Generación de recombinante humano IgG anticuerpos monoclonales a partir de células inmortalizadas B Ordenada

El objetivo general de este procedimiento es clonar y expresar anticuerpos producidos por células B. Esto se logra primero aislado células B a partir de un tejido fuente relevante como la sangre o el timo. El segundo paso consiste en realizar análisis y seleccionar la población de células B positiva para la producción de IgG.

A continuación, las células se inmortalizan mediante infección con el virus de Epstein-Barr junto con la activación del receptor tipo Toll 9 por el ODN-C-G-P 2006 y se mantienen en cultivo. Los pasos finales consisten en aislar ARN de los clones que resulten positivos en la producción de IgG mediante ELISA y generar ADN copia de ambas cadenas ligeras y pesadas de la IgG. Finalmente, las secuencias de IgG pueden clonarse en vectores de expresión mamíferos para producir grandes cantidades de IgG humana monoclonal.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la tecnología de presentación en fagos es que no se pierde la asociación original de las cadenas pesada y ligera de IgG. Este método puede responder preguntas clave en el campo de la autoinmunidad, como el descubrimiento y la caracterización funcional de autoanticuerpos patógenos. No olvide que trabajar con material de pacientes y el virus EBV puede ser riesgoso.

El virus EB es un patógeno humano y siempre se deben tomar precauciones como el VSL dos PROEs y usar protección adecuada al realizar estos pasos. Antes de teñir los PBMC, siémbrelos en un matraz de 25 centímetros con seis mililitros de medio RPMI 1640 completo y déjelos recuperar durante la noche. Después de bloquear y lavar las células, recupere los PBMC en un tubo con medio medio mililitro de medio y centrifúguelos. Luego, resuspenda las células en tampón de etiquetado y cuéntelas.

A continuación, prepare dos tubos FACS con 5 millones de células en 200 microlitros de tampón. Añada 10 microlitros de anti-CD22 PE-Cy5 o 40 microlitros de anti-IgG PE y deje incubar durante 30 minutos sobre hielo y en la oscuridad. Luego, lave, filtre y ordene las células. El objetivo es contar las células doblemente positivas.

Comience diluyendo las CMBP ordenadas a una célula por microlitro en medio RPMI 1640 completo, con la adición de CPG 2006 y VEB. Luego, en una cabina de flujo laminar, siembre 110 microlitros de la dilución celular con VEB y CPG 2006 en dos pocillos de una placa de fondo redondo de 96 pocillos previamente sembrada con células WI-38 irradiadas. La infección con 50 células por pocillo está optimizada y aumenta la probabilidad de obtener un anticuerpo monoclonal.

Sin embargo, recomendamos confirmar esto mediante una PCR. Después de una semana de incubación, inspeccione las células bajo el microscopio para observar el crecimiento de linfocitos B. Después de dos semanas, cambie el medio aspirando lentamente 90 microlitros de medio de cada pocillo y transfiéralo a una nueva placa.

Para comprobar la producción de IgG mediante ELISA. Luego, añada de nuevo 100 microlitros de medio suplementado fresco, incluyendo IL-2, a cada pozo. Continúe monitoreando el crecimiento de los clones durante su tercera y cuarta semana de crecimiento.

Repita el cambio de medio cada semana. Consulte el protocolo escrito para los métodos de expansión clonal. Revise el sobrenadante obtenido de los cambios de medio para la producción de IgG mediante un ensayo inmunoenzimático tipo ELISA o ELISA.

Primero, prepare las placas ELIZA para dispensar en cada pocillo 50 microlitros de anticuerpos de cabra anti-Fc humano, diluidos uno a 200 en tampón de revestimiento. Después de incubar y lavar la placa, bloquee los pocillos con 100 microlitros de tampón bloqueante por pocillo e incube la placa nuevamente. Tras la incubación de bloqueo, retire el líquido de la placa sobre una toalla de papel.

Con la placa preparada, diluya los sobrenadantes con cuatro volúmenes de RPMI. Luego, para los controles estándar, realice una dilución seriada de la solución de IgG humana en RPMI desde 1000 nanogramos por mililitro hasta 15,6 nanogramos por mililitro.

Asimismo, incluya un blanco. Aplique 50 microlitros del sobrenadante o estándar a cada pocillo e incube la placa ELISA durante una hora a 37 grados Celsius de la misma manera; se pueden preparar placas ELISA adicionales para analizar diluciones adicionales de los sobrenadantes y evaluar la afinidad del anticuerpo. Después de la incubación, lave la placa.

Luego, aplicar 50 microlitros de tampón de incubación con el fragmento Fab2 conjugado a peroxidasa a cada pocillo. Tras otra hora de incubación y otro lavado, añadir 100 microlitros de solución de sustrato con TMB a cada pocillo. A continuación, incubar la placa hasta 10 minutos, hasta que el color azul que aparece se estabilice.

Luego detenga la reacción y mida la absorción. Cualquier sobrenadante de clones con absorbancia medida superior a tres desviaciones estándar respecto al blanco es positivo.

Para anticuerpos IgG humanos, la especificidad antigénica puede detectarse mediante ensayos adicionales. Para comenzar, siga el protocolo escrito para sintetizar ADN copia a partir de los clones positivos. Luego, prepare las PCR para las cadenas pesadas kappa y lambda de IgG.

En los resultados, localice la cadena pesada entre 400 y 550 pares de bases. Localice la cadena ligera entre 300 y 400 pares de bases. Si no están presentes, utilice un microlitro de los productos como molde para otra PCR.

Los nuevos productos deben estar dentro del rango adecuado. A continuación, proceda con la clonación de los mejores productos. Primero, secuencie dichos productos. Sus electroferogramas deben ser limpios y corresponder a una única secuencia de inmunoglobulina.

Después del protocolo escrito. Clone el producto de PCR purificado en un microgramo de ADN plasmídico. Asegúrese de ligar durante toda la noche a 16 grados Celsius.

Utilizando la ligasa de ADN T4, prepare la célula HX en DMEM suplementado y crezca hasta una confluencia del 75 % en frascos de cultivo de 75 centímetros cuadrados. Para cada transfección de cadena pesada y ligera, prepare una mezcla con 1,75 mililitros de DMEM sin suero que incluya 4,5 microgramos del vector de cadena pesada, 3 microgramos del vector de cadena ligera y 50 microlitros de solución de polietileno. Añada suavemente esta mezcla a una placa de células HX y agite la solución sobre la placa.

Incube la placa durante la noche y luego comience a recolectar los medios de cultivo cada día, reemplazándolos por medio sin suero. El medio contiene los anticuerpos y se puede recolectar diariamente durante cuatro días después de que las pBMC positivas para CD22 e IgG fueron ordenadas por citometría de flujo.

El área de las células doblemente positivas, células B productoras de anticuerpos IgG, se recolectó por separado para su expansión. Aproximadamente el 1% de los pbmc pertenecía a esta población doblemente positiva. Después de cinco semanas de inmortalización por EBV y estimulación con CPG 2006, se aislaron clones inmortalizados.

Las células alimentadoras WI 30 tienen una forma fibroblástica más alargada, y los clones de células B aparecen como células redondas muy pequeñas que crecen agrupadas en el centro de la placa multi-pocillo de fondo redondo. El sobrenadante de los clones en crecimiento se analizó mediante un ELIZA para IgG. Un clone positivo se evaluó en una con un eli, un valor tres desviaciones estándar por encima del valor del blanco.

Al menos tres sobrenadantes de un clon positivo dieron positivo en el ELISA. Los anticuerpos de un clon positivo se secuenciaron tras clonar las regiones variables y constantes de la cadena pesada y de la cadena lambda del par de cadenas pesada y ligera, que pudieron caracterizarse. Tras seguir este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos como la secuenciación para responder preguntas adicionales como el uso de anticuerpos, genes, diversidad genética, etc. Tras este desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la autoinmunidad exploraran enfermedades, patologías y estrategias terapéuticas relevantes para enfermedades autoinmunes como la miastenia grave. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico y tratamiento de enfermedades como la miastenia grave, ya que el descubrimiento de anticuerpos patógenos puede conducir al desarrollo de nuevos tratamientos, tales como anticuerpos competidores que carecen de actividad inflamatoria.