Análisis y calcio monocanal Imaging en los podocitos de los glomérulos recién aisladas

El objetivo general de este procedimiento es medir los cambios en la concentración intracelular de calcio en respuesta a agentes farmacológicos. Estimar los niveles basales de calcio y evaluar la actividad individual de los canales en los podocitos como parte del glomérulo frescamente aislado completo. Esto se logra primero eliminando la sangre de los riñones de rata mediante lavado a través de la aorta abdominal.

A continuación, se extraen los riñones y se aísla la corteza renal, que se pica con una hoja de bisturí. En el tercer paso, se aíslan los glomérulos corticales mediante centrifugación diferencial. Posteriormente, los glomérulos aislados y desprovistos de cápsula pueden someterse bien a experimentos electrofisiológicos, bien a carga con colorantes fluorescentes y medición confocal de la concentración de calcio.

En última instancia, estos procedimientos permiten a los investigadores resolver cambios agudos en la regulación intracelular del calcio en respuesta a la aplicación de diversos agentes y evaluar y manipular la conductancia de calcio a nivel de canales iónicos individuales. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que nos permite estudiar los podocitos como parte del glomérulo aislado completo. Nuestra preparación mantiene el potencial funcional de los podocitos.

Permanecen adheridos a los capilares y participan en la homeostasis del entorno que realmente puede conservar las partes principales del aparato de filtración glomerular. La implicación de esta técnica amplía nuestro cribado farmacológico. En estados normales y patológicos, el mecanismo de manejo del calcio por los podocitos desempeña un papel regulador esencial en el desarrollo y la prevención de complicaciones renales en enfermedades como la nefropatía diabética, la esclerosis segmentaria focal o la hipertensión. Es de gran importancia observar la respuesta del ingreso de calcio en estas células frente a fármacos, lo cual puede evaluarse fácilmente mediante cribado.

En esta preparación, VLA Hunka demostrará cómo perfundir el riñón para los siguientes procedimientos. Mostraré el aislamiento de glomérulos y la electrofisiología con pinza en V, y el Dr. GaN lo guiará a través de la imagen de calcio por microscopía confocal. Para comenzar este procedimiento, coloque una rata anestesiada sobre la mesa quirúrgica con control de temperatura. Bajo el microscopio, realice una incisión media en el abdomen para exponer la vena CVA y la aorta.

A continuación, coloque la ligadura alrededor de las arterias celíaca y mesentérica superior y de la aorta abdominal por encima de ellas. Diseque por separación la aorta abdominal por debajo de las arterias renales. Luego coloque dos ligaduras alrededor de esta, pero no realice la ligadura.

Sujete la aorta por encima de las ligaduras y ate el hilo inferior. A continuación, canule la aorta con un tubo de polietileno conectado a una bomba de jeringa llena con PBS por debajo del sujetador y fije el catéter con una segunda ligadura. Luego, retire el sujetador y ligue las extremidades.

Me arterias mesentérica y celíaca. Infunda la aorta con PBS previamente enfriado durante tres minutos a una velocidad de seis mililitros por minuto. Al mismo tiempo, realice una incisión en la vena cava cerca de las venas renales para aliviar la presión.

Después de tres minutos, detenga la perfusión, extirpe y encapsule los riñones. Colóquelos en solución de PBS sobre hielo. Ahora prepare 30 mililitros de BSA al 5% fresca en medio RPMI 1640.

Utilizando una hoja de afeitar y tijeras, aísle la corteza de ambos riñones y luego tritúrelos hasta obtener una mezcla homogénea. A continuación, pase el tejido picado a través de un tamiz de acero inoxidable de 100 mallas que haya sido previamente remojado en solución de 5%P-S-A-R-P-M-I. Recopile el filtrado y permita que pase a través de un tamiz de 140 mallas.

Posteriormente, filtre el flujo recolectado procedente del tamiz de 140 mallas utilizando un tamiz de 200 mallas previamente humedecido. Deseche el filtrado y lave el tamiz superior con 10 a 15 mililitros de la solución preparada de B-S-A-R-P-M-I, recolectando los glomérulos de la parte superior del tamiz. A continuación, coloque la solución de B-S-A-R-P-M-I que contiene los glomérulos G en un tubo de 15 mililitros sobre hielo y deje que los glomérulos sedimenten en el fondo del tubo durante hasta 20 minutos.

En este procedimiento, recubra fragmentos de vidrio cubreobjetos de cinco por cinco milímetros con polilisina de peso molecular entre 70.000 y 150.000 y séquelos en una placa calefactora. A continuación, caliente las soluciones experimentales hasta temperatura ambiente y llene la cámara de registro y la pipeta. Mezcle suavemente la solución que contiene los glomérulos. Luego, aplique aproximadamente 50 microlitros de esta solución a cada fragmento de vidrio cubreobjetos recubierto con polilisina.

Después de eso, transfiera las láminas de vidrio con glomérulos a la cámara del registro de potenciales. Precargue con la solución Beth. Perfunda la cámara a una velocidad de tres mililitros por minuto durante un minuto para eliminar cualquier glomérulo no adherido antes de realizar el registro convencional de potenciales mediante la técnica del parche en modo célula adherida.

Ahora coloque 500 microlitros de la fracción de glomérulos en cada tubo cónico de 0,5 mililitros y agregue los colorantes de calcio Pure Red AM y Fluo-4 AM. A continuación, coloque los tubos en un agitador rotatorio durante hasta una hora a temperatura ambiente. Luego prepare las laminillas de vidrio con polilisina y déjelas secar en la placa calefactora a 70 grados Celsius. Una vez completada la carga de los colorantes de calcio, aplique 100 microlitros de la solución que contiene glomérulos sobre las laminillas recubiertas con polilisina y déjelos adherirse a la superficie durante unos cinco minutos.

Luego, monte los corchetes con glomérulos adheridos sobre una cámara de imagen y perfúndalos con solución de baño a un ritmo de tres mililitros por minuto para eliminar los glomérulos no adheridos y los colorantes residuales. Posteriormente, configure el microscopio confocal de barrido láser en una longitud de onda de excitación de 488 nanómetros. A continuación, ajuste el software de imagen a la frecuencia y resolución deseadas.

A continuación, localice los glomérulos en campo claro. Posteriormente, active la detección de la señal de fluorescencia. Después, seleccione un plano focal deseado y verifique la intensidad de la fluorescencia en los canales flu oh cuatro y firo rojo.

Asegúrese de que el glomérulo sea claramente visible en campo claro. Luego registre los cambios en la intensidad de fluorescencia para las señales flu oh cuatro y rojo furor. Para importar la secuencia de imágenes, separe los canales y utilice el modo de escala de grises de hiperpila.

En el software Image J, abra una ventana del administrador de ROI siguiendo la ruta de herramientas de análisis, Administrador de ROI. Seleccione una o más regiones de interés utilizando la herramienta de selección ovalada y la función agregar T en el administrador de ROI. Luego, seleccione el área del fondo y guarde las ROI seleccionadas.

A continuación, marque una fila por cuadro de corte en el cuadro de diálogo y haga clic en aceptar en las opciones del menú. Establezca las mediciones. Seleccione el valor medio de gris y calcule los valores de intensidad de píxel para cada ROI, los cuales se mostrarán en la ventana de resultados en columnas separadas.

Para cada ROI, copie los valores de intensidad medidos del ROI para cada canal en el software de análisis de datos preferido y reste los valores de intensidad de fondo de cada punto de datos para cada punto temporal. Calcule la relación de las intensidades del canal flu oh cuatro respecto al canal URA rojo; posteriormente, represente gráficamente los cambios en el tiempo del transitorio de calcio para cada ROI. Esta imagen muestra la pipeta del parche unida al cuerpo oxídico en la superficie del glomérulo de rata.

Durante un registro electrofisiológico, se puede observar una parte del glomérulo encapsulado en la esquina inferior derecha de la imagen. A continuación se muestra un trazado de corriente representativo de la actividad de canales tipo tripy, obtenido mediante un parche en configuración de celda adherida realizada sobre el podocito para medir la concentración intracelular de calcio. Los glomérulos se cargan con fluo 4 AM para etiquetar el calcio intracelular.

Este video ilustra los efectos de la CIN y el cloruro de manganeso sobre la entrada de calcio en los glomérulos. Esta gráfica cuantifica los cambios en la intensidad de la señal de fluoh cuatro registrada desde un podocito individual en respuesta a la CIN y al cloruro de manganeso. Como era de esperar, la CIN produce el máximo de fluorescencia, y el cloruro de manganeso apaga el colorante y da como resultado la intensidad de fluorescencia más baja.

La aplicación de estos fármacos permite al investigador definir posteriormente la concentración exacta de calcio dentro de la célula. Este video demuestra el efecto de 10 micromoles de TP sobre la concentración de calcio en los glomérulos. Observe que hay un aumento en la fluorescencia verde de flu O cuatro y una disminución en la fluorescencia roja de fu rojo, lo que indica un incremento en la concentración intracelular de calcio.

Esta técnica ofrece una oportunidad única para monitorear los cambios en la entrada de calcio a nivel de canales iónicos individuales y de células aisladas tras tratamientos farmacológicos u otras manipulaciones. Por lo tanto, este enfoque representa una herramienta muy potente, especialmente considerando los múltiples modelos de roedores genéticamente modificados disponibles. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar mediciones de la actividad de calcio en los podocitos, así como de los experimentos electrofisiológicos de bloqueo, que se utilizan conjuntamente o por separado.

Estas técnicas proporcionan una visión profunda y mecanicista sobre la regulación del manejo del calcio en los podocitos en condiciones normales y patológicas.