La encapsulación de alginato de células madre pluripotentes utilizando una boquilla-Co axial

El objetivo general de este procedimiento es incrustar células madre en cápsulas de alginato e hidrogel de forma segura y eficaz, y cultivarlas dentro de las cápsulas para controlar la agregación y el microambiente, esto se logra mezclando primero una suspensión de células madre filtradas y una solución de alginato de sodio. A continuación, la mezcla se transfiere a una jeringa y se instala una boquilla coaxial en la jeringa antes de colocarla en una bomba de jeringa. A continuación, las gotas se preparan expulsando la suspensión celular con gas nitrógeno que fluye conjuntamente, seguido de la recolección y la solución de cloruro de calcio.

A continuación, las cápsulas se tratan con poli L lisina para evitar la fuga celular y EDTA para fluidificar las cápsulas internas antes de cultivar las células encapsuladas en una condición de agitación rotatoria. Finalmente, las células se recogen de las cápsulas mediante EDTA y destrucción física de la membrana. En última instancia, la encapsulación de alginato de células madre pluripotentes evita que las células se agreguen excesivamente y limita el estrés absoluto que experimentan las células en cultivo en suspensión.

Este método puede ayudar a responder a las preguntas clave en el campo biológico y biomédico, como la gran expansión del trasplante de células y la investigación sobre el nicho de las células madre. Comience la encapsulación celular recolectando las células como se describe en el protocolo de texto después de la centrifugación a 160 veces G durante tres minutos. Lavar el pellet de células madre pluripotentes inducidas o IPS de Resus, suspendiendo en montones de solución salina tamponada y centrifugar tres veces después de resus, suspendiendo las células y montones de solución salina tamponada.

Filtre la suspensión celular a través de un colador celular de 40 micras para eliminar agregados grandes, que de otro modo podrían obstruir la boquilla. A continuación, mezcle dos mililitros de suspensión celular filtrada y tres mililitros de solución de alginato de sodio al 5%. Para obtener una suspensión celular de cinco mililitros en alginato de sodio al 3%, la densidad celular es DIR, más de 1 millón de células por mililitro.

Después de recoger la suspensión de la célula en una jeringa de cinco mililitros, instale una boquilla coaxial en la jeringa y colóquelas en una bomba de jeringa para emitir flujo de gas nitrógeno a través de la aguja exterior de la boquilla coaxial y expulsar la suspensión de la célula a través de la boquilla interior. Recoja las gotas en 250 mililitros de solución de cloruro de calcio al 0,5% y espere de 10 a 20 minutos para la dación mientras revuelve a 60 a 90 RPM. Después de lavar con montones de solución salina tamponada, las cápsulas recogidas se utilizan como cápsulas desnudas para tratar las cápsulas de incubación de cápsulas de alginato de calcio en 0,05% de peso por volumen.

Solución de poli L lisina durante cinco minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono con agitación. Después de recoger las cápsulas en un tubo y lavarlas con montones de solución salina tamponada, incubarlas en DMEM que contenga un 10% de FBS. Con el fin de neutralizar la carga eléctrica en su superficie, utilice las cápsulas resultantes como cápsulas recubiertas para generar cápsulas huecas.

Incubar las cápsulas en montones de solución salina tamponada que contenga 10 milimolares de EDTA durante cinco minutos. Las cápsulas tratadas con EDTA se utilizan como cápsulas huecas. Incubar las células encapsuladas a 75 RPM con agitación a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 10 días después de la incubación, recoger e incubar las cápsulas en 10 milimolares de EDTA a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 10 minutos.

Recoja las células de las cápsulas de alginato sin tratamiento con poli l licina por centrifugación a 1000 veces G durante tres minutos. Si las cápsulas de alginato se tratan con poli L lisina, rompa la membrana del alginato poli L lisina pipeteando hacia arriba y hacia abajo unas 10 veces con una aguja conectada a una jeringa. El diámetro de la aguja debe ser menor que el tamaño de la cápsula, y en este experimento se utilizan agujas de calibre 25.

Después de la centrifugación a 1000 a 5.000 veces G durante cinco minutos, recoja la pastilla celular estrictamente de las membranas de poli L licina de alginato rotas Si se recolectan muestras de ARNm de las células, tenga en cuenta que las membranas restantes de alginato poli L licina pueden impedir la purificación del ARNm según lo visualizado por una cámara de alta velocidad. La solución de alginato expulsada forma una forma esférica inmediatamente después de la expulsión. Si la suspensión se expulsa con un caudal de nitrógeno inferior a un litro por minuto, el tamaño de las gotas es uniforme.

Sin embargo, si el flujo de nitrógeno es superior a un litro por minuto, la gota se descompone y el tamaño de las gotas se vuelve heterogéneo. Teniendo en cuenta esto, es difícil preparar gotas de menos de 500 micras con este método. En el proceso de gelificación, las gotas de alginato de sodio forman cápsulas de alginato de calcio de forma esférica en una solución de cloruro de calcio.

Sin embargo, si la concentración de alginato de sodio es lo suficientemente alta, la baja concentración de alginato de sodio provoca cápsulas nons, esféricas y nonoo, que tienen un problema en el proceso de codificación. Incluso si la concentración de alginato de sodio no es suficiente, se pueden formar cápsulas esféricas aumentando la concentración de calcio. Sin embargo, alrededor de 50 milimolares de cloruro de calcio es apropiado para la encapsulación porque una concentración demasiado alta de cloruro de calcio disminuye el crecimiento celular y la viabilidad.

Las células encapsuladas pueden crecer en las cápsulas, pero las fugas celulares pueden ocurrir en las cápsulas sin el recubrimiento de alginato poli L lisina. En el caso de las células IPS de ratón, las células forman agregados en forma de disco en cada cápsula de alginato de calcio, mientras que las células se agrupan y forman agregados esféricos individuales en cada cápsula hueca. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo encapsular y cultivar células en control de tamaño.

El hidrógeno se captura sin ningún equipo especial, sin absorbente orgánico.