Análisis y calcio monocanal Imaging en los podocitos de los glomérulos recién aisladas

El objetivo general de este procedimiento es medir los cambios en la concentración de calcio intracelular en respuesta a agentes farmacológicos. Estimar los niveles basales de calcio y evaluar la actividad de los canales individuales en los podocitos como parte de todo el glomérulo recién aislado. Esto se logra primero eliminando la sangre de los riñones de rata a través de la aorta abdominal.

A continuación, se extraen los riñones y se aísla la corteza renal y se pica con una cuchilla de afeitar. En el tercer paso, los glomérulos corticales se aíslan mediante cing diferencial. Posteriormente, los glomérulos decapitados aislados pueden someterse a experimentos electrofisiológicos o cargarse con tintes fluorescentes y tomarse para mediciones confocales de la concentración de calcio.

En última instancia, estos procedimientos permiten a los investigadores resolver cambios agudos en el manejo del calcio intracelular en respuesta a aplicaciones de diversos agentes y evaluar y manipular la conductancia del calcio a nivel de canales iónicos individuales. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que permite estudiar los podocitos como parte de todo el glomérulo aislado. Nuestra preparación conserva el potencial funcional de los podocitos.

Permanecen unidos a los capilares y participan en la homeostasis en el medio ambiente que realmente puede conservar las partes principales del aparato de filtración de los glomérulos. En estados normales y patológicos, el mecanismo de manejo del calcio por parte de los podocitos cumple un papel regulador esencial en el desarrollo y prevención de complicaciones renales en enfermedades como la nefropatía diabética, la esclerosis omero del segmento focal o la hipertensión. Es de gran importancia observar la capacidad de respuesta de la afluencia de calcio en estas células a los fármacos, que se pueden detectar fácilmente.

En esta preparación, VLA Hunka demostrará cómo lavar el riñón para los siguientes procedimientos. Mostraré el aislamiento de glomérulos y la electrofisiología de la pinza en V, y el Dr. GaN lo guiará a través de imágenes de calcio confocal. Para comenzar este procedimiento, coloque una rata anestesiada en la mesa quirúrgica con temperatura controlada bajo el microscopio, haga una incisión en la línea media del abdomen para descubrir la vena y la aorta.

A continuación, inserte la ligadura alrededor de las arterias celíaca y mesentérica superior y la aorta abdominal por encima de ellas. Rome, disecciona la aorta abdominal por debajo de las arterias renales. Luego coloque dos ligaduras a su alrededor, pero no lige.

Sujeta la aorta por encima de las ligaduras y ata el hilo inferior. Después de eso, cateterice la aorta con un tubo de polietileno que está conectado a una bomba de jeringa llena de PBS debajo de la pinza y fije el catéter con una segunda ligadura. A continuación, retire la pinza y átelos.

Me arterias entéricas y celíacas. Infundir la aorta con PBS preenfriado durante tres minutos a una velocidad de seis mililitros por minuto. Al mismo tiempo, haga una incisión en la vena del cava cerca de las venas renales para aliviar la presión.

A los tres minutos, detener la perfusión, extirpar y encapsular los riñones. Colóquelos en una solución de PBS sobre hielo. Ahora prepare 30 mililitros de 5%BSA fresco en RPMI 1640 medio.

Con una hoja de afeitar y unas tijeras, aísle la corteza de ambos riñones y luego métalos hasta que estén homogéneos. A continuación, empuje el pañuelo picado a través de un tamiz de acero inoxidable de malla 100 que ha sido previamente empapado en una solución de 5% P-S-A-R-P-M-I. Recoja el flujo y déjelo pasar a través de un siv de malla 140.

A continuación, filtre el flujo recogido a través del tamiz de malla 140 utilizando un siv de malla 200 previamente empapado. Deseche el filtrado y lave el tamiz superior con 10 a 15 mililitros de la solución B-S-A-R-P-M-I preparada y recoja los glomérulos de la parte superior del tamiz. A continuación, coloque la solución B-S-A-R-P-M-I que contiene G Glomeruli en 15 mililitros, dos bon ice y deje que los glomérulos se sedimenten en el fondo del tubo durante un máximo de 20 minutos.

En este procedimiento, recubra virutas de vidrio de cinco por cinco milímetros con polilisina de peso molecular, 70.000 a 150.000 y séquelas en una placa caliente. A continuación, caliente las soluciones experimentales a temperatura ambiente y llene la cámara de pinza de parche y la pipeta. Mezcle suavemente la solución que contiene glomérulos. A continuación, aplique aproximadamente 50 microlitros a cada viruta de cubreobjetos recubierta de polilisina.

Después de eso, mueva las virutas de vidrio con glomérulos a la cámara de la abrazadera del parche. Precargado con la solución Beth. Perfundir la cámara a una velocidad de tres mililitros por minuto durante un minuto para eliminar cualquier glomérulo suelto antes de realizar el registro convencional de la pinza de parche en un modo de celda adjunta.

Ahora coloque 500 microlitros de la fracción de glomérulos en cada tubo cónico de 0.5 mililitros y agregue colorantes de calcio rojo puro am y gripe a las 4:00 AM. A continuación, coloque los tubos en un agitador giratorio durante un máximo de una hora a temperatura ambiente. A continuación, prepare los cubreobjetos de vidrio con polilisina y déjelos secar en la placa calentada a 70 grados centígrados. Una vez completada la carga de los troqueles de calcio, aplique 100 microlitros de la solución que contiene glomérulos a los cubreobjetos recubiertos de polilisina y deje que se adhieran a la superficie durante unos cinco minutos.

A continuación, monte los deslizamientos de cubierta adjuntos a los glomérulos en una cámara de imágenes y perfundícelos con una solución de baño a una velocidad de tres mililitros por minuto para eliminar los glomérulos sueltos y los tintes restantes. A continuación, ajuste el microscopio de barrido láser confocal a una longitud de onda de excitación de 488 nanómetros. A continuación, configure el software de imagen a la frecuencia y resolución deseadas.

A continuación, encuentra los glomérulos en campo claro. A continuación, active la detección de la señal de fluorescencia. Después de eso, seleccione el plano focal deseado y verifique la intensidad de la fluorescencia en los canales de gripe oh cuatro y rojo fino.

Asegúrese de que el glomérulo se vea claramente en campo claro. A continuación, registre los cambios en la intensidad de la fluorescencia de las señales de gripe y rojo furor. Para importar la secuencia de imágenes, divida los canales y utilice el modo de escala de grises hyper stack.

En el software Image J, abra una ventana de administrador de ROI siguiendo las herramientas de análisis, ruta del administrador de ROI. Seleccione una o más regiones de interés utilizando una herramienta de selección ovalada y la función agregar T en el administrador de ROI. A continuación, seleccione el área en segundo plano y guarde los ROI seleccionados.

A continuación, marque la casilla de una fila por corte en el cuadro de diálogo y haga clic en Aceptar en los resultados de las opciones del menú. Establecer medidas. Seleccione el valor medio de gris y calcule los valores de intensidad de píxeles para cada ROI, que se mostrarán en la ventana de resultados en columnas separadas.

Para cada ROI, copie los valores de intensidad de ROI medidos para cada canal en el software de análisis de datos preferido y reste los valores de intensidad de fondo de cada punto de datos para cada punto de tiempo. Calcule la relación entre las intensidades de los canales de gripe de cuatro a los canales rojos de URA después de ese gráfico, los cambios en el tiempo puntual del transitorio de calcio para cada ROI. Esta imagen muestra la pipeta de pinza de parche unida al cuerpo de óxido en la superficie del glomérulo de rata.

Durante un registro electrofisiológico, se puede ver una parte del glomérulo encapsulado en la esquina inferior derecha de la imagen. Aquí hay una traza de corriente representativa de la actividad de los canales tripy de un parche adjunto a la célula hecho en el podocito para medir la concentración de calcio intracelular. Los glomérulos se cargan con la gripe a las 4:00 a.m. para etiquetar el calcio intracelular.

Este video ilustra los efectos de la NIC y el cloruro de manganeso en la afluencia de calcio en los glomérulos. Este gráfico cuantifica los cambios en la intensidad de la señal de influenza oh cuatro registrados por un solo podocito en respuesta a la NIC y al cloruro de manganeso. Como se esperaba, la CIN produce el máximo de fluorescencia y el cloruro de manganeso apaga el tinte y da como resultado la intensidad de fluorescencia más baja.

La aplicación de estos fármacos permite al investigador definir posteriormente la concentración exacta de calcio dentro de la célula. Este video demuestra el efecto de 10 micromoles a TP en la concentración de calcio en los glomérulos. Nótese que hay un aumento en la fluorescencia de la gripe verde O cuatro y una caída en la fluorescencia roja fu roja, lo que explica un aumento de la concentración de calcio intracelular.

Esta técnica ofrece una oportunidad única para monitorear los cambios en la entrada de calcio a nivel de canal iónico único y células individuales después de tratamientos farmacológicos u otras manipulaciones. Por lo tanto, este enfoque representa una herramienta muy poderosa considerando los múltiples modelos de roedores modificados genéticamente disponibles. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar mediciones de la ación de calcio en los podocitos de los podocitos y los electrofisiológicos, que los experimentos de pinza se utilizan juntos por sí solos.

Estas técnicas proporcionan una visión profunda y mecanicista de la regulación del manejo del calcio con podocitos en condiciones normales y patológicas.