Name: El aislamiento y la propagación de células tumorales circulantes de un Cáncer de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Aprende a aislar y propagar células tumorales circulantes de sangre total en un modelo murino de hepatocarcinoma metastásico. Este método reproducible permite estudiar la metástasis y optimizar aplicaciones clínicas en oncología.

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El trabajo en el laboratorio del Dr. Ogunwobi está respaldado por una subvención del Programa de Centros de Investigación en Instituciones Minoritarias del Instituto Nacional de Salud de las Minorías y Disparidades en la Salud (MD007599) de los Institutos Nacionales de Salud. El contenido de este manuscrito es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales del NIMHD o del NIH.

Declaración de Ética: Todos los estudios con animales fueron aprobados por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de Hunter College de la City University de Nueva York. 1. Procedimientos Pre-experimento <ol><li> A su llegada a las instalaciones de animales, albergará inicialmente 3 ratones Balb / c con una jaula con una ropa de cama de arriba y astillas de madera filtrada. Asegúrese de que los ratones tienen libre acceso a la alimentación, purina comida para roedores y agua. Ropa de cama y comida deben cambiarse dos veces por semana, mientras que las jaulas deben limpiarse una vez a la semana. </li><li> Inducir la anestesia general en ratones usando un vaporizador de isoflurano junto con oxígeno a una velocidad de flujo constante de 1 L por minuto. El sistema es autosuficiente e incluye un vaporizador de precisión. </li><li> Posición animal en una caja de plástico que tiene el vaporizador precisión y gas / sistema de anestésico conectado a él. Inicialmente, ajuste el vaporizador para 2,5 hasta animal es inconsciente, en cuyo punto más bajo del vaporizador a 2. </li><li> En ese momento, cambie ellínea de válvulas, sellado a la caja y abrirla al cono de la nariz. </li><li> Mueva el animal a la zona de preparación, con el cono de la nariz colocado adecuadamente y conectado (para la anestesia de mantenimiento). </li><li> Preparar 5 × 10 6 células HCC ratón BNL 1ME A.7R.1 para su implantación por ratón. BNL 1ME A.7R.1 debería estar creciendo en un medio (10% FBS inactivado por calor, 1% de penicilina / estreptomicina y 2 mM L-Glutamina) incubar en una placa de cultivo celular a 37 ° C en un incubador humidificado con aire y 5% CO 2. </li><li> Con una jeringa que tiene una aguja G 20, el implante 100 l de PBS que contenía 5 x 10 6 células de carcinoma hepatocelular ratón BNL 1ME A.7R.1 en un lóbulo de los hígados de los ratones BALB / c para producir los tumores primarios. Post-implantación, la casa de los ratones BALB / c en una jaula con los mismos requisitos de las casas como de pre-implantación. </li><li> En el punto final experimental, evidencia clínica de carcinoma hepatocelular es observable como la reducción significativa en la condición corporalanotar (usualmente detectada después de 4 semanas). En este punto, hay una probabilidad de que los tumores primarios han desarrollado en el hígado mientras que los depósitos metastásicos se han formado en los pulmones. A partir de entonces, comenzará el proceso de aislamiento y la propagación de células tumorales circulantes. </li></ol> 2. Recolección de sangre entera para hacer circular Tumor Aislamiento celular NOTA: correctamente desinfectado la zona de la cirugía y asegúrese de que está libre de desorden. Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos o sumergirse en un desinfectante de acuerdo con las recomendaciones del fabricante <ol><li> Sacrificar los ratones por eutanasia humanitaria al experimental de punto final (evidencia clínica de desarrollo de tumores). La eutanasia de los ratones debería involucrar asfixia de CO 2. Observar los ratones adecuadamente para confirmar la anestesia se distribuye correctamente. El dióxido de carbono debe ser liberado lentamente en la cámara durante un período de 5 - 10 min, causando paro respiratorio. Siga por desangrado intracardiaca y CervicAl dislocación. 5 </li><li> Use una aguja 25 G unida a una jeringa de 1 ml para la recogida de sangre completa. Heparanize la jeringa con 0,01 ml de heparina. Punción inmediatamente la piel con la aguja inferior al xyphisternum aproximadamente a 45 ° de ángulo. Avanzar la aguja lentamente para perforar el corazón, y luego bajar el ángulo de la aguja. Constantemente mantener la aguja y una jeringa en su lugar, y extraer 500 l - 1.000 l de sangre entera desde el corazón. </li><li> Retire la jeringa y la aguja y la transferencia de la sangre en un tubo libre de pirógenos pre-marcado con 1,5 ml. Centrifugar la sangre entera recogida en 1,5 ml tubo libre de pirógenos a 1.167 xg durante 5 min. NOTA: La centrifugación separa la muestra de sangre en tres capas: la capa inferior o el hematocrito que consiste en células rojas de la sangre, una capa delgada intermedia de la capa leucocitaria, y una capa de plasma superior. </li><li> Retire el plasma con cuidado con la pipeta y recoger en un tubo de 1,5 ml pirógenos separado para furthexperimentos er como la detección de ácidos nucleicos libres de células 7. </li><li> Para el aislamiento de células tumorales circulantes (CTC), recoger la capa leucocitaria en un tubo libre de pirógenos 1,5 ml por separado en la preparación de glóbulos rojos (RBC) de lisis. Esto es necesario para eliminar los glóbulos rojos residuales en la capa de la capa leucocitaria. </li></ol> 3. Receta de glóbulos rojos (RBC) tampón de lisis <ol><li> Hacer una solución 1 L de tampón de lisis RBC. </li><li> Hacer una 500 ml de cloruro de amonio y 500 ml de Tris. A continuación, mezclar para crear una solución de 1 l de tampón de lisis RBC con una concentración final de 155 mM de cloruro de amonio y 10 mM de Tris. </li><li> Amortiguar la solución a un pH de 7,5. Almacene el tampón de lisis RBC entre +2 y +8 ° C, y llevar a RT inmediatamente antes de su uso. </li></ol> 4. RBC lisis de Buffy Coat <ol><li> Añadir 1 ml de tampón de lisis RBC al tubo de 1,5 ml estéril libre de pirógenos que contiene la capa leucocitaria recogida. </li><li> Mezclar el contenido del tubo porinvirtiendo varias veces. Incubar los contenidos mezclados del tubo durante 5 minutos a temperatura ambiente en el banquillo. Centrifugar los contenidos mezclados durante 5 min a 1167 x g. </li><li> Después de la centrifugación, se obtendrá un pellet blanquecino. Descartar el sobrenadante rojizo lentamente y con cuidado en 10% de lejía sin ninguna interrupción al sedimento. Si la pastilla no es blanquecina, volver a hacer los pasos 3.1 a 3.5. El aumento del tiempo de incubación en tampón de lisis RBC a 10 - 15 min también puede ser útil. </li><li> Deseche los residuos biológicos vez descontaminación de desechos biológicos en el 10% de lejía se completa después de 24 horas. </li></ol> 5. propagación en cultivo celular NOTA: Las células tumorales son típicamente crecen rápidamente las células de glóbulos blancos que son abundantes en la mezcla original de células sembradas en el plato. Tras el cambio repetido de medio, y los pasajes posteriores de CTC, todas las células blancas de la sangre se retiran y una población relativamente pura de CTC permanece. <ol><li> Despuésdescartando el sobrenadante en 10% de lejía, lavar el sedimento blanquecino en 1 solución salina tamponada con fosfato ml (PBS) al menos una vez, y resuspender en medio de cultivo completo para la propagación en cultivo celular. </li><li> Una vez que se ha completado lavado, añadir 1 ml de medio de cultivo A.7R.1 completa BNL 1ME (10% FBS inactivado por calor, 1% de penicilina / estreptomicina y 2 mM L-Glutamina) al sedimento y resuspender el precipitado en el medio de cultivo. </li><li> Sembrar la mezcla se volvieron a suspender las células en una placa de cultivo celular. Incubar la placa de cultivo celular a 37 ° C en un incubador humidificado con aire y 5% de CO 2. </li><li> Cambiar el medio de cultivo celular cada dos o tres días. Después de cinco a siete días, los CTC se han adherido a la placa de cultivo celular y comenzó a proliferar. Estas células se mantendrán viable más allá de 25 pasajes y después de congelación y descongelación ciclos repetidos 5. </li></ol> 6. Verificación de carcinoma hepatocelular circulantes línea de células tumorales <ol><li> Realizar apolymerase reacción en cadena (PCR) método basado, para amplificar solamente un segmento de ADN específica del gen β-globina de ratón para confirmar que la novela estableció líneas celulares de CTC son células de ratón como la línea de BNL 1ME A.7R.1 HCC original implantada. Método fue originalmente descrito y validado por Steube et al. 5,8 </li><li> Realizar la inmunotinción para el elemento de respuesta a cAMP marcador específico de hepatocitos proteína de unión 3-like 3 (CREB3L3) mediante el uso de un anticuerpo específico. Esto confirmará que la novela CTC establecidos son de hecho los hepatocitos como el implantado línea original de células BNL 1ME A.7R.1. 5 </li></ol>

<ol><li>Ashworth, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+case+of+cancer+in+which+cells+similar+to+those+in+the+tumors+were+seen+in+the+blood+after+death%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">A case of cancer in which cells similar to those in the tumors were seen in the blood after death.</a> Australian Medical Journal. 1869, 146-147 (14).</li>
<li>van de Stolpe, A., den Toonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Tumor+Cells%3A+What+Is+in+It+for+the+Patient%3F+A+Vision+towards+the+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Circulating Tumor Cells: What Is in It for the Patient? A Vision towards the Future.</a> Cancers. 6, 1195-1207 (2014).</li>
<li>Sheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture%2C+release+and+culture+of+circulating+tumor+cells+from+pancreatic+cancer+patients+using+an+enhanced+mixing+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip.</a> Lab on a chip. 14, 89-98 (2014).</li>
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<li>Cheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent%2C+biocompatible+nanostructured+surfaces+for+cancer+cell+capture+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Transparent, biocompatible nanostructured surfaces for cancer cell capture and culture.</a> International journal of nanomedicine. 9, 2569-2580 (2014).</li>
<li>Yu, M., Stott, S., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%3A+approaches+to+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization.</a> The Journal of cell biology. 192, 373-382 (2011).</li>
<li>Steube, K. G., Koelz, A. L., Drexler, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+verification+of+rodent+cell+lines+by+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Identification and verification of rodent cell lines by polymerase chain reaction.</a> Cytotechnology. 56, 49-56 (2008).</li>
<li>Pantel, K., Alix-Panabieres, C., Riethdorf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+micrometastases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Clinical+oncology%22%5BJournal%5D)">Cancer micrometastases.</a> Nature reviews. Clinical oncology. 6, 339-351 (2009).</li>
<li>Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+clinical+relevance+and+specific+biological+properties+of+disseminating+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells.</a> Nature reviews. Cancer. 8, 329-340 (2008).</li>
<li>Cristofanilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%2C+disease+progression%2C+and+survival+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> The New England journal of medicine. 351, 781-791 (2004).</li>
<li>De Giorgi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+and+bone+metastases+as+detected+by+FDG-PET%2FCT+in+patients+with+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+oncology+%3A+official+journal+of+the+European+Society+for+Medical+Oncology+%2F+ESMO%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells and bone metastases as detected by FDG-PET/CT in patients with metastatic breast cancer.</a> Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO. 21, 33-39 (2010).</li>
<li>Eloubeidi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoscopic+ultrasound-guided+fine+needle+aspiration+biopsy+of+patients+with+suspected+pancreatic+cancer%3A+diagnostic+accuracy+and+acute+and+30-day+complications%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Endoscopic ultrasound-guided fine needle aspiration biopsy of patients with suspected pancreatic cancer: diagnostic accuracy and acute and 30-day complications.</a> The American journal of gastroenterology. 98, 2663-2668 (2003).</li>
<li>O'Toole, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+complications+of+EUS-guided+fine-needle+aspiration%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointestinal+endoscopy%22%5BJournal%5D)">Assessment of complications of EUS-guided fine-needle aspiration.</a> Gastrointestinal endoscopy. 53, 470-474 (2001).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

En este estudio, se describió cómo aislar y propagar CTC de la sangre total de un ratón singénico con HCC. El objetivo de este trabajo es mejorar los estudios en curso sobre los mecanismos de la metástasis del cáncer. 
Un factor que contribuye al mal pronóstico de muchos cánceres es la falta de detección oportuna y la consiguiente diseminación generalizada de la neoplasia maligna3. Las CTC se originan a partir de cánceres primarios y se propagan a través del torrente sanguíneo a órg...

La comunidad de investigación del cáncer ha sabido de la existencia de células tumorales circulantes (CTC) desde que fueron observadas por primera vez por Thomas Ashworth en 18691. Desde entonces, se ha demostrado que las CTC son importantes en la metástasis tumoral y la progresión de la enfermedad2-5. Hoy en día, los tumores sólidos son una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Las CTC son células raras que se originan a partir de tumores primarios y viajan a través del torrente sanguíneo a diferentes órganos, de los cuales solo una pequeña fracción finalmente se convierte en metástasis2-5. En particular, existe una correlación positiva entre el tamaño del tumor y el CTC número3,4. 
Una comprensión de la biología de CTC puede contribuir a la búsqueda de terapia dirigida. Además, las CTC pueden tener aplicaciones diagnósticas. Para lograr estas posibles aplicaciones clínicas, es necesario superar algunos desafíos actuales para el estudio de las CTC. Un desafío está relacionado con el hecho de que las CTC pueden estar presentes como células individuales o como grupos e incluso pueden ser capaces de cambiar su fenotipo en respuesta al microambiente sanguíneo2. Además, la detección puede ser muy difícil, en parte, debido al bajo recuento de CTC (de unos pocos a cientos por mililitro) entre mil millones de células hematológicas por mililitro en la sangre6. Sin embargo, en los últimos años se ha intensificado la investigación sobre las posibles aplicaciones clínicas de las CTC procedentes de cánceres de órganos sólidos.
A pesar de estos esfuerzos, los desafíos de estudiar y comprender el papel de los CTC persisten debido a la rareza de los CTC y a la insuficiencia de las herramientas tecnológicas disponibles actualmente. A pesar de estos desafíos, el enorme potencial de las aplicaciones clínicas sigue siendo un incentivo para continuar la investigación sobre el papel de las CTC en la metástasis del cáncer.
Recientemente hemos logrado aislar y propagar CTC en cultivo celular a partir de un modelo de ratón singénico ortotópico de metástasis de carcinoma hepatocelular (CHC)5. El propósito del presente trabajo es describir en detalle todos los aspectos de la metodología exitosa. La importancia de esta metodología radica en el hecho de que este enfoque puede modificarse para aislar y propagar con éxito en cultivo CTC humanas, mejorando así la posibilidad de estudios in vitro de la biología de CTC. 
Existen múltiples aplicaciones clínicas potenciales para el uso de CTCs. Las CTC pueden ser útiles para el pronóstico, la monitorización de la respuesta, el cribado, la monitorización dinámica de las alteraciones moleculares tumorales y la terapia personalizada4. Por lo tanto, una mejor comprensión de la biología de las CTC tiene un alto potencial de impacto clínico.

<table><tbody><tr><td>Heparina Sal Sódica 1 g</td><td>VWR</td><td>89508-852</td><td></td></tr><tr><td>BTX Tubo Micro 1,5 ml Transparente NS</td><td>VWR</td><td>89511-254</td><td>1,5 ml&nbsp; sin pirógenos Tubos eppendorf</td></tr><tr><td>Aguja estéril Disp BD 25 G x 1 in</td><td>VWR</td><td>BD305125</td><td>25 G Aguja</td></tr><tr><td>Slp Punta SRNG 1 ml 200 cada uno por paquete</td><td>VWR</td><td>BD309659</td><td>1 ml punta de jeringa</td></tr><tr><td>Jeringa 1 ml leur lok Pk 100</td><td>VWR</td><td>BD309628</td><td>Jeringa de 1 ml</td></tr><tr><td>VWR Pinza de papel tisú 6</td><td>VWR</td><td>82027-446</td><td>Pinza</td></tr><tr><td>Cyromold intrm 15 x 15 x 5 mm PK 100</td><td>VWR</td><td>25608-924</td><td>Cyromold</td></tr><tr><td>Cryo-oct compund 4 oz</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>Oct compuesto</td></tr><tr><td>VWR Corredera sprfrst 25 x 75 mm PK72</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td>Correderas</td></tr><tr><td>VWR Cubierta de vidrio #2 22 x 50 mm</td><td>VWR</td><td>48-382-128</td><td>Cubierta de vidrio</td></tr><tr><td>VWR Caja deslizante True North FM Pu</td><td>VWR</td><td>89140-278</td><td>Caja</td>deslizante</tr><tr><td>Super HT Bolígrafo PAP</td><td>VWR</td><td>89427-058</td><td>Bolígrafo PAP</td></tr><tr><td>Agua Libre de ARNe y ADNasa 2 L</td><td>VWR</td><td>101454-204</td><td>Tampón de agua sin nucleasa</td></tr><tr><td>Tris Ultra Pure Grade 500 g</td><td>VWR</td><td>97061-796</td><td>Tris Buffer</td></tr><tr><td>Cloruro de amonio ACS Grado 2, 5 kg</td><td>VWR</td><td>97062-048</td><td>Tampón de cloruro de amonio Plato de cultivo de</td></tr><tr><td>tejidos Falcon 60 x 15 mm Plato</td> de <td>cultivo de tejidos</td><td>de poliestireno estilo VWR</td><td>353002</td></tr><tr><td>Lejía germicida Clorox, regular</td><td>VWR</td><td>89501-620</td><td>Clorox Bleach</td></tr><tr><td>PBS, 1x (solución salina tamponada con fosfato) sin calcio y magnesio (500 ml)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>21-040-CV</td><td>PBS, 1x</td></tr><tr><td>DMEM, 1x&nbsp; con 4,5 g/L de glucosa & L-glutamina sin piruvato de sodio</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>10-017-CV</td><td>DMEM 1x medios para células BNL 1ME A.7R.1</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>35-010-CV</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina Solución, 100x</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>30-002-Cl</td><td>Penicilina Estreptomicina</td></tr><tr><td>Sorvall Biofuge pico</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>75002411</td><td>Centrífuga de 13.000 rpm</td></tr></tbody></table>

el aislamiento y la propagación de células tumorales circulantes de un cáncer de ratón

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

La metástasis del cáncer es la principal causa de muertes asociadas al cáncer. Estudios recientes han demostrado que las células tumorales circulantes (CTC) son importantes en la metástasis del cáncer. De hecho, el número de CTC se correlaciona con el tamaño del tumor. En este artículo, se proporciona una descripción detallada de una metodología para el aislamiento y la propagación de CTC a partir de un modelo murino singénico de carcinoma hepatocelular (CHC) que permite el análisis posterior de los mecanismos moleculares potencialmente importantes de la metástasis tumoral de órganos sólidos. Este método es eficiente y reproducible. Es una técnica no invasiva y, por lo tanto, tiene potencial para reemplazar la biopsia invasiva de tejidos humanos que puede estar asociada a complicaciones. Por lo tanto, el método discutido aquí permite el aislamiento y la propagación de CTC a partir de muestras de sangre completa, de modo que puedan examinarse y caracterizarse. Esto tiene potencial para futuras adaptaciones a aplicaciones clínicas como el diagnóstico y la terapia dirigida personalizada.

La metodología descrita aquí ha demostrado que las CTC se pueden aislar. Los ratones fueron sacrificados humanitariamente al experimental de punto final. El proceso implicado carbono asfixia con dióxido, desangrado intra-cardiaca, y la dislocación cervical. Un diagrama esquemático de los pasos clave del procedimiento se ilustran en la Figura 2. Muestras de sangre total extraída por desangrado intra-cardiaca se procesaron utilizando el protocolo descrito anteriormente. Después de lo cual...

Se ha demostrado que las células tumorales circulantes (CTC) desempeñan un papel importante en la metástasis tumoral. En este artículo, se describe un método para el aislamiento y la propagación de CTC a partir de la sangre total de un modelo tumoral singénico de ratón con metástasis de carcinoma hepatocelular (CHC).

El aislamiento y la propagación de células tumorales circulantes de un Cáncer de ratón

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar y propagar células tumorales circulantes a partir de sangre total de un modelo de tumor sincrénico en ratón con metástasis de carcinoma hepatocelular. Esto se logra primero centrifugando la sangre total recolectada de los ratones y aislando la capa de leucocitos. A continuación, se lisan los glóbulos rojos en la capa de leucocitos y se recolectan las células tumorales circulantes en un precipitado.A continuación, las células se lavan, se suspenden en medio de cultivo completo y se propagan en cultivo celular. Las células tumorales de crecimiento rápido permanecen viables durante numerosos pases y pueden verificarse mediante técnicas moleculares diagnósticas estándar. La importancia de aislar células tumorales circulantes mediante nuestra técnica radica en que proporciona un modelo reproducible, que puede optimizarse para un uso potencial en un entorno clínico.Michelle Nadu, una estudiante universitaria de nuestro laboratorio, me acompañará en la demostración del procedimiento. Comience la recolección de sangre total a partir de un modelo tumoral de Ciea Kamau con metástasis de carcinoma hepatocelular, tal como se describe en un artículo separado de J, utilizando una centrífuga vertical. La sangre total recolectada se centrifuga a 1.167 × g durante cinco minutos a temperatura ambiente.Una vez separadas en capas, retire cuidadosamente la capa superior de plasma y transfiérala a un tubo libre de rogen de 1,5 mililitros aparte para experimentos posteriores, como la detección de ácidos nucleicos libres de células. A continuación, transfiera la capa de buffy coat a un tubo ROGEN libre de 1,5 mililitros aparte para preparar la lisis de glóbulos rojos. Esto es necesario para eliminar los glóbulos rojos residuales en la capa de buffy coat antes del aislamiento de células tumorales circulantes.Comience preparando una solución de un litro de tampón de lisis de glóbulos rojos con una concentración final de 155 milimolares de cloruro de amonio y 10 milimolares de triss. Ajuste el pH de la solución a 7,5. Tome una alícuota de aproximadamente dos a cuatro mililitros de la mezcla stock de un litro de tampón de lisis de glóbulos rojos.Luego, agregue un mililitro del tampón de lisis de glóbulos rojos al tubo que contiene la capa leucocitaria recolectada. Mezcle el contenido del tubo invirtiéndolo varias veces. A continuación, incube el tubo durante cinco minutos a temperatura ambiente sobre la bancada.A continuación, centrifugue el contenido mezclado durante cinco minutos a 1.167 × g. Después de la centrifugación, se obtendrá un sedimento blanquecino. Deseche cuidadosa y lentamente el sobrenadante rojizo en lejía al 10% sin alterar el sedimento.Después de descartar el sobrenadante, lave el sedimento blanquecino con un mililitro de PBS. Luego, vuelva a sedimentar las células y resuspenda en medio de cultivo completo. Siembre las células resuspendidas en un recipiente de cultivo celular e incube las células a 37 grados Celsius en un incubador humedecido con aire y 5% de dióxido de carbono.Cambie el medio de cultivo celular cada dos o tres días. Después de cinco a siete días, las células tumorales circulantes habrán adherido al recipiente de cultivo celular y comenzado a proliferar. Con el fin de verificar que las células tumorales circulantes de carcinoma hepatocelular se aislaron correctamente.Realice una PCR para un segmento específico del gen de la beta globina del ratón, tal como se describe y valida por Stu. Luego inmunotincione las células con un anticuerpo específico para el marcador específico de hepatocitos. Las imágenes representativas que se muestran aquí, obtenidas mediante técnicas estándar, corresponden a células tumorales circulantes de dos ratones diferentes.En cultivo a partir de un modelo ortotópico siniónico de carcinoma hepatocelular en ratón. Las células tumorales metastásicas se adhieren al recipiente y proliferan rápidamente. Pueden ampliarse más allá de 25 pasajes y resisten ciclos repetidos de congelación y descongelación.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y propagar células tumorales circulares viables, así como caracterizarlas tanto molecular como funcionalmente.

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Investigación

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Medicina

El video describe la técnica de inyección intracónica de células cancerosas para desarrollar un modelo de ratón ortotópico con tumores altamente uniformes. Por lo tanto, el modelo ortotópico de ratón permite una simulación realista de la metástasis, proporcionando una herramienta valiosa para estudiar los cambios fenotípicos durante el crecimiento y la diseminación del tumor.

Inyección de células tumorales trazadas: una técnica para administrar células cancerosas para establecer un modelo de ratón de cáncer colorrectal ortotópico

Este video describe un protocolo detallado para aislar células tumorales circulantes de la muestra de sangre completa de un modelo de ratón con tumor colorrectal eutanasiado. Estos CTC aislados se pueden cultivar y utilizar para el análisis posterior previsto.

Aislamiento de CTC a partir de una muestra de sangre completa: un método para obtener CTC a partir de un modelo murino de cáncer colorrectal

La diseminación metastásica del cáncer es la principal causa de muerte por cáncer. Proporcionamos una descripción en profundidad de nuestra metodología de la cirugía de supervivencia para el establecimiento de un sistema de modelo de ratón singénico "-paciente como" ortotópico para el estudio de los mecanismos de la metástasis en tumores de órganos sólidos.

Un &quot;paciente-Like&quot; ortotópico Singénico modelo de ratón de carcinoma hepatocelular Metástasis

Reportamos un método confiable para aislar y cultivar células endoteliales primarias específicas de tumores a partir de modelos de ratón modificados genéticamente.

Aislamiento y cultivo de expansión de las células endoteliales-tumorales específicas

Este manuscrito detalla un método utilizado para generar xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer de próstata (PDX) a partir de células tumorales circulantes (CTC). La generación de modelos PDX a partir de CTCs proporciona un modelo experimental alternativo para estudiar el cáncer de próstata; Es el tumor más comúnmente diagnosticado y una causa frecuente de muerte por cáncer en los hombres.

Generación del paciente con cáncer de próstata Derivado modelos de xenoinjertos de células tumorales circulantes

Describimos el establecimiento de tumores colorrectales ortotópicos mediante la inyección de células tumorales o organoides en el ciego de ratones y el subsiguiente aislamiento de células tumorales circulantes (CTC) de este modelo.

Aislamiento de células tumorales circulantes en un modelo de ratón ortotópico de cáncer colorrectal

Un modelo animal es necesario para descifrar el papel de las células del tumor (CTC) en la promoción de la colonización durante la metástasis del cáncer de pulmón en circulación. Aquí, hemos establecido y realizado con éxito un en vivo ensayo a prueba específicamente el requisito de fibronectina poliméricos (polyFN) Asamblea CTC para la colonización del pulmón.

El establecimiento de un ensayo de colonización pulmonar para la visualización de células tumorales en tejidos pulmonares de la circulación

Aquí, presentamos un flujo de trabajo integrado para identificar rasgos fenotíricos y moleculares que caracterizan las células tumorales circulantes (CTCs). Combinamos la inmunostalización en vivo y la micromanipulación robótica de los CTCs individuales y agrupados con técnicas basadas en una célula para el análisis y la evaluación de la capacidad de la metastasis-siembra.

Micromanipulación de células tumorales circulantes para análisis molecular descendente y evaluación potencial metastásica

Este protocolo describe un método reproducible para el aislamiento de las células primarias de rabdomiosarcoma de ratón, la formación y el tratamiento de la tumoresfera y el trasplante de aloinjertoado a partir de cultivos de tumoresferas.

Derivación y tratamiento de tumoresferas a partir de células tumorales primarias aisladas de Rhabdomyosarcomas de ratón

El cultivo de CTC permite una caracterización funcional más profunda del cáncer, a través del ensayo de la expresión de marcadores específicos, y la evaluación de la resistencia a los medicamentos y la capacidad de colonizar el hígado, entre otras posibilidades. En general, el cultivo de CTC podría ser una herramienta clínica prometedora para la medicina personalizada para mejorar el resultado del paciente.

Líneas celulares tumorales circulantes: una herramienta innovadora para la investigación fundamental y traslacional

La traslación de los hallazgos de la microscopía intravital se ve desafiada por su poca profundidad de penetración en el tejido. Aquí describimos un modelo de ratón de cámara de ventana dorsal que permite el registro conjunto de la microscopía intravital y las modalidades de imagen clínicamente aplicables (p. ej., TC, RM) para la correlación espacial directa, lo que podría agilizar la traducción clínica de los hallazgos de la microscopía intravital.

Un modelo de ratón tumoral con cámara de ventana de pliegue cutáneo dorsal para la microscopía intravital combinada y la resonancia magnética en la investigación traslacional del cáncer

Aprende a aislar y propagar células tumorales circulantes de sangre total en un modelo murino de hepatocarcinoma metastásico. Este método reproducible permite estudiar la metástasis y optimizar aplicaciones clínicas en oncología.

El aislamiento y la propagación de células tumorales circulantes de un Cáncer de ratón

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