Una nueva aplicación de la eléctrica Penetración Gráfico (EPG) para la adquisición y medición de señales eléctricas en el floema Tamiz Elementos

El objetivo general del siguiente experimento es estudiar las señales eléctricas de larga distancia transmitidas a través de los elementos del tamiz de flujo desde un área que está siendo devorada por una oruga hasta un área intacta en una planta. Esto se logra ensamblando un gráfico de penetración eléctrica o circuito EPG que integra un insecto hemín, como un pulgón y una planta. El pulgón inserta su estilo en la planta, cerrando así el circuito, y comienza el registro de EPG.

Finalmente, el pulgón inserta su estilo en un elemento de tamiz y saliva en él durante unos minutos, seguido de la fase de ingestión de larga duración, tanto la salivación o fase E una como la ingestión o fase E dos contienen potenciales de flujo pequeños y rítmicos. A continuación, se coloca una oruga en una hoja y se deja que se alimente de una hoja. Mientras el pulgón registrado en EPG continúa alimentándose del flujo en una hoja vecina, el daño infligido por la oruga a la vena media iniciará una señal eléctrica que se transmitirá a través del femo a las otras hojas, incluida la hoja de la que se alimenta el pulgón alambrado con EPG.

El tamaño de la señal se puede medir por comparación con un pulso de calibración de tamaño conocido, que se aplicó previamente durante la fase E dos o de ingestión. Los resultados muestran que el daño mediado por Caterpillar de una hoja induce consistentemente una señal eléctrica compleja y significativamente grande en el flujo de una hoja vecina con un primer componente lento y un segundo y superpuesto al primer componente rápido. La técnica del gráfico de penetración eléctrica se introdujo en la década de 1960.

El monitoreo de EPG ha contribuido sustancialmente a nuestro conocimiento de la penetración de pulgones y otros insectos del dobladillo en las plantas. El principal interés económico está en el estudio de los mecanismos de resistencia de la planta huésped, así como los mecanismos de transmisión de los virus de las plantas. Así que se me ocurrió un concepto de usar EPG como un método para la electrofisiología intracelular en plantas al hacer una asociación entre los registros de EPG y los registros intracelulares que se realizan con electrodos de vidrio convencionales que están llenos de cloruro de potasio tanto en las grabaciones EPC como en las grabaciones convencionales hechas con electrodos de vidrio.

Hay dos niveles de voltaje, un nivel de voltaje relativamente alto que corresponde a la posición intracelular de la punta del electrodo de vidrio o la punta del estilo AE, y un nivel de voltaje relativamente bajo, que corresponde a la posición intracelular del electrodo de vidrio o del ojal de AE. En el caso de EPG. Al criar pulgones para un registro de PG, la elección de la planta y las especies de pulgón depende de la investigación Objetivo de estudios sobre la opana rápida, el pulgón es apropiado, criarlos en un invernadero en las jaulas que rodean la cría.

Las plantas deben hacerse a prueba de pulgones y parasitoides utilizando una malla fina con aberturas de menos de un milímetro, pero la parte superior de las jaulas debe ser de material transparente para permitir la fotosíntesis. Cada dos semanas, la población de pulgones debe trasladarse a plantas frescas. De 10 a 20 adultos es todo lo que se necesita, los pulgones restantes se pueden deshacer.

Para los registros de EPG de insectos, se debe construir un electrodo especializado a partir de clavijas de conector de latón, un cable de cobre de uno a dos centímetros de longitud, como filamentos de un cable eléctrico, y un trozo de alambre de oro muy delgado de aproximadamente 1,5 centímetros de longitud. Además, use un pegamento de plata a base de agua y un perno de soldadura pequeño simple con líquido de soldadura y alambre de soldadura de cuerda de resina. Para comenzar, derrita un trozo de alambre de metal para soldar en la punta de un perno para soldar.

A continuación, sumerge la cabeza del clavo de latón en una gota de líquido de soldadura. Conecte inmediatamente la punta del alambre de cobre con la punta del perno de soldadura, fundiéndolo así en el pasador de latón. Ahora agite bien o agite el pegamento de plata para que la emulsión no se asiente.

Abre el frasco y sumerge el extremo libre del alambre de cobre en el pegamento de la tapa debajo de un estereoscopio. Une la malla dorada con una superposición de al menos un milímetro y deja que el pegamento plateado se seque. Trate de no untar el pegamento en la placa del microscopio después de que el pegamento se seque, verifique el contacto entre el pegamento de plata y el alambre de oro donde partes de los alambres de unión no están pegadas.

Agregue pegamento fresco con un alfiler pequeño o alambre de cobre hasta que el insecto esté listo. El electrodo completo se puede almacenar de forma segura en espuma de poliestireno. Para arreglar el pulgón, use un simple dispositivo de vacío casero.

La succión se controla mediante un pequeño trozo de papel sobre un orificio de entrada. Encienda el dispositivo de vacío y muévalo sobre la placa del microscopio estereoscópico para centrar su punta de succión. Recoja un pulgón en un pincel de acuarela de tamaño pequeño o más pequeño, y monte el pulgón en su lado ventral hacia la punta de succión para facilitar el acceso al dorso.

Con el cepillo, retire la cera de la superficie del abdomen, que es abundante en el pulgón de la col. Ahora agite bien o agite el pegamento de plata y, con un alfiler fino para insectos, aplique una pequeña gota de pegamento de plata sobre el dorso de los pulgones. Deje que se seque durante dos o tres minutos.

Agite de nuevo el vial y aplique una gota de pegamento encima de la primera gota seca. Luego conecte el alambre de oro del electrodo de insecto preparado en la segunda gota de pegamento de plata. Mientras aún esté húmedo, mantén el alambre en su posición mientras se seca el pegamento.

Si algún pegamento entra en contacto con las patas o con alguno de los pulgones, comience de nuevo con el nuevo animal. El electrodo de insectos se puede reciclar. Una vez que el pegamento se haya secado.

Apague la succión y libere el pulgón del dispositivo de vacío. El insecto alambrado ya está listo para ser utilizado para grabaciones EPG. Algunos pulgones pueden estar alambrados sin fijación al vacío.

En este caso, coloque el pulgón en un trozo de tejido de laboratorio, que sea lo suficientemente áspero como para que el pulgón permanezca agarrado. Durante la aplicación de pegamento, se puede insertar un alambre de oro en la primera gota de pegamento de plata. Si esta gota es demasiado pequeña o si se seca demasiado rápido, el alambre de oro no se adherirá correctamente.

En ese caso, simplemente coloque una pequeña gota de pegamento plateado encima de la primera e inserte el alambre de oro, espere hasta que el pegamento se seque. A continuación, levanta el pulgón del papel de seda con la ayuda de un pincel fino. Guarde los pulgones alambrados insertando el clavo de latón en la espuma de poliestireno hasta que lo necesite.

Para empezar, coloque las plantas experimentales en la jaula de Faraday sobre un soporte no conductor como una placa de Petri. Ahora, inserte un electrodo de planta en la tierra de cada maceta. El electrodo de la planta no es un electrodo de tierra que deba recogerse en la jaula de Faraday.

A continuación, inserte la clavija de latón del electrodo en el EPG. Preajuste la posición de la planta y el insecto hasta que estén en contacto con el insecto en la posición deseada en la planta. Con el software de interfaz Style plus, que tiene una frecuencia de muestreo fija de 100 hercios, introduzca un nombre de archivo, especifique el tiempo de grabación y escriba texto para especificar los detalles del experimento en las líneas de comentarios.

A continuación, inicie la grabación a través del software haciendo clic en el botón de inicio en la esquina superior izquierda. Comience el experimento bajando el pulgón alambrado a la planta hasta ocho canales, lo que significa que ocho insectos alambrados pueden ser registrados simultáneamente por una configuración de EPG, ya sea uno por planta o más pulgones en una planta. Cuando el pulgón inserta su estilo en la planta, el circuito se completa.

Los voltajes fluctuantes de la señal EPG aparecerán en la pantalla de la computadora, realice ajustes del voltaje y la ganancia de la planta para un registro óptimo. En la mayoría de los casos, un pulgón tardará al menos una hora en entrar en la fase de flujo. La alimentación de flujo sostenido se indica mediante al menos 10 minutos de forma de onda E dos.

En este punto, el electrodo está listo para adquirir señales eléctricas del elemento tamiz, que solo deben inducirse cuando la señal E dos es estable. Es importante entregar uno o más pulsos de calibración, que se utilizarán posteriormente para estimar el tamaño de las señales eléctricas. Cortar una hoja con tijeras induce constantemente una señal eléctrica a larga distancia que es adquirida por el pulgón registrado en EPG.

En un experimento más realista, se utiliza una oruga hambrienta como agente heridor. El daño infligido por la oruga induce constantemente señales eléctricas lentas y rápidas que viajan a las otras hojas y se pueden adquirir con electrodos EPG. El ruido generado por la introducción de la oruga no afectará la respuesta electrofisiológica de la planta, pero puede enmascararla para minimizar este ruido.

El experimentador debe estar conectado a tierra para probar si una oruga que se alimenta induce señales eléctricas en la hoja que se está comiendo. Una oruga hambrienta se coloca en la hoja que también contiene el pulgón registrado EPG cuando se cortaron secuencialmente dos hojas diferentes con tijeras en la unión de la lámina peral. Un electrodo EPG colocado en la vena media de una hoja intacta que era vecina de ambas hojas que se estaban cortando detectó respuestas electrofisiológicas similares del mismo elemento de tamiz a estas heridas.

Estas electrofisiológicas consistieron en una despolarización lenta y una despolarización rápida superpuesta a la lenta. En otro experimento, también se cortaron dos hojas, pero en este caso, una era vecina de la hoja que contenía el electrodo de EPG, mientras que la otra no era vecina de la hoja con el electrodo de EPG. En este caso, el único elemento del tamiz respondió de manera diferente a las heridas.

La herida en la hoja no vecina primero indujo solo una señal eléctrica lenta, mientras que la herida en la hoja vecina indujo una señal compleja con componentes lentos y rápidos. Estos resultados sugieren que los elementos SIV son capaces de detectar la localización del daño aquí utilizando un pulgón conectado al sistema EPG, los registros intracelulares se realizaron a partir de un elemento de tamiz marginal en una hoja de una planta de arabidopsis. El corte de una hoja vecina indujo una señal eléctrica que se transmitió al elemento del tamiz en el que se insertó el estilete de pulgón.

A diferencia de los elementos de tamiz en las vetas principales, los elementos de tamiz en las vetas marginales respondieron al daño remoto con una sola onda de despolarización lenta que puede corresponder a la onda de despolarización lenta en los elementos del tamiz central. El gráfico de penetración eléctrica o repetición es un método que puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la electrofisiología y la fisiología de las plantas, como, por ejemplo, cuáles están en los canales, subyacen a las señales eléctricas de larga distancia que viajan de una hoja a otra y, lo que es más importante, ¿cuáles son las funciones de estas señales en la adaptación de las plantas a su entorno? Después de ver este video, debería tener una idea de cómo preparar plantas e insectos para EPG.

Registrar el cableado de insectos parece complicado, pero hemos demostrado que es bastante sencillo y puede animarte a implementarlo en tu propia investigación.