Name: Proteína entrega directa de células de mamíferos Utilización de Células permeable Cys 2 -Su 2 Dominios de zinc-finger (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Aprende a utilizar dominios de dedos de zinc para la entrega directa de proteínas funcionales en células de mamíferos mediante este protocolo detallado. Este método permite cuantificar la eficiencia de incorporación por citometría de flujo.

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Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (DP1CA174426 a Carlos F. Barbas) y la Universidad ShanghaiTech, Shanghai, China (a JL). Se generaron gráficos moleculares utilizando PyMOL.

1. Clonación <ol><li> Obtener dominios ZIF con dos dedos de alanina-sustituido que se han clonado sub-en el sistema de vector de expresión pET-28 y están disponibles bajo petición (PET-2F-ZiF). 34 </li><li> Amplificar por PCR EmGFP del plásmido Esmeralda-pBAD con los cebadores 5 &#39;XmaI-EmGFP (5&#39;-GGAAATTG CCCGGG ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC-3&#39;; Xma sitio I en negrita) y 3 &#39;Sac-EmGFP (5&#39;-CGGATCT GAGCTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3&#39; ; Sac I sitio en negrita). <ol><li> Utilice 5 ng de ADN plantilla, 10 l de tampón 10x de la polimerasa, 1 unidades (U) de ADN Taq polimerasa, 0,2 mM de cada dNTP y 0,2 M de cada cebador en una solución de 100 l con el volumen restante compuestos de agua destilada / desionizada . Utilice las condiciones de ciclo: 95 ° C durante 5 minutos; 30 ciclos de 95 ° C durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72 ° C durante 1 minuto; 72 ° C durante 10 min. Se purifica el producto de PCR por extracti gelen y determinar la concentración de ADN usando un espectrofotómetro de medición Abs 260 x 50 g / ml. </li></ol></li><li> Recopilación pET-2F-ZiF y el inserto que codifica EmGFP con las enzimas de restricción Xma I y Sac I en tampón recomendado durante 3 horas a 37 ° C utilizando 10 U de enzima por 1 g de ADN. Visualizar el ADN por electroforesis en gel de agarosa usando un colorante intercalante fluorescente, tal como bromuro de etidio. </li><li> Se purifica el ADN digerido mediante el kit de extracción de gel y determinar la concentración de ADN mediante un espectrofotómetro de medición Abs 260 x 50 g / ml. </li><li> Ligar el ADN que codifica EmGFP purificado en 50-100 ng de pET-2F-ZiF utilizando 1 U de T4 DNA ligasa durante al menos 1 h a TA. Para obtener los mejores resultados, realice la reacción de ligación utilizando un 6: 1 molar-inserción a vector. </li><li> Descongelar 50 l de cualquier químicamente competentes XL-1 Azul de Escherichia coli células en hielo y mezclar suavemente con 10-20 ng de ligó pET-2F-ZiF-EmGFP. </li><li> Mantenga en hielo durante 30 min. El choque térmico la mezcla a 42 ° C durante 90 seg y recuperar las células en 2 ml de caldo de Super óptima con represión catabólica (SOC) durante 1 hora a 37 ° C con agitación. </li><li> Corre 100 l de la cultura de recuperación en un caldo lisogenia (LB) placa de agar con 50 g / ml de kanamicina y se incuba O / N a 37 ° C. </li><li> El día siguiente, inocular 6 ml de caldo super (SB) o de cultivo LB que contiene 50 mg / ml de kanamicina con una colonia de la placa de agar LB y cultivo O / N a 37 ° C. Nota: Colony PCR usando los cebadores 5 &#39;XmaI-EmGFP y 3&#39; SacI-EmGFP podría utilizarse para identificar los clones positivos antes de la miniprep. </li><li> Purificar pET-2F-ZiF-EmGFP por miniprep y confirmar mediante secuenciación de ADN plásmido utilizando el promotor T7 (5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGG-3 &#39;). </li></ol> 2. Expresión y purificación <ol><li> Descongele 50 l de químicamente competente E. BL21 coli células en hielo y mezclar suavemente con 100 ng de pET-2F-ZiF-EmGFP plasmid. Transformar como se describe en los pasos 1.7 a 1.8. </li><li> El día siguiente, inocular 10 ml de medio LB que contenía 50 mg / ml de kanamicina con una sola colonia y crecer O / N a 37 ° C con agitación. </li><li> El día siguiente, diluir 10 ml de cultivo O / N en 1 L de medio LB suplementado con 50 g / ml de kanamicina, 0,2% de glucosa y 100 mM ZnCl2. Mantener el cultivo a 37 ° C con agitación hasta una densidad óptica a 600 nm (OD 600) de 0,8 e inducir la expresión de la proteína con 2 mM isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). Después de 6 horas de crecimiento a 37 ° C, las células de la cosecha por centrifugación a 5000 xg durante 10 min a 4 ° C. Nota: Las condiciones de inducción son altamente variables y dependen de la estabilidad de las proteínas que se expresa. Supervisar el OD 600 cada 30 minutos hasta una DO 600 de 0,8 se alcanza. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 5 ml de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl, NaCl 500 mM, 100 mM ZnCl2, 1 mM ditiotreitol (DTT), 1 mM de MgCl 2, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF) e imidazol 10 mM, pH 8,0). Lisar las células en hielo por ultrasonidos con la siguiente configuración: potencia del 50%, 4 minutos de tiempo de proceso con 5 segundos de encendido / apagado 10 segundos intervalos. Evite el sobrecalentamiento de la solución. </li><li> Centrifugar el lisado de células a 25.000 xg durante 30 min a 4 ° C y transferir el sobrenadante a un tubo de recogida fresco. Para obtener los mejores resultados, realice todos los pasos siguientes a 4 ° C. </li><li> Ejecute el sobrenadante a través de una columna pre-envasados ​​con 1 ml de suspensión equilibrada Ni-NTA. Lavar la resina con 20 ml de tampón de lavado (50 mM Tris-HCl, NaCl 500 mM, 100 mM ZnCl2, DTT 1 mM, 1 mM de MgCl imidazol 2 y 30 mM, pH 8,0). </li><li> Eluir la proteína con 5 ml de tampón de elución (50 mM Tris-HCl, NaCl 500 mM, 100 mM ZnCl2, DTT 1 mM, 1 mM de MgCl 2, e imidazol 300 mM, pH 8,0). </li><li> Intercambio de tampón la proteína se eluyó con tampón de almacenamiento (50 mMTris-HCl, NaCl 500 mM, 100 mM ZnCl2, DTT 1 mM, 1 mM de MgCl 2 y 10% de glicerol, pH 8,0) y concentrar la proteína a al menos 40 mM utilizando un concentrador de giro por centrifugación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Determinar la concentración de proteína por el ensayo de Bradford o BCA. Mezclar 2 l de proteínas purificadas con 2 l 2 × colorante de carga SDS-PAGE, hierven a 95 ° C durante 10 min y luego resolver el 4% -20% Tris-glicina SDS-PAGE para evaluar la pureza de proteína (Figura 2). </li></ol> 3. La proteína de almacenamiento <ol><li> Alícuota de la proteína concentrada, congelación de flash en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C. Para las proteínas de fusión EmGFP, cubrir el tubo con papel de aluminio para proteger la proteína de la luz. </li><li> Evite la congelación y descongelación repetida de la solución de proteína. Nota: Las proteínas fusionadas-ZiF son estables en estas condiciones durante al menos 1 mes. O almacenamiento inadecuado mes&gt; 4 puede conducirpara la precipitación de proteínas o photobleaching de EmGFP. </li></ol> Transducción 4. Proteína <ol><li> Mantener las células HeLa en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contiene 10% (v / v) de suero fetal bovino (FBS) y 1% de antibiótico-antimicótico a 37 ° C en una atmósfera totalmente humidificada con 5% de CO 2. Nota: las pasaron más de 30 veces no se recomiendan para la transducción de la proteína. </li><li> Pre-capa de una placa de 24 pocillos con 500 l de 50 mg / ml de poli-lisina durante 30 a 60 min a 25 ° C. Sembrar las células en una placa de 24 pocillos a una densidad de 2 × 10 5 células por pocillo. A las 24 h después de la siembra, o una vez que las células son entre 80% -90% de confluencia, retirar el medio de cada pocillo y se lava con 500 l de DMEM libre de suero pre-calentado (SFM). </li><li> A cada pocillo, añadir 250 l de SFM que contiene 2 M de proteína ZiF-EmGFP y 100 mM ZnCl2. Se incuban las células a 37 ° C durante 1 hr. Nota: Los dominios ZIF entran en las células primarily través macropinocytosis, 34, que es un mecanismo dependiente de la energía. Por lo tanto, las células deben ser incubadas a 37 ° C para la internalización de proteínas eficiente. </li><li> Retire el medio de las células y lavar tres veces con 500 l de calcio y de magnesio libre de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) suplementado con 0,5 mg / ml de heparina. Nota: La heparina es necesario para eliminar la proteína unida a la superficie que pudiera complicar los análisis. </li><li> (Opcional) repetir el tratamiento hasta tres veces para la entrega mejorada. </li><li> Aislar las células tratadas inmediatamente después de la heparina de lavado por digestión con 0,05% de tripsina-EDTA a 37 ° C durante 2 min. Vuelva a suspender las células desprendidas en 0,5 ml de DPBS suplementado con 1% de SFB. </li><li> Medir la intensidad de fluorescencia de cada muestra por citometría de flujo 35 utilizando el canal de isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Figura 3). Ajuste la dispersión frontal (FSC) y la dispersión lateral (SSC) para colocar la población deinterés en la escala, asegurando que las poblaciones con diferentes propiedades se resuelven el uno del otro. </li><li> Recoge 10.000 eventos en directo para cada muestra y analizar los datos mediante citometría de flujo análisis de datos de software. 36 Normalizar la fluorescencia de las células HeLa tratadas con ZiF-EmGFP a esas células tratadas sólo con SFM. </li></ol>

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<li>Mercer, A. C., Gaj, T., Sirk, S. J., Lamb, B. M., Barbas, C. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+endogenous+human+gene+expression+by+ligand-inducible+TALE+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth.+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of endogenous human gene expression by ligand-inducible TALE transcription factors.</a> ACS Synth. Biol. 3, 723-730 (2014).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, se presenta un protocolo paso a paso para la entrega de proteínas utilizando zinc-finger (ZiF) dominios de células permeable. El dominio ZiF no reduce la actividad enzimática de la carga fundida 34; permite la producción y purificación de proteínas en rendimientos casi idénticos a los observados con proteína no modificada; y puede transportar proteínas y enzimas en una amplia gama de tipos de células con eficiencias que superan los sistemas de dominio de transducción de proteína o péptido de penetración...

Altamente estrategias de suministro de proteínas eficientes y versátiles son críticas para muchos la investigación básica y las aplicaciones terapéuticas. La entrega directa de proteínas purificadas en las células representa uno de los métodos más seguros y más fáciles para lograr esto. 1,2 diferencia de las estrategias que se basan en la expresión de genes a partir de ácidos nucleicos, 3-5 de administración de proteínas no plantea ningún riesgo de mutagénesis de inserción, es independiente de la maquinaria celular de la transcripción / traducción y permite un efecto inmediato. Sin embargo, la falta de métodos simples y generalizables para dotar a la actividad de penetración celular en proteínas confunde habitualmente su ingreso directo en las células. Los métodos actuales para facilitar la entrega intracelular de proteínas se basan en el uso de origen natural o diseñados 6-8 péptidos de penetración celular, 9-12 dominios de transducción de sobrealimentados, 13,14 nanopartículas y liposomas 15, 16 partículas similares a virus 17,18 </sup&gt; y materiales de microesferas poliméricas. 19 Desafortunadamente, muchos de estos enfoques se ven obstaculizados por las bajas tasas de absorción celular, 20,21 pobre estabilidad, 22 inadvertida especificidad de tipo celular, 23 propiedades de escape bajo endosomales 24 y toxicidad. 25 Además, muchas proteínas tecnologías de transducción de reducir la bioactividad de las proteínas entregados. 14 Nuestro laboratorio previamente demostró que nucleasa dedo de zinc (ZFN) proteínas - restricción endonucleasas quimérico que consiste en una proteína programable Cys2 -Su 2 dedos de zinc de unión a ADN y el dominio de la escisión de la endonucleasa de restricción FokI 26-28 - son inherentemente por células permeable. 29 Esta actividad de penetración celular sorprendente ha demostrado ser una propiedad intrínseca del dominio dedo de zinc de diseño personalizado, una plataforma de unión a ADN que ha surgido como una poderosa herramienta para apuntado genoma eningeniería, 30-32 y considera que es el resultado de la constelación de seis residuos de carga positiva en la superficie de la proteína. De hecho, varias proteínas de unión al ADN, incluyendo c-Jun N-DEK y se han demostrado poseer una capacidad innata para atravesar las membranas celulares. 33 Más recientemente, nuestro laboratorio ampliado en estos resultados y demostró que la actividad de las células de penetración de zinc dedo (ZiF) dominios podrían ser aprovechados para la entrega de proteínas intracelulares. Fusión genética de cualquiera de los dominios ZIF de uno o dos dedos a la carga de proteína específica llevado a la absorción eficiencias que superan muchos sistemas de suministro de péptidos de penetración celular convencionales. 34 En particular, la entrega mediada por ZiF no comprometió la actividad enzimática de la carga fundida y facilitó altos niveles de entrega citosólica. En conjunto, estos resultados demuestran el potencial del dominio ZiF para facilitar la prestación eficiente y fácil de proteínas, y potencialmente más diversos tipos de macromoléculas, en las células. Aquí, se presenta un protocolo detallado paso a paso sobre cómo implementar la tecnología ZiF para la entrega de proteínas en células de mamíferos. Anteriormente hemos construido un conjunto de uno, dos, tres, cuatro, cinco y seis dedo dominios ZIF que carecen de la capacidad de unirse al ADN, debido a la sustitución de cada uno de los residuos de unión a ADN-α helicoidal, pero son capaces de entregar proteínas en células 34 (Figura 1). Se describe la producción y la transducción de Emerald GFP (EmGFP) en células HeLa utilizando un dominio ZiF con dos dedos. Este protocolo es extensible a casi cualquier proteína capaz de la expresión soluble en Escherichia coli y casi cualquier tipo de célula de mamífero. Resultados esperados se proporcionan y también se discuten estrategias para maximizar el rendimiento de este sistema.

<table><tbody><tr><td>XmaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0180L</td><td></td></tr><tr><td>SacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0156L</td><td></td></tr><tr><td>Expandir Sistema de PCR de alta fidelidad</td><td>Roche</td><td>11759078001</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td></td></tr><tr><td>4%-20% Tris-Glycine Mini geles de proteína, 1,5 mm, 10 pocillos</td><td>Life Technologies</td><td>EC6028BOX</td><td></td></tr><tr><td>2x Tampón de muestra Laemmli</td><td>BioRad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa</td><td>Life Technologies</td><td>15224-017</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) Competente E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527I</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0391</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de zinc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086-5G</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de kanamicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-25</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de Sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-25G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher Scientific</td><td>PR-V3151&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>Resina de Agarosa Ni-NTA</td><td>QIAGEN</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513-25G</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Unidades de filtro centrífugo</td><td>EMO Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Placa de fondo plano de 24 pocillos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3527-100EA</td> Polilisina Sigma-Aldrich P7280 DPBS, sin calcio, sin magnesio Life Technologies 21600010 sulfato de heparán Sigma-Aldrich H4777 tripsina <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Life Technologies <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro 25300054 células HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Nano Drop ND-1000&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit de purificación de PCR</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit de extracción de gel</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr></tbody></table>

proteína entrega directa de células de mamíferos utilización de células permeable cys<sub&gt; 2</sub&gt; -su<sub&gt; 2</sub&gt; dominios de zinc-finger

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Debido a su modularidad y capacidad de ser reprogramados para reconocer una amplia gama de secuencias de ADN, los dominios de unión al ADN de dedos de zinc Cys2-His 2 han surgido como herramientas útiles para la ingeniería genómica dirigida. Al igual que muchas otras proteínas de unión al ADN, los dedos de zinc también poseen la capacidad innata de atravesar las membranas celulares. Recientemente demostramos que esta permeabilidad intrínseca de las células podría aprovecharse para la administración de proteínas intracelulares. La fusión genética de los motivos de los dedos de zinc conduce a un transporte eficiente de la carga de proteínas y enzimas a una amplia gama de tipos de células de mamíferos. A diferencia de otras tecnologías de transducción de proteínas, la administración a través de dominios de dedos de zinc no inhibe la actividad enzimática y conduce a altos niveles de administración citosólica. Aquí se presenta un protocolo detallado paso a paso para la implementación de la tecnología de dedos de zinc para la administración de proteínas en células de mamíferos. Se destacan los pasos clave para lograr altos niveles de administración intracelular mediada por dedos de zinc y se discuten estrategias para maximizar el rendimiento de este sistema.

Con dos dedos proteínas de fusión ZiF-EmGFP pueden expresarse en E. coli con&gt; 95% de homogeneidad y altos rendimientos (&gt; 25 mg / ml) (Figura 2). En general, de uno y dos dedos proteínas de fusión ZIF pueden ser producidos en cantidades casi idénticas a las de la proteína no modificada de tipo salvaje. Sin embargo, en algunos contextos, proteínas de fusión ZiF de cinco y seis dedos no son capaces de ser producidos en rendimientos suficientemente altos para aplicaciones posteriores. <p...

Dominios de dedos de zinc son células permeable intrínseca y capaz de mediar la entrega de proteínas en una amplia gama de tipos de células de mamíferos. Aquí, se presenta un protocolo detallado paso a paso para la implementación de la tecnología zinc-finger para la entrega de proteínas intracelulares.

Proteína entrega directa de células de mamíferos Utilización de Células permeable Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -Su<sub&gt; 2</sub&gt; Dominios de zinc-finger

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo utilizar dominios de dedo de zinc para entregar proteínas funcionales, como la proteína verde fluorescente, a células de mamífero. Esto se logra primero generando un plásmido de expresión que contiene la proteína verde fluorescente esmeralda (MGFP) fusionada transicionalmente a dominios de dedo de zinc. El segundo paso consiste en expresar la proteína de fusión fluorescente en bacterias.A continuación, se lisan las células bacterianas y se purifica la proteína de fusión fluorescente. El paso final consiste en incubar células de mamífero con la proteína de fusión fluorescente purificada para permitir su absorción. Finalmente, la fluorescencia de las células tratadas puede cuantificarse mediante citometría de flujo para determinar la eficiencia de la entrega de la proteína de fusión a las células.La principal ventaja del dominio de transducción de proteínas tipo thief u otros dominios como el péptido compacto derivado del VIH o el poliarginina, es que puede facilitar un alto nivel de entrega citosólica sin comprometer la actividad de la carga enzimática del campo. Para comenzar la PCR, amplifique la secuencia de GFP esmeralda o MGFP a partir de un plásmido según el protocolo del texto, purifique el producto de PCR utilizando un kit de extracción de gel y luego cuantifique la concentración de ADN usando un espectrofotómetro. A continuación, obtenga un vector de expresión PET 28 que contenga la secuencia de alanina.Sustituya dos dedos de zinc o dos dominios FZ, vector digestivo y el producto MG F-P-P-C-R con las enzimas de restricción XMAI y SACI utilizando 10 unidades de enzima por microgramo de ADN e incube las digestiones durante tres horas a 37 grados Celsius. Purifique los fragmentos de ADN mediante extracción en gel y mida las concentraciones del vector y del producto MG F-P-P-C-R. Utilizando un espectrofotómetro, combine el producto MG F-P-P-C-R y de 50 a 100 nanogramos del vector en un solo tubo en una proporción molar de seis a uno (inserto:vector).Luego, agregue una unidad de T4 ADN ligasa e incube la reacción durante una hora a temperatura ambiente para transformar bacterias con el plásmido ligado. Derrita un alícuota de 50 µL de células de E. coli químicamente competentes en hielo. Luego, mezcle suavemente las células con 100 a 20 nanogramos del ADN ligado e incube las células con el ADN en hielo durante 30 minutos.Después de la incubación, someta las células a un choque térmico a 42 grados Celsius durante 90 segundos. Añada dos mililitros de medio SOC al tubo y permita que las células se recuperen durante una hora a 37 grados Celsius con agitación para seleccionar los transformantes. Inocule 100 microlitros del cultivo en placas de agar LB que contengan 50 microgramos por mililitro de canamicina e incube las placas durante la noche a 37 grados Celsius al día siguiente.Inocule un cultivo de seis mililitros de LB que contenga 50 microgramos por mililitro de canamicina con una colonia aislada de la placa de cultivo nocturno. Incube el cultivo durante la noche a 37 grados Celsius con agitación. Al día siguiente, recolecte y realice una mini prep de las células para aislar el plásmido y luego confirme el plásmido mediante secuenciación con el cebador.Para el promotor T siete, el plásmido debe contener una fusión traduccional en el extremo N de los dos dominios FZ con MGFP. Para iniciar la purificación de proteínas, primero transforme células BL 21 con 100 nanogramos del plásmido purificado.Seleccionar los transformantes en agar LB que contiene canamicina. Al día siguiente, inocular un cultivo de 10 mililitros de medio LB que contiene canamicina con una colonia aislada de la placa de cultivo nocturno e incubar el cultivo durante la noche a 37 grados Celsius con agitación. Diluir todo el cultivo nocturno en un litro de medio LB, suplementado con canamicina, 0,2 % de glucosa y 100 micromolar de cloruro de zinc. Incubar el cultivo a 37 grados Celsius con agitación hasta que alcance una densidad óptica a 600 nanómetros de 0,8, y luego añadir IPTG hasta una concentración final de dos milimolares para inducir la expresión. Tras seis horas de inducción, centrifugar el cultivo a 5.000 × g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius para recolectar las células.Re suspender el pellet celular en cinco mililitros de tampón de lisis y luego lisar las células en hielo mediante sonicación con una potencia de salida del 50 % y un ciclo de cinco segundos encendido y diez segundos apagado durante cuatro minutos. A continuación, centrifugar el lisado celular a 25.000 ×g durante 30 minutos a cuatro grados Celsius y luego transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de recolección sobre hielo. Para purificar la proteína, cargar el sobrenadante en una columna previamente empaquetada con un mililitro de suspensión de ácido nítrico acético con níquel.Después de hacer pasar el sobrenadante por la columna, lave la resina con 20 mililitros de tampón de lavado. Eluya la proteína de la columna con cinco mililitros de tampón de elución y luego transfiera la solución a una membrana de diálisis, realice la diálisis de la proteína y conserve el tampón de almacenamiento durante la noche después de la diálisis. Utilice un concentrador centrífugo para concentrar la proteína hasta al menos 40 micromolares mediante centrifugación a 3000 × g durante una hora.Determine la concentración y pureza de la proteína según se indica en el protocolo escrito para almacenamiento. Aliquote 200 microlitros de la proteína en tubos fuge de 1,5 mililitro y cubra el tubo con papel de aluminio para proteger las proteínas de fusión MGFP del fotoblanqueo. Luego, congele rápidamente la proteína en nitrógeno líquido y almacénela a menos 80 grados Celsius para preparar la transducción proteica; primero, prepare los pocillos de una placa de 24 pocillos con 500 microlitros de una solución de 50 microgramos por mililitro.Polilisina durante 30 a 60 minutos a 25 grados Celsius. Aspire la solución de los pocillos antes de sembrar la cultura celular. Incube las células en DMM que contenga 10% de FBS y 1% de antibiótico antimicótico a 37 grados Celsius en un incubador humedecido con 5% de dióxido de carbono.Recoger las células y sembrarlas en una placa de 24 pocillos a una densidad de 200.000 células por pocillo. Luego, colocar la placa de 24 pocillos en el incubador tras aproximadamente 24 horas de incubación, cuando las células alcancen una confluencia del 80 al 90 %. Aspirar el medio de cada pocillo y lavar las células con 500 µL de medio libre de suero precalentado o SFM.Añada 250 microlitros de medio libre de suero (SFM) que contenga dos micromoles de proteína Z-M-G-F-P y 100 micromoles de cloruro de zinc a cada pocillo y luego incube las células a 37 grados Celsius durante una hora. A continuación, aspire el medio de los pocillos y lave las células tres veces con 500 microlitros de solución salina tampón de docos fosfato sin calcio ni magnesio, conocida como DPBS, suplementada con 0,5 miligramos por mililitro de heparina. A continuación, añada 200 microlitros de tripsina-EDTA al 0,05 % a los pocillos y incube a 37 grados Celsius durante dos minutos para desprender las células de la placa.Transferir las células desprendidas a un nuevo tubo y centrifugar a 300 veces G durante cinco minutos. A continuación, resuspender las células en 500 mililitros de DPBS suplementado con 1 %FBS y medir la intensidad media de fluorescencia de la muestra mediante citometría de flujo utilizando el canal fite como se describió anteriormente. Ajustar la dispersión directa y la dispersión lateral para colocar la población de interés en la escala.A continuación, utilice una delimitación definida para analizar las muestras de control y de prueba. Recolecte 10.000 ventrículos vivos por muestra y use el software de análisis de citometría de flujo para procesar los datos. Normalice la intensidad fluorescente de las células tratadas con proteína respecto a las células tratadas con suero de control.Las proteínas de fusión Zif MGFP se produjeron en e coli, se purificaron y se analizaron mediante electroforesis en gel de SDS. Estos resultados muestran que la proteína de fusión de dos dedos ZIF MG FP se purificó hasta una homogeneidad mayor al 95 %. Cuando las células helo se trataron con concentraciones crecientes de la proteína de fusión ZIFF MG FP.Mostraron un aumento dependiente de la dosis en la intensidad media de fluorescencia, medido por citometría de flujo. Tratamientos consecutivos con la proteína de fusión Z-MG-FP a una concentración de dos micromoles resultaron en casi el 100 % de las células con fluorescencia MGFP. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar los dominios de transacción de la proteína ladrón para entregar proteínas funcionales en mis células.

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Proteína entrega directa de células de mamíferos Utilización de Células permeable Cys

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