Name: 在电气贯穿图（EPG）的韧皮部筛分子获取和测量电信号中的新应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-02T09:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 16 s
Description: 了解利用EPG技术记录植物韧皮部筛分子电信号的方法。通过将蚜虫与植物整合，研究昆虫取食诱导的长距离电信号及其在植物生理中的应用。

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VSR 受 IIF Marie Curie 基金（WOUND IN EARTH，缩写为：Arabidopsis thaliana 中的伤口诱导电信号）资助。

1. 蚜虫饲养
注意：EPG 记录所用植物和蚜虫种类的选择取决于研究目的。对于拟南芥（Arabidopsis thaliana）的研究，选用菜豆蚜（Brevicoryne brassicae）是合适的。
<ol>
	<li>在温室中以Brassica oleracea饲养B. brassicae蚜虫。将用于饲养蚜虫的植株置于防虫网罩中，以避免污染其他植株。将蚜虫饲养植株与实验用植株（本实验中为B. oleracea和A. thaliana）分别放置于不同房间，以防止实验植株被蚜虫污染。</li>
	<li>大约每两周将蚜虫转移至新鲜植株一次，以避免造成显著的植株损伤或种群过度繁殖。每次转移10–20只成年蚜虫至新的饲养植株，以建立新的种群。</li>
	<li>定期检查饲养植株，防止其他蚜虫种类、昆虫植食者、蚜虫寄生蜂以及可能影响蚜虫种群健康的真菌污染。</li>
	<li>用于EPG记录的蚜虫应为最后一次蜕皮后一周内的成年无翅型个体。</li>
	<li>实验结束后，将未使用的实验植株放回生长室，因为这些植株上通常已产生部分后代，若不妥善处理可能意外污染其他植株。</li>
</ol>
2. 用于EPG记录的昆虫接线
<ol>
	<li>制作昆虫电极时，需准备黄铜连接针（钉子，Ø 1.2 mm）、细铜线（Ø 0.2 mm）和极细的金线（Ø 约 20 µm），水性银胶，带助焊剂和松香芯焊锡丝的简易小型焊接螺栓，10倍放大立体显微镜，小剪刀或手术刀，两把精细镊子，以及泡沫塑料板或泡沫塑料箱。注意：可使用涡旋振荡器。注意：电极制备的分步操作流程如下所示 图2.</li>
	<li>用于蚜虫操作和胶水涂抹，需准备：小型柔软的水彩画貂毛笔（2号或更小）以及昆虫针（如昆虫标本采集所用），但细缝纫针或牙签也可替代。第4步展示如何开始EPG记录。</li>
	<li>步骤 1。 
	注意：以下步骤1和2展示如何制备昆虫电极（不含蚜虫）。步骤3展示如何将蚜虫连接至电极。在进行电极连接时，建议使用真空固定装置固定蚜虫，但对于移动缓慢的物种并非必需例如， B. brassicae).
	<ol>
		<li>打开焊枪电源，并在其尖端熔化一些焊锡丝（图 2A）。用一些助焊剂润湿黄铜连接针的头部（图 2B）并将其浸入熔化的焊料金属中（图 2C).</li>
		<li>在一段长1-2 cm的细铜丝一端涂覆一层熔融的焊料金属图2D）。然后将针和铜线一起接触灼热的螺栓（图2E）并将它们一同移开以冷却并固化（图2F).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>步骤 2。
	<ol>
		<li>彻底振荡（或涡旋）银胶小瓶数分钟，直至形成均匀乳液。在体视显微镜的载物台上，用剪刀或手术刀截取数段长约1.5 cm的金线图 2G).</li>
		<li>取一根带焊接铜线的黄铜针（按第2.3节制备），将铜线的自由端浸入小瓶瓶盖内侧开启后积聚的小量银胶中图 2H）。注意：仅需少量液滴。</li>
		<li>将蘸有胶水的铜丝末端移至金丝上，同时抬起一端，避免胶水沾染到体视显微镜的载物台。尽量使铜丝与金丝重叠数毫米图 2I），将胶水均匀涂抹在两根导线的重叠部分。</li>
		<li>等待胶水充分干燥，以确保导线保持连接。干燥后检查胶水接触情况，若发现连接处的导线有未被胶水覆盖的部分，可用细针或其他细铜丝蘸取少量新鲜胶水进行补涂。</li>
		<li>昆虫电极制备完成后，可将其插入一块聚苯乙烯泡沫中存放。 
		注意：金丝的长度将决定蚜虫的活动自由度：如果金丝过短（小于5 mm），蚜虫可能会感到受限，无法正常活动；如果金丝过长（&gt;2 cm），蚜虫将自由移动。若条件允许，蚜虫倾向于移动至叶片的近轴面。若金线接触到叶片，信号将发生短路。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>步骤 3。
	<ol>
		<li>蚜虫可通过轻微负压固定，使用真空装置；此时，将吸吮装置安装在体视显微镜下方。将吸口置于视野中央。</li>
		<li>充分振荡银胶小瓶数分钟（或使用涡旋振荡器），直至形成均匀的乳状液。用小毛刷收集一只蚜虫。</li>
		<li>打开吸力装置，将蚜虫固定在吸力开口处（图 2J），使腹部背面朝向实验者。用细刷去除腹部表面的蜡质（甘蓝蚜虫中较为丰富）。</li>
		<li>打开胶水小瓶，用微量银胶润湿一根细针图 2K）。将一滴银胶涂在蚜虫腹部的背面（图 2L-M）。静置数分钟，待液滴完全干燥后，再次剧烈震荡胶水瓶，并在第一滴银胶上叠加第二滴银胶。注意：银胶虽为电导体，但不会对昆虫的外骨骼造成明显损伤。</li>
		<li>关闭胶水瓶后，将金线的自由端插入湿润的液滴中，并保持金线静止，直至胶水完全干燥（图 2N）。避免将胶水沾到蚜虫的足或触角上，若发生此情况，则弃用该蚜虫。</li>
		<li>关闭吸力固定装置，并小心地提起昆虫（图 2O如有需要，可使用细毛刷辅助将蚜虫从吸虫装置上取下。 
		注意：接线 B. brassicae 无需使用真空装置，可将蚜虫固定在一片精密实验室擦拭纸上，其粗糙表面可为蚜虫提供足够抓力，使其在腹部滴加湿胶后不会被抬起。待胶水干燥后，可用细毛刷将蚜虫从擦拭纸上轻轻提起。</li>
		<li>将带有导线的昆虫插入泡沫塑料中，并根据需要，继续为其他所有用于EPG记录实验的昆虫进行导线连接。 
		注意：这些蚜虫电极连接方案对我们的实验效果良好。使用者可自行探索适合的蚜虫电极连接方法。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第4步。
	<ol>
		<li>将植物放入法拉第笼中（图 2P使用非导电性材料作为支撑：可采用培养皿或玻璃、塑料板。</li>
		<li>将植物电极插入每个花盆的土壤中。将连接导线的昆虫上的黄铜针插入EPG前置放大器的输入连接口图 2Q）。注意：土壤电极并不等同于其他电生理技术中使用的接地电极，它具有所需的偏移电压，可用于调节和补偿电极极化电压。</li>
		<li>在 Stylet+ 采集软件界面上，以固定的 100 Hz 采样频率，输入文件名，设定记录时间，并填写文本以注明实验细节（处理方式、植物/昆虫种类， 等等。在第2行和第3行的注释中。</li>
		<li>将昆虫轻轻放置于植物的合适着陆区域，然后点击采集软件（Stylet+）界面上的“开始”按钮，启动记录过程。 
		注意1：EPG装置中最多可同时使用8个通道。每株植物可使用一个或多个EPG电极。 
		注2：当研究重点为蚜虫行为时，应在蚜虫接触植物前开始记录，以避免遗漏最初的植物刺探活动。</li>
		<li>为研究蜜露分泌器（SEs）对刺激的电生理反应，需在蚜虫进入韧皮部阶段后至少等待10分钟，以确保蚜虫处于持续的韧皮部取食阶段且信号基线稳定。只有在此之后，方可开始任何植物刺激实验。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="土壤呼吸装置设置、植物实验示意图、测量CO2释放、研究实验。" src="/files/ftp_upload/52826/52826fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 利用蚜虫或其他半翅目昆虫制备用于电穿透图谱（EPG）记录的EPG电极。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52826/52826fig2highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
图 A-I 展示了制备 EPG 电极（不含蚜虫）所需的步骤。首先，在焊接螺栓的尖端熔化一小块焊料金属（A）。然后，将黄铜针的头部浸入一滴助焊剂中（B），并使其接触焊接螺栓尖端的熔融金属（C）。在此步骤完成后立即进行下一步：将一根铜线的末端接触焊接螺栓的尖端，以将其粘接到黄铜针的头部（E-F）。使用解剖刀或刀片截取一段金线（G）。将铜线的自由端（另一端已连接至黄铜针）浸入银胶中（H），并在银胶干燥前迅速将金线连接到该端（I）。金线具有优良的导电性，并可被极化。实际上，在大多数情况下，这种极化程度极小，难以检测；若存在，可通过偏移电压（V）进行补偿。
图示 J-O 为将蚜虫（或其他半翅目昆虫）连接至电极所需的步骤。首先，使用细毛水彩画笔小心地提起一只蚜虫，并将其放置在真空吸力装置的开口处（J）。打开真空泵，并用一小片纸覆盖气阀孔以施加吸力。在体视显微镜下，将昆虫针的尖端蘸取银胶（K），然后在蚜虫腹部顶端滴加一小滴银胶（L-M）。在接下来约 20 秒内，趁蚜虫身上的银胶尚未干燥，将昆虫电极的金丝末端插入湿润的银胶液滴中，并保持固定 1–3 分钟，直至银胶完全在空气中干燥（N）。此时，通过移除覆盖吸力装置气阀孔的纸片来关闭吸力，并小心地将蚜虫从吸力装置上取下：接线完成后提起蚜虫时常需借助细毛画笔辅助操作（O）。
图P展示了屏蔽室内整个EPG系统的设置概览，图Q展示了用于EPG实验的植物-蚜虫组合概览。有关此过程的更详细说明，请参见上述第2节。
小写字母为制作EPG电极所需物品的标签：a：焊接螺栓；b：熔化的焊料；c：助焊剂；d：黄铜连接针（钉）；e：铜线；f：直径 18µm 的金线；g：吸液装置；h：蚜虫；i：水性银胶；j：法拉第笼；k：植物电极；l：EPG前置放大器的输入连接器（BNC）。

<ol><li>Salvador-Recatalà, V., Tjallingii, W. F., Farmer, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time%2C+in+vivo.+intracellular+recordings+of+caterpillar-induced+depolarization+waves+in+sieve+elements+using+aphid+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Real-time, in vivo. intracellular recordings of caterpillar-induced depolarization waves in sieve elements using aphid electrodes.</a> New Phytologist. 203 (2), 674-684 (2014).</li>
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</ol>

WFT 将 EPG 系统的推出作为退休后的一项活动，并在财务上与其相关联。

本文提供了一种进行电穿透图（Electrical Penetration Graph，EPG）记录的详细实验方案。EPG技术已得到广泛应用，全球约有100至200名活跃用户，并已被用于多个不同领域的研究，例如：a）寄主植物对蚜虫及其他具刺吸式口器昆虫的抗性研究13；b）植物病毒与病原体传播机制的研究14；c）杀虫剂作用机制（包括毒性和行为变化）的研究15；d）EPG甚至被用于证明蚜虫之间的争斗对获胜个体有利，因其可提高取食效率16。
学习如何为昆虫连接EPG记录导线并不困难，但需要耐心和实践经验才能掌握。从制作电极到最终完成昆虫接线，建议进行为期一至两周的练习。在此期间，研究人员将熟悉所选昆虫物种的操作方法，并能够顺利地完成所有步骤。关键步骤包括：正确进行焊接、在取用银胶前充分摇匀试剂瓶，以获得大小适中的胶滴（既不能太小也不能太大）、确保良好的电学和机械连接，以及将金丝准确放置于昆虫腹部的银胶滴内，同时避免限制昆虫的活动。若这些步骤操作不当，将导致电连接不良，从而产生质量差或无法接受的数据。当将...

产生远距离电信号的能力是一种多细胞生物的有利性状，可使其对外部刺激产生高效反应。这一性状在植物和动物中独立演化，因此属于趋同演化的案例。鉴于动物中的电信号与神经传导和肌肉收缩等重要功能密切相关，动物中由刺激诱导的电信号的分子基础、传递机制及其功能已成为深入研究的课题。相比之下，植物中由刺激诱导的电信号研究较少。尽管植物没有神经或肌肉，但已有足够证据表明，植物中由刺激诱导的电信号在其对环境因素的响应中起着关键作用。
韧皮部作为植物维管组织的活体组成部分，被认为是在受刺激/受损区域与未受刺激/未受损区域之间传递刺激诱导电信号的主要媒介2韧皮部中的主要细胞是筛管分子（SEs），这类细胞结构相对简单，呈长形。SEs的末端与其他SEs相连，形成贯穿整个植物体的连续低阻抗筛管系统。然而，针对这些高度特化细胞的电学特性研究甚少。在以往的研究中，研究人员使用玻璃微电极进入SEs3 或使用与蚜虫口针相连的玻璃电极，在进行口针切除（切割）后插入植物4玻璃微电极由玻璃毛细管制成，通过加热将一端拉制成尖端直径小于 1 µm 直径，然后用KCl溶液填充。将一根Ag/AgCl电极或铂丝插入充满KCl溶液的玻璃电极中，并连接至放大器输入端，参考电极则插入包围目标细胞的浴液中，以形成完整电路。该装置用于记录细胞外参考电极与细胞内测量电极之间的电位差。 即， 细胞的膜电位5利用该方法，Umrath 首次对植物细胞进行了细胞内记录，所用材料为藻类 Nitella6,7. Nitella 是一种结构相对简单的生物，其细胞较大，因此适合进行细胞内电生理实验。相比之下，将玻璃电极插入多细胞、三维结构的陆生植物的微小细胞中在技术上具有较高难度，需要研究人员具备高超的操作技能，同时还需要配备先进的显微成像、显微操作和防震设备。尽管玻璃电极适用于记录植物表层细胞的电活动，例如根表皮细胞8，对深埋于植物组织内的细胞（如筛管分子）进行细胞内记录时，很可能引发由损伤导致的响应，从而干扰实验结果。1989年，Fromm和Eschrich报道了一种替代方法，称为“蚜虫法”，该方法在切除蚜虫口针后，将玻璃电极与蚜虫口针相连接4蚜虫法具有微侵入性，因为其柔韧的口针不会像玻璃电极那样对组织或细胞造成损伤。蚜虫口针是自然界为植物穿刺而精妙设计的工具，蚜虫在寻找筛管（SE）方面远比人类更为熟练。然而，该蚜虫法在技术熟练度和设备方面要求极高。此外，每次采用该技术的实验成功与否完全取决于蚜虫是否处于取食状态——即在进行口针截断术（stylectomy）时，口针已稳定插入筛管内。回顾来看，可以发现若在实验装置中增加一种能够判断蚜虫口针是否已进入筛管的仪器，则该技术的成功率有望得到提高。
1964年，McLean 和 Kinsey 描述了一种用于实时研究蚜虫取食行为的“电子监测系统”9,10在此系统中，蚜虫和被口针刺入的植物被整合到一个电路中。随后在1978年，Tjallingii 设计了一种该系统的改进版本，称为“电穿透图”（Electrical Penetration Graph，EPG）系统。11,12而原始的电子监测系统仅对由电阻产生的电位敏感，使用EPG系统后，可检测由电动势（emf）产生的电位， 即， 在植物或昆虫体内产生的电位，除了可记录蚜虫体内由抗性（R）引起的电位外，还可被记录下来。这一改进意义重大，因为电动势（emf）和抗性（R）这两个信号组分均可提供蚜虫刺入植物过程中相关生物学事件的重要信息。EPG前置放大器之所以对R组分敏感，是因为其输入电阻相对较低，为1 GΩ，接近植物与蚜虫电阻的平均水平。微小的偏移电压（图 1，施加约+100 mV的电压（V）于植物上，该电压随后在植物与昆虫一侧以及输入电阻另一侧之间分配。在某一点测量电压及其变化情况图1A,B）位于昆虫与输入电阻之间。因此，R组分代表了蚜虫-植物电阻对偏移电压的调节，而电动势（emf）组分则是蚜虫口针尖端处植物电位以及昆虫体内产生的电位的某一比例。其中最为相关的植物电位主要是蚜虫口针穿刺的植物细胞的膜电位，而昆虫体内的电位则主要表现为由两根口针管道内液体流动所引起的流动电位。 即， 食物和唾液管；在EPG中未记录到内部神经或肌肉电位。实际上，口针尖端起到电极尖端的作用。相对于细胞外部的正电荷，所有植物细胞内部均带负电荷。电流（即， 带电离子在水溶液中的移动）从内部流向外部 反之亦然 由于细胞膜的高电阻性，离子跨膜流动非常有限。通常情况下，静息电位保持恒定。然而，当负离子向外移动或正离子向内移动通过细胞膜时，膜电位会降低。 即， 它会发生“去极化”。当细胞兴奋时，就会发生去极化。此时，当细胞膜上的特定离子通道打开，或膜受到损伤导致离子进出泄漏时，离子便会流入或流出。所有细胞的质膜上都具有离子通道和离子泵，可通过恢复细胞内各种离子的原始浓度，使膜电位恢复到静息水平。静息电位及其变化属于电动势（emf）的组成部分，因此，EPG技术适用于测量这些电位变化。
<img alt="Electrochemical potential measurement in aphid stylet, EPG setup diagram, voltage-time graph." src="/files/ftp_upload/52826/52826fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. EPG-电极EPG电极是由一只活体蚜虫整合到电穿透图谱（EPG）电路中构成的，其口针插入筛管分子（SE）并处于稳定取食状态。若被口针刺入的筛管分子处于静息状态（图A），则EPG记录到的电路电压稳定，处于静息电位水平（图C，静息）。当筛管分子受到刺激时，其膜发生去极化（图B），在EPG图谱上表现为电压逐渐升高（图C，去极化）。随着筛管分子内离子平衡恢复至静息状态， 即， 当其复极化时，EPG记录到的电压逐渐下降至静息电位水平（图C，复极化）。图C中，“A”和“B”分别指代图A和图B所示的情形。V = 可调偏移电压源。Ri = 输入电阻。放大器并联一个1 GΩ的外部电阻，同时其内部（运算放大器内）含有一个1.5 TΩ的高阻值电阻（图A和图B中以灰色表示）。通过远程控制开关，EPG前置放大器可由正常模式切换至emf模式，从而获得高精度的电压值。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52826/52826fig1highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
在下一节中，我们将为读者提供一个进行EPG实验的基本方案，该方案适用于以昆虫为重点和以植物为重点的研究。

<table><tbody><tr><td>黄铜连接针</td><td>EPG Systems/hardw.shop</td><td></td><td>&amp;Phi; 1.2 mm</td></tr><tr><td>细铜丝</td><td>EPG Systems/hardw.shop</td><td></td><td>约 &amp;Phi; 0.2 mm</td></tr><tr><td>细金丝</td><td>EPG Systems</td><td></td><td>&amp;Phi; 18 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>焊剂</td><td>五金店</td><td></td><td>与焊锡丝匹配</td></tr><tr><td>树脂芯焊锡丝</td><td>五金店</td><td></td><td></td></tr><tr><td>泡沫塑料板</td><td>任意品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水性银胶</td><td>EPG Systems</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.epgsystems.eu/">配方见：www.epgsystems.eu&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>纸巾</td><td>Kimberly-Clark</td><td>5511</td><td></td></tr><tr><td>焊接螺栓</td><td>任意品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Hund Wetzlar</td><td></td><td>最低放大倍数为10倍</td></tr><tr><td>小型剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14088-10</td><td></td></tr><tr><td>手术刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>10050-00</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-20</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>A. Hartenstein</td><td>L46</td><td></td></tr><tr><td>水彩画笔</td><td>任意品牌</td><td></td><td>1号或2号</td></tr><tr><td>空气抽吸装置</td><td></td><td></td><td>参见说明：www.epgsystems.eu</td></tr><tr><td>昆虫针</td><td>任意品牌</td><td></td><td>1号或2号</td></tr><tr><td>稳固的实验台</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>法拉第笼</td><td></td><td></td><td>手工制作</td></tr><tr><td>计算机</td><td>Fujitsu Siemens</td><td></td><td></td></tr><tr><td>数据采集软件</td><td>EPG Systems</td><td></td><td>Stylet+d</td></tr><tr><td>Giga-4 (-8) 完整系统</td><td>EPG Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>包含以下组件：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>带USB输出的主控箱</td><td></td><td>Di155/Di710</td><td>12/14 位，采样率 100&amp;nbsp;Hz（软件固定）</td></tr><tr><td>EPG 探针 4（8）个</td><td></td><td></td><td>50倍直流前置放大器</td></tr><tr><td>杆上旋转夹具</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>直流电源适配器</td><td></td><td></td><td>双极性，230/115 VAC 转 -/+8 VDC</td></tr><tr><td>植物电极及连接线</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>额外的测试和接地电缆&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种利用电穿透图（epg）获取和测量韧皮部筛管元件电信号的新应用

A New Application of the Electrical Penetration Graph (EPG) for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

细胞的电生理特性常被研究 体外，从其原始环境中分离后。然而，要研究生物体内远距离细胞之间的电传递，则需要 体内，无伪迹地记录嵌在天然环境中的细胞。植物受伤区域向未受伤区域传递电信号的现象长期以来一直引起植物学家的兴趣。韧皮部是遍布植物体内的活体维管组织，被认为在植物电信号传导中起主要作用。然而，由于缺乏合适的电生理学方法，研究韧皮部细胞的电学特性面临诸多挑战。 体内. 本文介绍了一种利用活体蚜虫或其他韧皮部取食型半翅目昆虫整合到电穿透图谱（EPG）电路中，用于筛管分子（SEs）细胞内电生理研究的新方法。该方法具有多功能性、稳定性和高精确度，使得能够详细记录和研究模式植物主脉筛管分子中由伤口诱导产生的电信号 拟南芥1在此，我们展示了EPG电极可轻松用于边缘叶脉中筛管分子（SEs）的细胞内电生理记录，并可用于研究SEs对多种外界刺激产生电信号反应的能力。将EPG技术应用于SEs的细胞内电生理学研究，可广泛适用于多种植物物种、大量的植物-昆虫组合以及多种研究目的。

在之前的一项研究中，我们采用了EPG电极技术，旨在表征毛虫攻击期间中脉筛管分子（SE）产生的电信号1。中脉是传统玻璃电极以及玻璃微吸管电极的首选插入位点，因为该部位筛管分子密集且结构相对坚固，便于实施这些技术所需的固定操作。在此，我们利用EPG电极的灵活性，旨在获取更难接近的筛管分子的电生理信息，特别是叶片边缘叶脉中的筛管分子。图3展示了来自拟南芥（A. thaliana）植物边缘叶脉筛管分子的典型EPG记录，其中包含由远端创伤诱导的电信号。与主脉筛管分子不同，边缘叶脉中的筛管分子对远端损伤产生单一的、缓慢去极化波，该波可能对应于中央筛管分子中的缓慢去极化波。平均而言，叶片边缘筛管分子中这种远距离诱导的缓慢去极化波持续时间为61 ± 27秒，平均振幅为37 ± 2 mV（n = 3，均值 ± 标准误）。这些通过EPG电极易于获得的数据表明，创伤诱导的电信号可在未受伤叶片中从主维管束传播至细小叶脉的韧皮部。
我们还利用了EPG电极的稳定性，探究一个筛管分子（SE）是否能够响应在数分钟时间间隔内施加的多种损伤刺激...

电穿透图谱（EPG）是一种研究具口针昆虫取食行为的成熟技术。本文展示了EPG作为一种非侵入性工具的新应用，用于获取植物韧皮部筛管元件（SEs）的细胞内电生理记录，筛管元件是构成植物韧皮部维管组织的细胞。

一种利用电穿透图（EPG）获取和测量韧皮部筛管元件电信号的新应用

细胞的电生理特性通常在体外研究，即在将其从原有环境中分离后进行研究。然而，……

以下实验的总体目标是研究植物体内由毛虫取食区域向未受损区域通过筛管分子传递的长距离电信号。该目标通过构建电探针图谱（EPG）电路实现，该电路将半体昆虫（例如蚜虫）与植物整合在一起。蚜虫将其口针插入植物组织，从而闭合电路，启动EPG记录。最终，蚜虫将其口针插入筛管分子，并向其中分泌唾液数分钟，随后进入长期的取食阶段。无论是分泌唾液的E1阶段，还是取食的E2阶段，均包含微小而有节律的流电位。接下来，将一只毛虫放置在叶片上，任其取食。当EPG记录的蚜虫继续在邻近叶片上吸食汁液时，毛虫对主叶脉造成的损伤会引发一个电信号，该信号将通过韧皮部传递至其他叶片，包括正在用EPG电极记录的蚜虫所取食的叶片。可通过与之前在E两个或摄入阶段施加的已知大小的校准脉冲进行比较，来测量信号的大小。结果表明，毛虫对叶片造成的损伤始终会在邻近叶片的电流传导中诱导出一种复杂且显著的电信号，该信号包含一个较慢的初始组分以及叠加在第一个组分之上的快速第二组分。电穿透图技术于20世纪60年代被引入。EPG 监测极大地增进了我们对蚜虫及其他半翅目昆虫刺入植物过程的了解。其主要经济意义在于研究寄主植物抗性机制以及植物病毒传播机制。因此，我提出了利用 EPG 作为植物细胞内电生理学研究方法的概念，即将 EPG 记录与传统玻璃电极记录进行关联，这两种记录均使用氯化钾溶液填充的玻璃电极进行细胞内记录。存在两个电压水平：一个相对较高的电压水平，对应于玻璃电极尖端或 AEs 风格的细胞内位置；另一个相对较低的电压水平，对应于玻璃电极或 AEs 小孔的细胞内位置。在 EPG 情况下，当为 PG 记录饲养蚜虫时，植物和蚜虫种类的选择取决于研究目的；对于快速 opana 的研究，该蚜虫是合适的，可在温室中围绕饲养的笼子内进行培养。必须使用孔径小于1毫米的细网筛对植物进行隔离，以防止蚜虫和寄生蜂侵入，但笼子的顶部应采用透明材料，以保证光合作用的进行。每两周需将蚜虫种群转移到新的植物上。仅需保留10至20头成虫，其余蚜虫可处理掉。进行昆虫EPG记录时，必须使用黄铜连接针、一段长约1至2厘米的铜线（例如电源线中的金属丝）以及一段长约1.5厘米的极细金线来制作专用电极。此外，还需使用水性银胶、一个小型简易的电烙铁，并配备焊锡液和树脂芯焊锡丝。开始时，先将一段焊锡丝熔化在电烙铁尖端。然后将铜钉的头部浸入一滴焊剂中。立即将铜丝的末端接触焊锡螺栓的尖端，从而将其熔接到铜针上。现在充分振荡或涡旋银胶，使乳液均匀混合，避免沉淀。打开瓶盖，在体视显微镜下将铜线的自由端浸入瓶盖内的胶水中。将金网重叠至少一毫米后连接，并让银胶干燥。胶水干燥后，尽量避免将胶水沾到显微镜载物台上，检查银胶与金线之间的接触情况，观察连接处未粘合的部分。用小针或铜线添加新鲜胶水，直至昆虫准备就绪。制备完成的电极可安全地存放在泡沫塑料上。固定蚜虫时，使用一个简易的家用真空装置。通过覆盖在进气孔上的一小片纸来控制吸力。打开真空装置，并在体视显微镜的载物台上移动，使吸头位于视野中央。用一支较小的2号水彩画笔或更小的画笔拾取一只蚜虫，将其腹面朝向吸头固定，以便于接触背侧。使用毛刷去除蚜虫腹部表面的蜡质，因为甘蓝蚜虫体表蜡质较为丰富。随后充分振荡或涡旋银胶，并用细小的昆虫针将少量银胶滴加到蚜虫的背侧。静置干燥两到三分钟。再次摇动小瓶，将一滴胶水滴加在已干燥的第一滴胶水上。然后将已准备好的昆虫电极的金线插入第二滴银胶中。在胶水未干时，保持金线位置固定，直至胶水完全干燥。如果胶水不慎沾到蚜虫的足部或其任何部位，请更换新的蚜虫重新开始。昆虫电极可重复使用。待胶水完全干燥后。关闭吸力，将蚜虫从真空装置上取下。已连接导线的昆虫现在可用于EPG记录。部分蚜虫可无需真空固定即可完成接线。在此情况下，将蚜虫放置在一片粗糙的实验室纸巾上，使其能够牢固抓握。在涂抹胶水时，可将一根金丝插入第一滴银胶中。如果此液滴过小或干燥过快，则金丝将无法正确固定。在这种情况下，只需在第一个银胶滴上再放置一小滴银胶，插入金丝，待胶水干燥。然后用细刷轻轻将蚜虫从纸巾上提起。将连接好金丝的蚜虫通过将黄铜钉插入泡沫塑料中保存，直至使用为止。首先，将实验用植物放入法拉第笼中，并置于非导电支撑物（如培养皿）上。然后，将植物电极插入每个花盆的土壤中。注意：植物电极并非需要连接至法拉第笼的接地电极。然后将电极的黄铜针插入EPG。预先调整植物和昆虫的位置，使昆虫与植物上所需的位置接触。使用采样频率固定为100赫兹的Style plus接口软件，输入文件名，设定记录时间，并在注释行中填写文字以注明实验的详细信息。然后通过软件点击左上角的开始按钮启动记录。通过将连接导线的蚜虫放置到植物上开始实验，最多可同时记录八个通道，即一套EPG系统可同时记录八只带导线的蚜虫，可以每株植物一只，也可以多只蚜虫置于同一株植物上。当蚜虫将其口针插入植物时，电路即被接通。EPG 信号的波动电压将显示在计算机屏幕上，需调整植物电压和增益以获得最佳记录效果。在大多数情况下，蚜虫至少需要一小时才能进入流相阶段。持续的流相取食由至少 10 分钟的 E2 波形来指示。此时，电极已准备好采集筛管细胞的电信号，但仅在 E2 信号稳定时才应开始诱导。必须传递一个或多个校准脉冲，以便后续用于估算电信号的大小。用剪刀剪断叶片会稳定地诱导出远距离电信号，该信号可被 EPG 记录的蚜虫所采集。在更为真实的实验中，使用饥饿的毛虫作为造成损伤的媒介。由毛虫造成的损伤会持续诱导出快速和慢速的电信号，这些信号会传递到其他叶片，并可通过EPG电极记录。引入毛虫所产生的噪声不会影响植物的电生理反应，但可能会掩盖信号，因此应尽量减少此类噪声。实验者应确保接地，以检测取食中的毛虫是否会在被啃食的叶片中诱导产生电信号。将一只饥饿的毛虫放置在一片叶片上，该叶片同时承载了用于EPG记录的蚜虫，随后用剪刀依次在两片叶片的叶柄与叶片连接处进行切割。将EPG电极置于一片完整叶片的中脉上，该叶片与被切割的两片叶片相邻，结果检测到同一筛管元件对这些伤口产生类似的电生理反应。这些电生理反应由慢去极化和叠加在慢去极化之上的快去极化组成。在另一项实验中，也切除了两片叶片，但其中一片是插入EPG电极叶片的邻近叶片，而另一片则不是插入EPG电极叶片的邻近叶片。在这种情况下，单个筛管元件对伤口的反应不同。对非邻近叶片造成的伤口最初仅诱导出一种缓慢的电信号，而对邻近叶片造成的伤口则诱导出包含慢速和快速组分的复杂信号。这些结果表明，筛管分子能够检测损伤的位置。在此实验中，通过连接至EPG系统的蚜虫，对拟南芥植株叶片边缘的筛管分子进行了细胞内记录。切割邻近叶片诱导产生的电信号被传递至蚜虫口针所插入的筛管分子中。与主脉中的筛管分子不同，边缘叶脉中的筛管分子对远端损伤仅产生一次缓慢的去极化波，该去极化波可能对应于中央筛管分子中的缓慢去极化波。电穿透图（Electrical Penetration Graph，EPG）或重复记录是一种有助于回答植物电生理学和植物生理学领域关键问题的方法，例如，哪些离子通道介导了从叶片到叶片的长距离电信号？更重要的是，这些信号在植物适应环境过程中发挥着怎样的作用？观看本视频后，您应了解如何为EPG实验准备植物和昆虫。记录昆虫的神经连接看似复杂，但我们已经证明这一过程其实相当简单，这或许会激励您将其应用到您自己的研究中。

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在电气贯穿图（EPG）的韧皮部筛分子获取和测量电信号中的新应用

采用一种具有高通量潜力的微装置，结合新型材料演示了三维（3D）介电泳（DEP）。将石墨烯纳米片纸与双面胶带交替堆叠，并在垂直于层方向钻出一个700...

三维石墨烯电极介电电泳装置的开发

本演示介绍了一种利用电穿孔技术对贴壁培养细胞进行研究的方法，用于分析细胞间连接通讯，同时细胞生长在涂有导电透明氧化铟锡的载玻片上。...

一种用于间隙连接功能检测的实验方法；在氧化铟锡上对贴壁细胞进行电穿孔

细胞膜中的转运蛋白能够介导离子在细胞膜或细胞层之间的选择性分布，在组织生理、修复及病理过程中发挥关键作用。本文介绍了离子选择性自参照微电极技术，该技术可用于测定单个细胞和组织的特定离子流。 体内.

使用离子选择性自参考微电极技术测量细胞外离子流

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电生理学测量在研究电中性转运蛋白活性中的应用

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用于电生理学研究硬骨鱼类垂体细胞的健康脑-垂体切片

本文包含一系列实验方案，用于在多孔微电极阵列（MEA）板上培养人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CM）网络，并通过可逆电穿孔技术穿透细胞膜，以记录动作电位。可在数天内对相同的细胞位点进行多次高通量记录。...

基于多孔微电极阵列的人类诱导多能干细胞衍生心肌细胞网络用于重复动作电位记录

本文概述了联合使用微电极阵列技术和4-氨基吡啶诱导的化学刺激方法，用于研究脊髓背角网络水平的伤害性感受活动。...

使用微电极阵列记录脊髓伤害性感觉回路中的网络活动

本方案描述了构建一种芯片实验室微流控电穿孔装置所需的微加工技术。该实验装置可在连续流动条件下实现可控的单细胞水平转染，并可通过基于细胞群体的控制进一步扩展至更高通量。文中提供了分析结果，展示了实时电学监测细胞膜通透化程度的能力。...

连续流动微电穿孔系统的构建与操作及其通透性检测

描述了研究刺探和摄食行为的步骤 Culex...

交流-直流电穿透图技术用于研究刺探与取食行为 Culex tarsalis 人手上的蚊子

多孔基质电穿孔（PSEP）可实现稳定、高通量的递送，并保持高细胞存活率。跨上皮电阻（TEEI）测量的引入为PSEP的中间过程提供了深入见解，并实现了无标记递送。本文介绍了一种同时进行PSEP递送实验与TEEI测量分析的方法。...

基于多孔基底的电穿孔结合跨上皮电阻监测

监测电穿孔诱导的基因工程Tet-On放电HEK细胞中动作电位生成的变化

了解利用EPG技术记录植物韧皮部筛分子电信号的方法。通过将蚜虫与植物整合，研究昆虫取食诱导的长距离电信号及其在植物生理中的应用。

一种利用电穿透图（EPG）获取和测量韧皮部筛管元件电信号的新应用

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