Imágenes en vivo de la ependimarios cilios en los ventrículos laterales del cerebro del ratón

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar una observación ex vivo del latido de los Motr que portan CLIA ubicados dentro de los ventrículos cerebrales del ratón. Esto se logra primero mediante la extracción de todo el cerebro y luego obteniendo secciones delgadas a través de los ventrículos laterales. A continuación, las secciones se incuban en una placa personalizada con fondo de vidrio que contiene medio rico en glucosa, mantenido a temperatura corporal para mantener el tejido vivo durante el experimento.

Finalmente, el latido del cilio se registra utilizando un microscopio de contraste de interferencia diferencial de alta resolución. En última instancia, la estructura y la localización proteica del cilio pueden visualizarse mediante imágenes de inmunofluorescencia. La principal ventaja de esta técnica respecto a nuestro método existente es que es la primera técnica que permite la clasificación de las células epidérmicas en tres grupos distintos según sus frecuencias y ángulos únicos de repetición cilial.

Eso es bueno. La implicación de esta técnica se extiende hacia la terapia de la hidrocefalia. Dado que la función anormal de la CLIA epidérmica conduce a la acumulación de líquido cefalorraquídeo en el cerebro.

Ventrículos que demuestran el procedimiento serán la Sra. Zaha Alam y la Sra. Hannah sentadas, estudiantes muy talentosas de nuestro laboratorio. Comience limpiando la cabeza de un ratón adulto con etanol al 70 %. Luego, empezando desde la parte superior de la cabeza, use tijeras y pinzas estériles para retirar la piel y exponer el cráneo.

A continuación, cure el hueso pieza por pieza, comenzando desde el lado posterior y avanzando hacia el lado anterior. Para extraer el cráneo, seleccione todo el cerebro y colóquelo en una placa de Petri de 100 milímetros con medio de glucosa alta a 37 grados Celsius. Utilizando una hoja afilada, corte el cerebro en el plano sagital medio para obtener la primera sección de 100 a 200 micrones de cada mitad.

Luego, lave las secciones con PBS a 37 grados Celsius e inmediatamente coloque el tejido en medio de glucosa para ojo a 37 grados Celsius. Para obtener imágenes de las secciones, coloque los cortes cerebrales en placas de cultivo de vidrio de 30 milímetros de fondo con un mililitro de medio con alta concentración de glucosa y ajuste el entorno de la cámara del microscopio a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 60 x. A continuación, enfoque las células con luz transmitida DIC normal.

Luego, siga la dirección del movimiento de la burbuja de DMEM como guía para localizar los cilios móviles. Utilice el filtro DIC para seleccionar un área que contenga células sanas con cilios móviles en el ventrículo lateral del cerebro. Tras identificar los cilios móviles, ajuste la luz y el enfoque para obtener una imagen satisfactoria.

A continuación, configure los parámetros de adquisición en vivo en el software de imagen. Por ejemplo, aquí se están adquiriendo imágenes de 24 bits con el bindeo de la cámara ajustado a uno por uno, combinado con el objetivo de 60x y un tiempo de exposición de cinco a 10 milisegundos. Abra la apertura del microscopio al nivel óptimo para un tiempo de exposición mínimo y capture las imágenes de contraste de interferencia diferencial (DIC).

Observe las imágenes en vivo transmitidas a la cámara para obtener una adquisición de imágenes rápida e inmediata sin demora. La velocidad del latido cardíaco puede entonces calcularse en función del requisito de tiempos mínimos de exposición para obtener un contraste de imagen suficiente que permita registrar la señalización de calcio. Después de seccionar el cerebro, enjuague brevemente el tejido en PBS e incube inmediatamente las secciones en 20 microgramos por mililitro de lu O2 recién preparado en una placa con fondo de vidrio.

Después de 30 minutos a 37 grados Celsius, registre la oscilación de calcio con una tasa de captura de cinco milisegundos durante un mínimo de un segundo. Primero con una longitud de onda de excitación de 488 nanómetros y luego con una longitud de onda de emisión de 515 nanómetros. Para visualizar los marcadores celulares de interés mediante microscopía de inmunofluorescencia, fije las muestras en paraformaldehído al 4% y sacarosa al 2% en PBS durante 10 minutos.

Lave el tejido tres veces en PBS durante cinco minutos cada lavado. A continuación, incube los cortes cerebrales en Triton X al 0,1 % durante cinco minutos. Después de enjuagar las muestras como se acaba de demostrar, incúbelas con anticuerpo monoclonal de ratón contra alfa tubulina acetilada.

Después de otro lavado con PBS, incubar las muestras en fluoresceína anti-IgG de EE.UU. durante una hora a temperatura ambiente. Finalmente, contratiñir las secciones con DPI durante cinco minutos e inmediatamente obtener imágenes de las células con el tiempo de exposición mínimo posible. La presencia de un CLIA peniano se confirma mediante un marcador de cilios, alfa tubulina acetilada, con contratiñido con DPI. Para identificar los núcleos, el análisis del flujo de la motilidad de un CLIA peniano se realiza contando la frecuencia de latido y el patrón de ángulo de las células en movimiento.

El CLIA puede entonces dividirse en uno de tres grupos según estos datos. Es importante destacar que la exposición del CLIA al etanol al 0,25 % reprime significativamente la frecuencia de latido del CLIA, independientemente de su tipo. La flexión adicional del CLIA desencadena una señalización intracelular de calcio dependiente del cilium, lo que permite la medición de la señal intracelular de calcio dentro de los ventrículos cerebrales. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en una hora si se realiza adecuadamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar manipular el tejido cerebral con delicadeza y eficiencia, para no destruir los ventrículos cerebrales después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran la función de append CLIA y el tejido cerebral de ratón vivo.