El aislamiento y la propagación de células tumorales circulantes de un Cáncer de ratón

El objetivo general de este procedimiento es aislar y propagar células tumorales circulantes a partir de sangre total de un modelo de tumor sincrénico en ratón con metástasis de carcinoma hepatocelular. Esto se logra primero centrifugando la sangre total recolectada de los ratones y aislando la capa de leucocitos. A continuación, se lisan los glóbulos rojos en la capa de leucocitos y se recolectan las células tumorales circulantes en un precipitado.

A continuación, las células se lavan, se suspenden en medio de cultivo completo y se propagan en cultivo celular. Las células tumorales de crecimiento rápido permanecen viables durante numerosos pases y pueden verificarse mediante técnicas moleculares diagnósticas estándar. La importancia de aislar células tumorales circulantes mediante nuestra técnica radica en que proporciona un modelo reproducible, que puede optimizarse para un uso potencial en un entorno clínico.

Michelle Nadu, una estudiante universitaria de nuestro laboratorio, me acompañará en la demostración del procedimiento. Comience la recolección de sangre total a partir de un modelo tumoral de Ciea Kamau con metástasis de carcinoma hepatocelular, tal como se describe en un artículo separado de J, utilizando una centrífuga vertical. La sangre total recolectada se centrifuga a 1.167 × g durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Una vez separadas en capas, retire cuidadosamente la capa superior de plasma y transfiérala a un tubo libre de rogen de 1,5 mililitros aparte para experimentos posteriores, como la detección de ácidos nucleicos libres de células. A continuación, transfiera la capa de buffy coat a un tubo ROGEN libre de 1,5 mililitros aparte para preparar la lisis de glóbulos rojos. Esto es necesario para eliminar los glóbulos rojos residuales en la capa de buffy coat antes del aislamiento de células tumorales circulantes.

Comience preparando una solución de un litro de tampón de lisis de glóbulos rojos con una concentración final de 155 milimolares de cloruro de amonio y 10 milimolares de triss. Ajuste el pH de la solución a 7,5. Tome una alícuota de aproximadamente dos a cuatro mililitros de la mezcla stock de un litro de tampón de lisis de glóbulos rojos.

Luego, agregue un mililitro del tampón de lisis de glóbulos rojos al tubo que contiene la capa leucocitaria recolectada. Mezcle el contenido del tubo invirtiéndolo varias veces. A continuación, incube el tubo durante cinco minutos a temperatura ambiente sobre la bancada.

A continuación, centrifugue el contenido mezclado durante cinco minutos a 1.167 × g. Después de la centrifugación, se obtendrá un sedimento blanquecino. Deseche cuidadosa y lentamente el sobrenadante rojizo en lejía al 10% sin alterar el sedimento.

Después de descartar el sobrenadante, lave el sedimento blanquecino con un mililitro de PBS. Luego, vuelva a sedimentar las células y resuspenda en medio de cultivo completo. Siembre las células resuspendidas en un recipiente de cultivo celular e incube las células a 37 grados Celsius en un incubador humedecido con aire y 5% de dióxido de carbono.

Cambie el medio de cultivo celular cada dos o tres días. Después de cinco a siete días, las células tumorales circulantes habrán adherido al recipiente de cultivo celular y comenzado a proliferar. Con el fin de verificar que las células tumorales circulantes de carcinoma hepatocelular se aislaron correctamente.

Realice una PCR para un segmento específico del gen de la beta globina del ratón, tal como se describe y valida por Stu. Luego inmunotincione las células con un anticuerpo específico para el marcador específico de hepatocitos. Las imágenes representativas que se muestran aquí, obtenidas mediante técnicas estándar, corresponden a células tumorales circulantes de dos ratones diferentes.

En cultivo a partir de un modelo ortotópico siniónico de carcinoma hepatocelular en ratón. Las células tumorales metastásicas se adhieren al recipiente y proliferan rápidamente. Pueden ampliarse más allá de 25 pasajes y resisten ciclos repetidos de congelación y descongelación.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y propagar células tumorales circulares viables, así como caracterizarlas tanto molecular como funcionalmente.