Name: Generación de recombinante humano IgG anticuerpos monoclonales a partir de células inmortalizadas B Ordenada (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Aprende a generar anticuerpos monoclonales humanos IgG recombinantes a partir de células B inmortalizadas mediante virus Epstein-Barr. Este protocolo permite producir altas cantidades de anticuerpos para investigar respuestas inmunes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Contrato de Investigación Miguel Servet (ISCIII CD14 / 00032) a (GN-G.). Beca de la Organización Holandesa para la Investigación Científica &quot;Escuela de Graduados del Programa de Neurociencia traslacional&quot; (022005019) a (CH). Becas del Prinses Beatrix Fonds (Proyecto WAR08-12) y la Asociación Francesa contra las Miopatías a (PM-M.); así como por un Veni Beca de la Organización Holandesa para la Investigación Científica (916.10.148) una beca de la Fundación Cerebro de los Países Bajos (FS2008 (1) -28) y el Prinses Beatrix Fonds (Proyecto WAR08-12) (a ML ). Agradecemos Jozien Jaspers por su ayuda en la célula B de clasificación por citometría de flujo.

<ol><li>Vrolix, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+heterogeneity+of+thymic+B+cells+from+early-onset+myasthenia+gravis+patients+with+antibodies+against+the+acetylcholine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Clonal heterogeneity of thymic B cells from early-onset myasthenia gravis patients with antibodies against the acetylcholine receptor.</a> J Autoimmun. 52, 101-112 (2014).</li>
<li>Yamashita, M., Katakura, Y., Shirahata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+generation+of+human+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the generation of human monoclonal antibody.</a> Cytotechnology. 55 (2-3), 55-60 (2007).</li>
<li>Pereira, K. M., Dellavance, A., Andrade, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+identification+of+autoantibodies+specific+to+systemic+autoimmune+rheumatic+diseases+in+high+throughput+operation%3A+Proposal+of+reliable+and+feasible+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">The challenge of identification of autoantibodies specific to systemic autoimmune rheumatic diseases in high throughput operation: Proposal of reliable and feasible strategies.</a> Clin Chim Acta. 437, 403-410 (2014).</li>
<li>Losen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+myasthenia+gravis+by+preventing+acetylcholine+receptor+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Treatment of myasthenia gravis by preventing acetylcholine receptor modulation.</a> Ann N Y Acad Sci. 1132, 174-179 (2008).</li>
<li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+fully+human+monoclonal+antibodies+specific+to+a+vaccinating+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen.</a> Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).</li>
<li>Fraussen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+making+human+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">A novel method for making human monoclonal antibodies.</a> J Autoimmun. 35 (2), 130-134 (2010).</li>
<li>Traggiai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+to+make+human+monoclonal+antibodies+from+memory+B+cells%3A+potent+neutralization+of+SARS+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus.</a> Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).</li>
<li>Fraussen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantigen+induced+clonal+expansion+in+immortalized+B+cells+from+the+peripheral+blood+of+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Autoantigen induced clonal expansion in immortalized B cells from the peripheral blood of multiple sclerosis patients.</a> J Neuroimmunol. 261 (1-2), 98-107 (2013).</li>
<li>Yamashita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+individual+immune+responses+elicited+by+in+vitro+immunization%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Different individual immune responses elicited by in vitro immunization.</a> Cytotechnology. 40 (1-3), 161-165 (2002).</li>
<li>Hui-Yuen, J., Koganti, S., Bhaduri-McIntosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+B+cell+immortalization+for+monoclonal+antibody+production%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Human B cell immortalization for monoclonal antibody production.</a> Methods Mol Biol. 1131, 183-189 (2014).</li>
<li>Tiller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+monoclonal+antibodies+from+single+human+B+cells+by+single+cell+RT-PCR+and+expression+vector+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning.</a> J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).</li>
<li>Lanzavecchia, A., Corti, D., Sallusto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+monoclonal+antibodies+by+immortalization+of+memory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Human monoclonal antibodies by immortalization of memory B cells.</a> Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 523-528 (2007).</li>
<li>Traggiai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+of+human+B+cells%3A+analysis+of+B+cell+repertoire+and+production+of+human+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immortalization of human B cells: analysis of B cell repertoire and production of human monoclonal antibodies.</a> Methods Mol Biol. 901, 161-170 (2012).</li>
<li>Strober, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+cell+growth.+Curr+Protoc+Immunol+%2F+edited+by%5BTitle%5D)+AND+%22John+E.+Coligan+...+%5Bet+al.%5D%22%5BJournal%5D)">Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol / edited by.</a> John E. Coligan ... [et al.]. Appendix 3, Appendix 3A(2001).</li>
<li>Ibrahim, S. F., van den Engh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+and+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biochem+Eng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry and cell sorting.</a> Adv Biochem Eng Biotechnol. 106, 19-39 (2007).</li>
<li>Leith, J. T., Padfield, G., Faulkner, L. E., Quinn, P., Michelson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+feeder+cells+on+the+X-ray+sensitivity+of+human+colon+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiother+Oncol%22%5BJournal%5D)">Effects of feeder cells on the X-ray sensitivity of human colon cancer cells.</a> Radiother Oncol. 21 (1), 53-59 (1991).</li>
<li>Hui-Yuen, J., McAllister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-McIntosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+Epstein-Barr+virus+growth-transformed+lymphoblastoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishment of Epstein-Barr virus growth-transformed lymphoblastoid cell lines.</a> J Vis Exp. (57), 3321(2011).</li>
<li>Smith, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+detection+in+automated+DNA+sequence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis.</a> Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

En este manuscrito, todos los pasos para la generación de anticuerpos IgG de PBMCs humanos se presentan en detalle. Este protocolo incluye algunas ventajas sobre las técnicas previamente publicados. Una de las ventajas es que el anticuerpo producido mantiene las cadenas pesadas y ligeras correspondientes al par original en el clon de células B. La identificación de anticuerpos IgG se puede hacer en cualquier tipo de donante humano, y no hay necesidad de exacerbación de la respuesta inmune debido a la vacunación 5.<...

El objetivo de este artículo es describir en detalle una metodología para generar y caracterizar anticuerpos monoclonales IgG humanos obtenidos a partir de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC). El interés de estudiar los anticuerpos humanos ha crecido en muchos campos diferentes de investigación. En particular, muchos grupos de investigación interesados ​​en la patología causada por autoanticuerpos 1-3. Hemos clonado y caracterizado patógenos auto-anticuerpos 1. El estudio de auto-anticuerpos puede ayudar a identificar sus objetivos y desarrollar estrategias terapéuticas, por ejemplo, el uso de anticuerpos de la competencia 4. Por otra parte, el estudio de anticuerpos humanos también puede ser de interés en otros campos de la investigación, es decir, para evaluar la respuesta inmune tras la vacunación 5, para caracterizar el perfil de anticuerpos de los individuos que fueron expuestos y se convirtieron en resistentes a patógenos específicos 6 o para estudiar, que anticuerpos están enel repertorio natural de 7,12. Varias técnicas han sido desarrolladas para generar anticuerpos monoclonales humanos recombinantes 8-12; la mayoría de ellos utilizan presentación de fagos y la inmortalización de células B. El uso de presentación en fagos se ha aplicado ampliamente para el descubrimiento de nuevos anticuerpos 13. Sin embargo, tiene una gran desventaja, a saber, que los pares de cadena pesada y ligera de la inmunoglobulina humana convertido disocian en el proceso. La producción de hibridomas con células B humanas o transformación EBV supera este inconveniente. Utilizamos la infección de las células B del timo con EBV en combinación con la estimulación de células B policlonales mediante Toll-like receptor 9 (TLR-9) 6,12. En este trabajo se describe en detalle la tecnología que utilizamos para el desarrollo de anticuerpos IgG humanos, con una visión completa de todos los pasos de aislamiento de PBMC a la generación in vitro de anticuerpos en. Esteprotocolo se puede utilizar para el análisis de cualquier tipo de perfil de IgG humana. En nuestro laboratorio, las células B productoras de anticuerpos IgG se han separado con éxito del resto de PBMCs después de la clasificación. Cincuenta células B según 8 pueden entonces ser sembraron en placas de múltiples pocillos y inmortalizados por EBV y TLR-9 de activación, para la expansión clonal de células B individuales. Como células alimentadoras, se han utilizado fibroblastos de tejido de pulmón embrionario humano, WI38 línea celular, lo que facilita la visualización de las células B inmortalizadas. A partir de estas células B, las secuencias de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina pueden obtenerse por PCR, y los genes de los anticuerpos &#39;clonados en vectores de expresión de inmunoglobulina G y producen in vitro. Usando esta técnica, los anticuerpos individuales con exactamente la misma secuencia de anticuerpo que se encuentra en el donante pueden ser estudiados.

<table><tbody><tr><td>Histopaco-1077&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td>solución que contiene polisacarosa y diatrizoato de sodio</td></tr><tr><td>FACSAria II clasificador de células&nbsp;</td><td>BD Biociencias&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 placas de micro pocillos con fondo en U&nbsp;</td><td>Costar</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Avanzado Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medio&nbsp;</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>12633-020</td><td></td></tr><tr><td>30% v/v sobrenadante que contiene EBV de la línea celular B95-8&nbsp; &nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-1612</td><td>3.4 x 108 copias/ml</td></tr><tr><td>CpG2006&nbsp;</td><td>Células Invivogen</td><td>ODN 7909</td><td></td></tr><tr><td>Wi38&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90020107</td><td></td></tr><tr><td>Interleucina-2</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>10799068001</tr><tr><td>Placas ELISA</td><td>Greiner Bio-One, Microlon</td><td>655092</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure F(ab')2 Fragmento de cabra Anti-Humano IgG, Fc&gamma; Fragmento específico (no conjugado)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-006-008</td><td></td></tr><tr><td>Leche en polvo descremada al 4% (bloqueador de grado secante)&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>IgG humana&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I 2511</td><td>HUMAN IgG Inmunoglobulina purificada, 5,6 mg/ml IgG</td></tr> de <tr><td>cabra F(ab)2 IgG antihumana Fc&gamma; (conjugado con peroxidasa (PO))</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-036-008</td><td></td></tr><tr><td>Lector de ELISA (Perkin Elmer 2030)&nbsp;</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>2030-0050</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure Rabbit conjugado con peroxidasa IgM antihumana, Fc5&micro; &nbsp; </td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>309-035-095</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de síntesis directa de ADNc de células SuperScript III&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>18080-200</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de PCR GeneAm de Applied Biosystems (ABI) 2700</td> Kit de aislamiento de ARN de alta pureza de <td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>Kit de sistema de transcripción inversa&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A3500</td><td></td></tr><tr><td>ADN Polimerasa Taq Recombinante</td><td>TAKARA</td><td>R001A</td><td></td></tr><tr><td>Imprimadores (2 &mu; l)</td> <td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarosa ultrapura &nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Escalera de 100 bp</td><td>Invitrogen</td><td>15628-019</td><td></td></tr><tr><td>Cantidad Uno 4.5.2 (Gel Doc 2000)</td><td>Biorad</td><td>170-8100</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit de purificación de PCR</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 kit de secuenciación de ciclos&nbsp;</td>Placa <td>de reacción de 4337455</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de 0,1 ml de Applied Biosystems (MicroAMP Optical de 96 pocillos)</td><td>Analizador</td> genético <td>4346906</td><td></td>Applied Biosystems</tr><tr><td>ABI300&nbsp;</td><td>Biosistemas aplicados</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>DH5 y células alfa; competentes (E. coli)</td><td>Invitrogen</td><td>18263-012</td><td></td></tr><tr><td>pFUSEss-CHIg-hG1 (4.493 pb)</td><td>Invivogen</td><td>pfusess-hchg1</td><td></td></tr><tr><td>pFUSEss-CHIg-hG4 (4.484 pb)&nbsp;</td><td>Invivogen</td><td>pfusess-hchg4</td><td></td></tr><tr><td>pFUSE2ss-CLIg-hk (3.875 pb)</td><td>Invivogen</td><td>pfuse2ss-hclk</td><td></td></tr><tr><td>pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3.883 pb)&nbsp;</td>Medio SOC <td>Invivogen</td><td>pfuse2ss-hcll2</td><td></td></tr><tr>Medio<td>de</td> agar <td>Invitrogen</td><td>15544-034</td><td></td></tr><tr><td>LB suplementado con zeocina (Fast-Media Zeo Agar)</td>Medio líquido a base de <td>invivogen</td><td>fas-zn-s</td><td></td></tr><tr><td>Terrific Broth (TB) suplementado con zeocina (Fast-Media Zeo TB)</td><td>Invivogen</td><td>fas-zn-l</td><td></td></tr><tr><td>DNA Miniprep kit&nbsp;</td><td>Omega Bio Technology</td><td>D6942-02</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop (espectrofotómetro ND1000)</td><td>Medio</td> de agar basado en Nanodrop <td></td><td></td></tr><tr><td>LB suplementado con Blasticidina (Fast-Media Blast Agar)</td>Medio líquido a base de <td>Invivogen</td><td>fas-bl-s</td><td></td></tr><tr><td>Terrific Broth (TB) suplementado con Blasticidin (Fast-Media Blast TB)</td><td>Invivogen</td><td>fas-bl-l</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td>20.000 U/ml, en 10x NEBuffer EcoRI</td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0131S</td><td>10.000 U/ml, en 10x NEBuffer 2.1</td></tr><tr><td>2-Log DNA ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N3200S</td><td>0.1-10.0 kb, 1,000 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>XmaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0180S</td><td>10,000 U/ml, en 10x CutSmart Buffer&nbsp;</td></tr><tr><td>BsiWI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0553S</td><td>10,000 U/ml, en 10x NEBuffer 3.1</td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0174S</td><td>5,000 U/ml, en 10x CutSmart Buffer&nbsp;</td></tr><tr><td>FastAP Fosfatasa alcalina termosensible</td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td><td>1 U/&micro; l, en 10x FastAP Buffer</td></tr><tr><td>DH5&alpha; células competentes&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18263-012</td><td></td></tr><tr><td>Ratón PE Anti-Humano IgG BD</td><td>Pharmingen</td><td>555787</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Clon: HIB22</td><td>Fisher scientific</td><td>BDB563942</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1</td><td>Applied Biosystems</td><td>4337455</td><td></td></tr></tbody></table>

generación de recombinante humano igg anticuerpos monoclonales a partir de células inmortalizadas b ordenada

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Encontrar nuevos métodos para generar anticuerpos monoclonales humanos es un campo de investigación activo que es importante tanto para las ciencias básicas como para las aplicadas, incluido el desarrollo de inmunoterapias. Sin embargo, las técnicas para identificar y producir dichos anticuerpos tienden a ser arduas y, a veces, el par de cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos están disociados. Aquí, describimos un protocolo relativamente simple y directo para producir anticuerpos monoclonales recombinantes humanos a partir de células mononucleares de sangre periférica humana utilizando la inmortalización con el virus de Epstein-Barr (VEB) y la activación del receptor tipo Toll 9. Con una tinción adecuada, las células B productoras de anticuerpos pueden aislarse para su posterior inmortalización y expansión clonal. Las transcripciones de anticuerpos producidas por los clones de células B inmortalizadas pueden amplificarse mediante PCR, secuenciarse como pares de cadenas pesadas y ligeras correspondientes y clonarse en vectores de expresión de inmunoglobulinas. Los anticuerpos obtenidos con esta técnica pueden ser herramientas poderosas para estudiar las respuestas inmunitarias humanas relevantes, incluida la autoinmunidad, y crear la base para nuevas terapias.

El gating de clasificación después de la tinción de células positivas CD22 e IgG se muestra en la Figura 1 En esta imagen el área de las células dobles positivas -. Se selecciona para ordenar todas estas células en un tubo separado - células B que producen anticuerpos IgG. En el análisis, aproximadamente el 1% de los PBMCs totales corresponde a esta población doble positiva. El número de células clasificadas obtenidos dependerá del número de células obtenidas en la sección 1. <p class="jove_content"...

La síntesis de anticuerpos monoclonales humanos es el primer paso en estudios destinados a desentrañar los mecanismos fisiopatológicos de las respuestas inmunitarias mediadas por autoanticuerpos. Hemos desarrollado un protocolo para generar anticuerpos monoclonales de inmunoglobulina G (IgG) humana recombinante a partir de células B clasificadas por sangre, incluido el aislamiento de células B, la clonación de anticuerpos y la síntesis in vitro.

Generación de recombinante humano IgG anticuerpos monoclonales a partir de células inmortalizadas B Ordenada

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

El objetivo general de este procedimiento es clonar y expresar anticuerpos producidos por células B. Esto se logra primero aislado células B a partir de un tejido fuente relevante como la sangre o el timo. El segundo paso consiste en realizar análisis y seleccionar la población de células B positiva para la producción de IgG.A continuación, las células se inmortalizan mediante infección con el virus de Epstein-Barr junto con la activación del receptor tipo Toll 9 por el ODN-C-G-P 2006 y se mantienen en cultivo. Los pasos finales consisten en aislar ARN de los clones que resulten positivos en la producción de IgG mediante ELISA y generar ADN copia de ambas cadenas ligeras y pesadas de la IgG. Finalmente, las secuencias de IgG pueden clonarse en vectores de expresión mamíferos para producir grandes cantidades de IgG humana monoclonal.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la tecnología de presentación en fagos es que no se pierde la asociación original de las cadenas pesada y ligera de IgG. Este método puede responder preguntas clave en el campo de la autoinmunidad, como el descubrimiento y la caracterización funcional de autoanticuerpos patógenos. No o

generation-recombinant-human-igg-monoclonal-antibodies-from

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un alto rendimiento, la plataforma automatizada de desarrollo de la fabricación línea celular para la producción de proteínas terapéuticas se describe. Implementación de BD clasificador de células FACS Aria, CloneSelect Imager y Libertad TECAN EVO sistema de manejo de líquidos se ha demostrado la capacidad de procesamiento aumentó significativamente en el desarrollo de líneas celulares con mejor calidad de línea celular y una alta reproducibilidad.

Una plataforma automatizada de alto rendimiento para el desarrollo de líneas celulares de fabricación de proteínas terapéuticas

Este video muestra un método de generación de anticuerpos a partir de células de mamíferos mediante la introducción de vectores plásmidos con genes de cadena pesada y ligera. Estos vectores interactúan con la polietilenimina y entran en las células formando poliplexos; Más tarde, se traducen en proteínas individuales y se ensamblan en anticuerpos completos, que se secretan en el medio extracelular.

Generación de anticuerpos monoclonales recombinantes a partir de cultivos de células de mamíferos

El video muestra una técnica para generar anticuerpos monoclonales a partir de células B específicas de antígeno. Los vectores de expresión eucariotas que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos, clonados a partir de células B aisladas específicas de antígeno, se introducen en células de mamíferos utilizando poliplexos. Una vez dentro de las células, estos vectores se traducen y los péptidos de cadena pesada y ligera resultantes se ensamblan en anticuerpos, que posteriormente son...

Una técnica para generar anticuerpos monoclonales a partir de células B específicas de antígeno

Se presenta un protocolo optimizado para la generación de anticuerpos monoclonales basado en la tecnología de hibridomas. Los ratones fueron inmunizados con un inmunoconjugado. Las células del bazo se fusionaron mediante PEG y un impulso eléctrico con células de mieloma inmortal. Las células de hibridoma productoras de anticuerpos se seleccionaron mediante HAT y ELISA específico de antígeno.

Generación de anticuerpos monoclonales murino por el hibridoma Tecnología

Se describe un método para la producción de anticuerpos humanos específicos para un antígeno de interés, a partir de células B circulantes en la sangre humana. Generación de estos anticuerpos naturales es eficiente y rápido, y los anticuerpos obtenidos pueden discriminar entre antígenos muy similares.

Generación de anticuerpos monoclonales humanos discriminativo de células B antígeno específicas raras circulan en sangre

El método BSelex para identificar y recuperar anticuerpos específicos de antígenos individuales de células mononucleares de sangre periférica humana combina citometría de flujo con PCR de una sola célula y clonación.

Método de cribado de una sola célula para la selección y recuperación de anticuerpos con especificidades deseadas de poblaciones de células B de memoria humana enriquecidas

Describimos aquí un análisis simple de la heterogeneidad del compartimento de células B inmunes murinas en el peritoneo, el bazo y los tejidos de la médula ósea por citometría de flujo. El protocolo se puede adaptar y extender a otros tejidos de ratón.

Caracterización citométrica de flujo del desarrollo de células B murinas

Rescate de virus de gripe A a partir del ADN plásmido es una técnica experimental básica y esencial que permite a los investigadores de la gripe para generar virus recombinantes para estudiar múltiples aspectos de la biología de los virus de la influenza, y para ser utilizado como vectores potenciales o vacunas.

Generación de recombinantes del virus de influenza a partir del ADN plásmido

Un sistema eficiente de la estructura y análisis de la función de un gen en...

Recombinante de producción retrovirales y la infección de células B

Ratones C57BL / 6 se han utilizado para estudiar la patogénesis Hc y el mejor modelo. Estamos explorando los beneficios potenciales de la inmunidad humoral contra este hongo y generó varias Acm [de la histona H2B y 60kDa proteína de choque térmico] que la prueba de su eficacia protectora tras la administración intraperitoneal.

Administración pasiva de anticuerpos monoclonales contra H. capsulatum Y otros hongos patógenos

Aprende a generar anticuerpos monoclonales humanos IgG recombinantes a partir de células B inmortalizadas mediante virus Epstein-Barr. Este protocolo permite producir altas cantidades de anticuerpos para investigar respuestas inmunes.

Generación de recombinante humano IgG anticuerpos monoclonales a partir de células inmortalizadas B Ordenada

Explorar más videos