Name: Disparo reactiva Gliosis En Vivo Por un Prosencéfalo Lesiones Puñalada (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Aprende a inducir gliosis reactiva en el prosencéfalo de ratón mediante lesión por puñalada. Este método simplificado permite estudiar procesos celulares y moleculares de la respuesta glial tras daño cerebral sin equipo especializado.

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Agradecemos a Katherine Clark por su asistencia técnica. A.D.R.G. está financiado en parte por 5K01MH097957-03

Adultos (3-4 meses de edad) los ratones macho en una mixta C57BL / 6 antecedentes fueron utilizados en este protocolo. Los animales se mantuvieron en un 12 horas de luz / oscuridad ciclo, y se les permite el acceso libre a comida y agua. Todos los procedimientos realizados en este protocolo se realizaron de acuerdo a los protocolos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional Universidad Drexel. 1. Preparación Área Quirúrgica <ol><li> Desinfectar mesa quirúrgica con etanol al 70%, y luego cubrir todo el banco quirúrgica con almohadillas absorbentes y organizar instrumentos quirúrgicos adyacente a estereotáxica. </li><li> Configurar equipos estereotáxica sin brazo manipulador. Organizar la almohadilla térmica en el estereotáxica y se puso a 37 ° C. Evite el sobrecalentamiento del animal mediante la colocación de un pequeño pedazo de toalla de papel o almohadilla quirúrgica entre el animal y la resistencia de calentamiento. </li><li> Con unas tijeras en autoclave, cortar pequeñas piezas de espuma de gel en autoclave en una placa Petri estéril que contiene solución salina al 0,9% estéril hasta ready para su uso. Nota: Mantener entorno de trabajo estéril utilizando instrumentos autoclave y suministros quirúrgicos estériles. Re-esterilizar instrumentos quirúrgicos durante el procedimiento o en medio de animales por inmersión en un esterilizador de cuentas de 10 a 15 segundos, según sea necesario. Mantener guantes limpios durante todo el procedimiento por el roce de las manos con etanol al 70%, según sea necesario, de desinfectar. </li></ol> 2. Prepping ratón de Cirugía <ol><li> Retire del ratón de jaula y pesar (g). </li><li> Coloque el ratón en la cámara de inducción isoflurano y oxígeno a establecer 2 L / min y vaporizador de isoflurano a 5 para inducir un plano quirúrgico de anestesia, aproximadamente 3-5 min. Vigile la respiración lenta e inmovilización. Compruebe que el ratón está completamente sedado utilizando el reflejo pizca dedo del pie. </li><li> Cuando el ratón está completamente sedado, coloque en el marco estereotáxico, asegure la nariz en el cono de la nariz, que se adjunta con la tubería al isoflurano. Inserte barras de oído en el canal auditivo y ajuste, asegurando la cabeza es estable. </li><li> Afeitarse la cabeza de oreja a oreja, y de entre los ojos de detrás de las orejas. </li><li> Esterilizar la piel con alternancia de toallitas de alcohol isopropílico y solución de yodo betadine, 3 veces cada una. </li><li> Aplicar lágrimas artificiales para los dos ojos para evitar que se sequen durante el procedimiento quirúrgico. </li></ol> 3. Procedimiento Quirúrgico <ol><li> Supervisar la profundidad de la anestesia pellizcando la punta o la cola. El ratón es en el plano quirúrgico apropiado cuando no hay respuesta, y la respiración es lenta y uniforme. </li><li> Hacer una incisión en la piel parasagital desde justo detrás de los ojos hasta casi entre las orejas en un solo movimiento firme utilizando una hoja de bisturí No. 11. Mueva la piel a un lado y el clip lado derecho con pinza hemostática. </li><li> Claro cráneo de la membrana que recubre utilizando el lado opaco de la N º 11 bisturí y punta de algodón aplicadores. Opcionalmente, limpie el cráneo con algodón aplicador con punta sumergida en solución salina al 0,9%. Deje que se seque por completo. </li><li> Nosotrosing una pequeña regla, marcar el borde anterior de la craneotomía en 1 mm de caudal a la sutura coronal, y el borde izquierdo de la craneotomía en 1 mm lateral a la sutura sagital (Figura 1), con un marcador permanente. A continuación, marque los bordes derecho e caudales del craneotomía en 4 mm de las suturas sagital y coronal, respectivamente (Figura 1). </li><li> Con una broca de 0,5 mm, comenzar a hacer craneotomía perforando lentamente siguiendo el esquema marcador permanente. Asegúrese de no romper el cráneo completo. Presione suavemente en la pieza aislada del hueso parietal con el número 5 pinzas, áreas de debilidad dará paso a la presión. Cuando el hueso adelgazado es suficientemente débil en todo el perímetro, la pieza ósea está listo para el retiro. NOTA: Si la dificultad experiencias investigador retirar el hueso en una sola pieza, esto sugiere que el hueso no se ha adelgazado lo suficiente durante la perforación. Considere la perforación del cráneo aún más en los animales posteriores a FACILITAretiro fácil te de la pieza ósea. </li><li> Usando una jeringa de 10 ml equipado con una aguja de 23 G, aplicar una pequeña cantidad de 0,9% de solución salina para empapar el hueso aislado y el área perforado. </li><li> Fije el brazo manipulador al equipo estereotáxica. Adjunte una nueva hoja de bisturí No. 11 en el soporte de la sonda con el lado afilado de la hoja hacia rostral. NOTA: Aunque los tejidos rostral y caudal experimentan los bordes afilados y romos de la hoja, respectivamente, el daño mecánico inducido por la lesión penetrante es comparable en toda la extensión de la lesión. Observamos diferencias apreciables en las principales características de gliosis reactiva incluyendo la regulación positiva de la expresión de GFAP o proliferación, entre las secciones rostral y caudal. </li><li> Mantener el brazo manipulador fuera del camino, levante con cuidado el hueso aislado utilizando 5/45 fórceps en ángulo. Inserte la punta de la pinza en el lado del hueso y ascensor aislado, el uso de apalancamiento de sacar el trozo de hueso dejado atrás en una full movimiento. NOTA: Tenga cuidado de no apuñalar el cerebro o perturbar la dura debajo del cráneo. </li><li> Tome un pequeño pedazo de la espuma de gel absorbible empapado y colocarlo sobre el cerebro al descubierto para evitar que se reseque y disfrutar de sangre que pueda estar presente. </li><li> Una vez que la espuma de gel está en su lugar, hacer pivotar el brazo manipulador en su lugar y ajustar la cuchilla hacia el centro de la craneotomía sobre la espuma de gel. Retire la espuma de gel y baje la hoja hasta que la punta toca la duramadre sin perforación de la duramadre. Marcos dorsal / ventral coordenadas utilizando la escala vernier en el brazo vertical de la estereotáxica. </li><li> Utilizando el brazo manipulador, baje lentamente la hoja exactamente 3 mm en el cerebro. Esto se logra mediante el uso de las marcas de escala vernier en el brazo manipulador. Permita que la cuchilla para permanecer en el lugar durante 5-10 seg. Mueva el brazo estereotáxica con rostral acoplamiento a la hoja a caudal tres veces lo que permite que la hoja alcance los límites rostral y caudal de la craneotomía antes de pasar al opposite final. NOTA: La duramadre no se elimina antes de insertar la cuchilla. En contraste con la duramadre de rata, que es de ~ 80 m de espesor 7, la duramadre ratón es considerablemente más delgada (sólo unas pocas capas de células de espesor) y no produce una resistencia apreciable a la hoja de bisturí durante la inserción. Utilice una nueva hoja de bisturí para cada ratón para asegurar que cada animal recibe una lesión consistente. </li><li> Lentamente levante el brazo estereotáxica, la eliminación de la hoja desde el cerebro. Después de la eliminación de la hoja, colocar inmediatamente otra pieza de espuma de gel en la superficie del cerebro para absorber cualquier exceso de sangre o fluido. </li><li> Mientras tanto, retire el brazo estereotáxica y disponer de la hoja de bisturí No. 11. Una vez que el sangrado se ha detenido, quitar la espuma de gel. </li><li> Cierre de la herida mediante sutura la piel con sutura no absorbible, tal como Ethilon o prolene. Las suturas deben ser retirados de 9-10 días después de la cirugía. </li><li> Devuelva el ratón a su jaula, y permitir que el ratón para recuperar lentamente en un heating almohadilla y el monitor para detectar cualquier signo de malestar. Recuperación de la anestesia inducida por isofluorano-ocurre típicamente dentro de 2-5 min después de la eliminación de la isofluorano. No dejar al animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado recumbancy esternal. </li><li> Administrar 0,5-1 ml de lactato por vía subcutánea solución de Ringer para asegurar la hidratación. </li></ol> Cuidado 4. Post-quirúrgica <ol><li> Seguir de cerca los animales después de la operación hasta que la recuperación de la anestesia antes de regresar a la colonia. <ol><li> Para reducir el dolor y las molestias después de la operación, administrar 0,05-0,1 mg / kg de buprenorfina por inyección ip inmediatamente después del procedimiento. </li><li> Observar los animales durante 2-3 días después de la operación de signos graves de angustia como los movimientos restringidos, falta de aseo, o pérdida de peso. La eutanasia a los animales que demuestran cualquiera de estos síntomas de angustia y retirar del estudio. </li></ol></li><li> Para examinar la histopatología de los tejidos lesionados, la eutanasia de animales por stanperfusión intracardiaca dard. <ol><li> Brevemente, anestesiar los animales con una sobredosis de ketamina / xilazina, a continuación, intracardially perfundido con 15-20 ml de NaCl al 0,9%, o hasta que el hígado se borra de la sangre, seguido de 60 ml de paraformaldehído al 4% en la conclusión del experimento. </li></ol></li><li> Diseccionar los cerebros y post-corrección para 2-4 h en paraformaldehído al 4% antes de ser transferido a la solución de sacarosa al 30%. Sección cerebros en un criostato de 40 a 60 micras, y el proceso mediante procedimientos histológicos o inmunohistoquímicos estándar, o como se describe en Garcia 8,9. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Es fundamental que el cráneo o dura subyacente no se dañen durante la perforación. Utilice una ligera presión durante la perforación para asegurar el cráneo no está pinchado. Además, se debe tener cuidado al levantar la pieza del cráneo para asegurar la duramadre no se levanta con el hueso. La lesión de arma blanca del cerebro anterior describe aquí los modelos de una lesión penetrante en el SNC. Aunque menos clínicamente traducible que los modelos de TBI como FPI o CCI, el modelo de lesión ...

Un desafío importante para desarrollar terapias exitosas para tratar el SNC lesionado es una comprensión incompleta de los eventos multicelulares complejos que se desencadenan por el trauma. Los astrocitos reactivos están ganando cada vez más reconocimiento como un objetivo prometedor para nuevas terapias1. Aunque históricamente se han considerado hostiles a la reparación neuronal, los astrocitos reactivos ahora se reconocen como componentes críticos de una respuesta neuroprotectora compleja y multicelular que incluye la atenuación de los procesos inflamatorios y la limitación del daño secundario y la neurodegeneración2-6. Aunque las características neuropatológicas de la gliosis reactiva han sido bien definidas desde hace mucho tiempo, los mecanismos celulares y moleculares que regulan la gliosis reactiva y la diversa gama de consecuencias posteriores siguen siendo poco conocidos. Comprender los mecanismos que impulsan la gliosis reactiva, así como los eventos celulares y moleculares posteriores, es un paso importante hacia el desarrollo de estrategias destinadas a promover las propiedades neuroprotectoras de la gliosis reactiva, al tiempo que se atenúan los efectos perjudiciales. 
Aquí demostramos un método para inducir astrogliosis reactiva severa en el prosencéfalo de ratones adultos utilizando una herida por arma blanca. A diferencia de otros modelos de lesiones cerebrales traumáticas (TBI), como el impacto cortical controlado (CCI) o la lesión por percusión de fluidos (FPI), que requieren un equipo especializado para producir una lesión, la puñalada del prosencéfalo solo requiere un dispositivo estereotáxico para estabilizar la cabeza y una hoja de bisturí No. 11. Por lo tanto, el modelo de lesión por puñalada en el prosencéfalo es más accesible para una amplia gama de laboratorios que no tienen acceso a los dispositivos especializados necesarios para crear una lesión FPI o CCI. El método descrito aquí permite a los investigadores desencadenar de forma fiable y reproducible una respuesta de gliosis robusta para investigar eventos celulares y moleculares posteriores. Una vez recuperados de la cirugía, los animales que han recibido una lesión por arma blanca en el prosencéfalo pueden sobrevivir durante períodos prolongados sin necesidad de atención especializada y pueden ser devueltos a la colonia para estudios agudos, intermedios o crónicos. Aunque menos traducible clínicamente que los modelos FPI o CCI de TCE, una lesión del prosencéfalo producida por una lesión por arma blanca sirve como un modelo experimental simple pero útil para investigar los mecanismos biológicos básicos que subyacen a la gliosis reactiva y otros eventos neuropatológicos después de un traumatismo en el SNC.

<table><tbody><tr><td>Stereotax</td><td>Harvard Apparatus</td><td>726049</td><td></td></tr><tr><td>Micro taladro de alta velocidad</td><td>Harvard Apparatus</td><td>724950</td><td></td></tr> hoja de <tr><td>bisturí de acero inoxidable, #11</td><td>MedVet</td><td>JOR581S</td><td></td></tr><tr><td>pinzas angulares 5/45</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Esponja de espuma de gel 12 cm x 7 mm</td><td>Fisher</td><td>NC9841478</td><td></td></tr><tr><td>Rb anti-GFAP</td><td>DAKO</td><td>&nbsp; Dilución Z033429-2</td><td>- 1:20.000 (campo claro); 1:1.000 (fluorescencia)</td></tr><tr><td>Shp anti-BrdU</td><td>Abcam</td><td>ab1893</td><td>Dilución - 1:20.000 (campo claro); 1:500 (fluorescencia)</td></tr><tr><td>Cabra biotinilada anti-conejo</td><td>Laboratorios Vector</td><td>BA-1000&nbsp;</td><td>Dilución - 1:400 (campo claro)</td></tr><tr><td>Conejo biotinilado anti-ovejas</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-6000</td><td>Dilución - 1:400 (campo claro)</td></tr><tr><td>Alexafluor 488 cabra anti-conejo</td><td>Life Technologies</td><td>A-11008</td><td>Dilución - 1:400 (campo claro)</td></tr><tr><td>Alexafluor 568 burro anti-ovejas</td><td>Life Technologies</td><td>A-21099</td><td>Dilución - 1:1.000 (fluorescencia)</td></tr><tr><td>DAPI Tinción de ácido nucleico Life</td><td>Technologies</td><td>D3571</td><td>Dilución - 1:1.000 (fluorescencia)</td></tr><tr><td>Cresyl Acetato Violeta Sigma</td><td>Aldrich</td><td>C5042-10G</td><td>Dilución - 1% (campo claro)</td></tr></tbody></table>

disparo reactiva gliosis<em&gt; en vivo</em&gt; por un prosencéfalo lesiones puñalada

Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury

Después de una lesión en el SNC, los astrocitos experimentan una amplia gama de cambios bioquímicos, morfológicos y moleculares denominados colectivamente astrogliosis reactiva. Los astrocitos reactivos ejercen efectos inflamatorios y protectores que inhiben y promueven, respectivamente, la reparación neuronal. Los mecanismos que subyacen a las diversas propiedades funcionales de la astrogliosis reactiva no se conocen bien. Lograr una mayor comprensión de estos mecanismos es fundamental para desarrollar estrategias terapéuticas para tratar el SNC lesionado. Aquí demostramos un método para desencadenar astrogliosis reactiva en el prosencéfalo de ratón adulto utilizando una lesión de apuñalamiento en el prosencéfalo. Este modelo de lesión es sencillo, fiable y sólo requiere un dispositivo estereotáxico y una hoja de bisturí para producir la lesión. El uso de lesiones por arma blanca como modelo de lesión en el prosencéfalo está bien establecido y es susceptible de estudios que aborden una amplia gama de resultados neuropatológicos, como la degeneración neuronal, la neuroinflamación y las alteraciones en la barrera hematoencefálica (BBB). Por lo tanto, el modelo de lesión por puñalada en el prosencéfalo sirve como una herramienta poderosa que se puede aplicar a una amplia gama de estudios sobre la respuesta del SNC al trauma.

Porque los animales sometidos a este procedimiento no requieren períodos de supervivencia especializados cuidados postoperatorios, cortos o de tiempo a largo plazo se incorporan fácilmente en el estudio, en función de la necesidad de investigar la patología aguda o crónica después de una lesión. Principales características de gliosis reactiva, como la regulación positiva de GFAP y la hipertrofia del soma, se pueden observar ya en 2-3 días después de la lesión. La fase pico de la proliferación de astrocitos reactivos es ...

Este artículo describe un protocolo detallado para producir una lesión por apuñalamiento en el prosencéfalo en ratones adultos. La lesión por arma blanca induce una gliosis reactiva grave y formación de cicatrices gliales que pueden examinarse posteriormente mediante métodos inmunohistoquímicos estándar.

Disparo reactiva Gliosis<em&gt; En Vivo</em&gt; Por un Prosencéfalo Lesiones Puñalada

Following injury to the CNS, astrocytes undergo a broad range of biochemical, morphological, and molecular changes collectively referred to as reactive ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en inducir la astrogliosis reactiva en el cerebro anterior de ratón adulto mediante la creación de una lesión mecánica, con el fin de investigar los procesos celulares y moleculares que subyacen a la gliosis reactiva. Esto se logra realizando una craneotomía e insertando posteriormente una hoja de bisturí estéril entre tres y cuatro milímetros de profundidad y longitud en el cerebro anterior para crear la lesión. Los animales pueden sobrevivir durante puntos temporales agudos o crónicos, y sus tejidos se obtienen al finalizar el experimento.A continuación, el tejido puede procesarse para ensayos histológicos, bioquímicos o biológicos moleculares con el fin de investigar los procesos moleculares y celulares que impulsan la astrogliosis reactiva. Los resultados muestran que este procedimiento desencadena una fuerte gliosis reactiva, basada en la marcada sobreexpresión de GFAP y la proliferación de astrocitos reactivos. La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos como la lesión por percusión con fluido o el impacto cortical controlado es que la gliosis reactiva puede inducirse y estudiarse fácilmente sin necesidad

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Medicine

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Este video muestra el procedimiento de lesión por puñalada cortical en ratones, que involucra la exposición del cráneo y la creación de lesiones cerebrales. Induce la astrogliosis reactiva, una respuesta neuroprotectora de los astrocitos, para estudiar el trauma, la inflamación y los mecanismos de reparación del SNC.

Generación de una lesión cortical por arma blanca en un modelo de ratón para inducir astrogliosis reactiva

Un paradigma de lesión utilizando el cable de Drosophila larval nervio ventral para investigar la regeneración del sistema nervioso central y la reparación es descrito. Stabbing seguido por microscopía confocal de barrido láser en especímenes de lapso de tiempo y fijo, combinada con el análisis cuantitativo con el software desarrollado a propósito y la genética, se utilizan para investigar los mecanismos moleculares de la regeneración del SNC y reparación.

Un paradigma de Lesiones de investigar reparación del sistema nervioso central en<em&gt; Drosophila</em

Trauma cerebral aguda es una lesión grave que no tiene un tratamiento adecuado hasta la fecha. Multiphoton microscopía permite estudiar longitudinalmente el proceso de desarrollo trauma cerebral agudo y en la exploración de estrategias terapéuticas en los roedores. Dos modelos de trauma cerebral agudo estudiado con imágenes in vivo de dos fotones de cerebro se demuestran en este protocolo.

Trauma cerebral aguda en ratones seguido de Longitudinal dos fotones de imágenes

Los astrocitos fenotípicamente salvajes y las células madre neurales recolectadas de ratones modificados con alelos oncogénicos condicionales floxados y transformados a través de la recombinación mediada por Cre viral se pueden utilizar para modelar la patogénesis del astrocitoma in vitro e in vivo mediante la inyección ortotópica de células transformadas en cerebros de compañeros de camada singénicos e inmunocompetentes.

Modelado astrocitoma Patogénesis In Vitro Y En Vivo Uso cortical astrocitos o células troncales nerviosas de ratones condicionales, Genéticamente Manipulados

Las imágenes intravitales de dos fotones se pueden utilizar para investigar las interacciones entre diferentes tipos de células en la médula espinal en su entorno de tejido nativo en un animal quimérico de médula ósea con una lesión traumática por aplastamiento de la médula espinal en la columna dorsal.

Imaging intravital de axonales Interacciones con macrófagos y microglia en un ratón Dorsal Crush Columna Lesión

Este protocolo sistemático describe un nuevo modelo animal de epilepsia postraumática después de una lesión cerebral traumática leve repetitiva. La primera parte detalla los pasos para la inducción de lesiones cerebrales traumáticas usando un modelo de caída de peso modificado. La segunda parte proporciona instrucciones sobre el enfoque quirúrgico para sistemas de adquisición de datos electroencefalográficos monocanal y multicanal.

Inducir la epilepsia postraumática en un modelo de ratón de lesión cerebral traumática difusa repetitiva

El protocolo describe una lesión cerebral traumática leve en un modelo de ratón. En particular, se explica completamente un protocolo paso a paso para inducir una lesión leve en la cabeza cerrada en la línea media y la caracterización del modelo animal.

Modelo electromagnético controlado de cabeza cerrada de lesión cerebral traumática leve en ratones

Este estudio demuestra la administración de una lesión cerebral traumática repetitiva a ratones y la implantación simultánea de una ventana craneal para la posterior obtención de imágenes intravitales de un EGFP expresado por neuronas mediante microscopía de dos fotones.

Imágenes intravitales de la expresión de proteínas fluorescentes en ratones con una lesión cerebral traumática de cráneo cerrado y ventana craneal utilizando un microscopio de dos fotones

Este protocolo describe un sistema de aire de sobrepresión personalizado diseñado para inducir lesiones del sistema nervioso central (SNC) de sistema cerrado en ratones, incluidos traumatismos oculares, cerebrales y de la médula espinal. El objetivo de este protocolo es proporcionar un marco para que los investigadores adapten y amplíen fácilmente el sistema para sus estudios únicos de trauma en el SNC.

Sistema para la lesión focal y cerrada del sistema nervioso central

Los modelos simplificados de lesiones cerebrales traumáticas (TCE) han facilitado el desarrollo de enfoques terapéuticos. Este protocolo describe la creación de una corteza de ratón con heridas punzadas utilizando agujas, lo que permite el análisis de la hemorragia y la inflamación. El modelo de ratón con LCT con herida punzada ofrece la ventaja de realizarse sin necesidad de equipo especializado.

Modelo de ratón con herida de puñalada para estudiar la hemorragia y la inflamación en lesiones cerebrales traumáticas

Aquí, proporcionamos una metodología detallada para aislar la retina del ojo del ratón para una experimentación ex vivo extendida. Este protocolo hace hincapié en hacer que este enfoque técnicamente exigente sea accesible para los investigadores que deseen aprovechar las vías de investigación que ofrece mantener la glía de la retina in situ en tejido vivo.

Un modelo de explante ex vivo para estudiar las interacciones gliales en la retina del ratón

Aprende a inducir gliosis reactiva en el prosencéfalo de ratón mediante lesión por puñalada. Este método simplificado permite estudiar procesos celulares y moleculares de la respuesta glial tras daño cerebral sin equipo especializado.

Disparo reactiva Gliosis

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