmisores y analizar el patrón en sinapsis con elementos pre y postsinápticos identificados utilizando una combinación de transducción viral de herramientas optogenéticas y la técnica de inmunomarcaje de réplica de congelación-fractura.

Combinados Optogenética y congelación-fractura Réplica Immunolabeling para Analizar Arreglo-entrada específica de glutamato receptores en el ratón amígdala

Para estudiar los efectos del Aβo in vivo, desarrollamos un modelo basado en infusiones repetidas de Aβo soluble en el hipocampo junto con una infusión continua de anticuerpo Aβo (6E10) en el hipocampo utilizando bombas osmóticas para contrarrestar el efecto neurotóxico del Aβo.

Neurodegeneración en un modelo animal de beta-amiloide crónica Oligómero de infusión es contrarrestado por el anticuerpo Tratamiento Con una infusión de bombas osmóticas

En la cirugía de la supervivencia en ratones in utero permite la manipulación molecular de la expresión génica durante el desarrollo. A continuación se describe el uso de alta frecuencia, la ecografía para guiar la inyección de vectores retrovirales en el cerebro del ratón en el día embrionario (E) 9.5.

Guiada por ultrasonido microinyección en el cerebro anterior Ratón In Utero En E9.5

Aprende a realizar infusión estereotáxica de beta-amiloide oligomérico en el hipocampo de ratón para estudiar efectos tóxicos neuronales. Este método permite investigar neurodegeneración en modelos animales vivos.

Infusión estereotáxica de Oligomeric beta-amiloide en el hipocampo del ratón

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