In vitro e in vivo modelo para estudiar la adhesión bacteriana a la pared del recipiente en condiciones de flujo

Para estudiar la interacción de las bacterias con los vasos sanguíneos sometidos a esfuerzo cortante, se describe una cámara de flujo y un modelo de microscopía mesentérica intravital in vivo que permiten diseccionar los factores bacterianos y del huésped que contribuyen a la adhesión vascular.

El objetivo general del siguiente experimento es investigar la interacción entre las bacterias y el endotelio y el subendotelio bajo puro estrés. Esto se logra mediante el marcaje fluorescente de bacterias para visualizarlas en tiempo real utilizando microscopía de video como segundo paso. Una cámara de flujo in vitro se utiliza para estudiar los diferentes actores involucrados en la adhesión de las bacterias que fluyen a los componentes celulares o de la matriz.

A continuación, se estudian las interacciones identificadas en el modelo in vitro de perfusión mesentérica in vivo para probar su relevancia en un organismo complejo, los resultados muestran que Staphylococcus reus es capaz de adherirse a las células endoteliales activadas y al subendotelio bajo esfuerzo de cizallamiento. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que incluye tanto un modelo in vitro como uno in vivo, que son complementarios para estudiar la patogenia de las infecciones endovasculares bajo puro estrés. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de las enfermedades infecciosas y la biología vascular, como por ejemplo cómo se establecen la endocarditis infecciosa y las infecciones metastásicas bajo puro estrés fisiológico, demostrando un procedimiento a través de Malin parece un técnico especializado en el trabajo con animales de nuestro laboratorio Comience preparando el tinte fluorescente utilizado para rastrear las bacterias.

Agregue 150 microlitros de una solución fluorescente de carboxi en 850 microlitros de agua de laboratorio y mezcle. Guarde la solución protegida de la luz a menos 20 grados centígrados hasta que la necesite. Siguiente pellet, un cultivo de cinco mililitros de S reus.

Las bacterias cultivadas durante la noche en caldo de soja tríptico se lavan una vez con PBS y luego se vuelven a suspender. El nuevo pellet en 800 microlitros de PBS añade 200 microlitros de la solución de colorante a las células resuspendidas para experimentos de perfusión in vitro, o 400 microlitros de la solución de colorante. Para experimentos in vivo, cubra los tubos con papel de aluminio para evitar el fotoblanqueo del tinte e incube en un agitador durante 30 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, agregue una solución de albúmina sérica bovina al 6% en PBS a la mezcla para bloquear la unión inespecífica. Compruebe la concentración de células mediante citometría óptica y diluya las bacterias en PBS a varias concentraciones en función de su aplicación. Una vez diluidos, proteja los tubos de la luz y colóquelos sobre hielo.

Diluya el factor von Vand en agua de laboratorio hasta una concentración final de 50 microgramos por mililitro. También diluir el colágeno en una solución isotónica de glucosa hasta una concentración final de 160 microgramos por mililitro. A continuación, deje caer 200 microlitros de cada capa en una tira de paraforma.

Coloque los cubreobjetos encima de las gotas para cubrirlas con las proteínas. Incubar el cubreobjetos en un recipiente humidificado durante cuatro horas a temperatura ambiente. A continuación, levante con cuidado los cubreobjetos de la paraforma con una aguja roma y monte el cubreobjetos en la parte inferior de una cámara de flujo para experimentos con células endoteliales, cubra los cubreobjetos de plástico con un mililitro de una solución de gelatina al 1% en PBS y colóquelos durante 30 minutos a 37 grados centígrados.

Luego, siembre células endoteliales de la vena umbilical humana en los deslizamientos de plástico recubiertos de gelatina y hágalos crecer hasta un 70 a 80% de fluidez. Monte el cubreobjetos recubierto de proteínas o el cubreobjetos de plástico recubierto de células endoteliales en la parte inferior de la cámara de flujo. A continuación, conecte los tubos de entrada y salida a la parte superior de la cámara de flujo y conecte el tubo de salida a un contenedor de residuos.

Coloque suavemente la parte superior de la cámara de flujo en la parte inferior y ensamble la cámara de flujo. Evitando la formación de burbujas de aire. Inyecte un mililitro de medio a través de la cámara para asegurarse de que la cámara no tenga fugas y para eliminar el exceso de solución de recubrimiento.

A continuación, configure la bomba de infusión para una jeringa de un mililitro para que fluya a 75 microlitros por minuto. Si trabajas en una habitación oscura, llena una jeringa de un mililitro con un mililitro de bacterias marcadas con fluorescencia y colócala en la bomba de infusión. Conecte la salida de la jeringa a la entrada de la cámara de flujo.

Teniendo cuidado de evitar burbujas de aire, ponga en marcha la bomba de infusión durante 10 minutos a 75 microlitros por minuto. Después de 10 minutos, retire la primera jeringa y conecte una jeringa de un mililitro que contenga PBS o DMEM al tubo de entrada. Inicie la infusión, bombee y enjuague durante 10 minutos para eliminar las bacterias no unidas.

Una vez enjuagada, deje la bomba de infusión encendida y tome al menos 15 imágenes en blanco y negro con un tiempo de exposición de 1,5 segundos en ubicaciones aleatorias, repartidas por la superficie recubierta de la cámara de flujo. Con un programa de análisis de imágenes como Image J.Reste el fondo para eliminar los fondos continuos suaves de la imagen y defina el umbral para establecer los valores de umbral inferior y superior, lo que segmenta las imágenes en escala de grises en características de interés. A continuación, mida el área limitada al umbral recién creado y guarde este valor conocido como área fluorescente para cada muestra.

Se probó en ratones de ocho semanas de edad la noche anterior al experimento para reducir el movimiento intestinal. El día del experimento comienza inyectando 0,1 miligramos de buprenorfina por kilogramo de peso corporal como analgésico. A continuación, anestesia al ratón y aplica ungüento en los ojos.

Coloque el ratón en la almohadilla térmica controlada bajo el osciloscopio de disección y compruebe que el ratón no muestra ningún reflejo de pétalo. Haz una incisión de un centímetro paralela a la vena yugular. Extirpe el lado derecho del músculo cervical y luego aísle la vena yugular del tejido circundante.

Inserte un catéter intravenoso de dos French en la vena yugular derecha y asegúrelo en su lugar con puntos de sutura. A continuación, haga una incisión en la línea media del abdomen para abrir la cavidad peritoneal. Coloque el mouse en su lado derecho sobre una placa transparente y asegure la cánula con cinta adhesiva.

Extraiga suavemente los intestinos con hisopos de algodón y extienda el mesenterio. Visualizar la circulación arteriolar y ular mesentérica. Coloque una compresa caliente sobre el ratón para evitar la hipotermia y deje caer 500 microlitros de 0,9% de NACL en los intestinos cada 30 minutos para evitar la deshidratación del tejido.

Use hisopos de algodón para inmovilizar los vasos y visualizarlos bajo un microscopio invertido. A continuación, por vía tópica, aplique cinco microlitros de una solución de 10 milimolares de iono calcio disuelto en DMSO. Esto activará la liberación de Von Villa Brandt, factor de las células endoteliales en los vasos.

Después de 10 segundos, inyecte 100 microlitros de las bacterias marcadas con fluorescencia a través del catéter yugular. En este momento, comience a tomar imágenes de lapso de tiempo, adquiera imágenes de lapso de tiempo usando la herramienta de adquisición en la barra de herramientas usando 40 ciclos de 1000 imágenes por segundo. Una vez completada la adquisición de la imagen, se aplica la eutanasia al ratón de acuerdo con las directrices institucionales.

Guarde las imágenes en un formato de archivo de imagen apropiado y luego procese las imágenes utilizando el software de análisis de imágenes J como se describió anteriormente para enfatizar el papel de la tensión pura en la adhesión bacteriana, las perfusiones de Staphylococcus aureus se realizaron a diferentes velocidades de cizallamiento en cubreobjetos recubiertos con factor Von Vbr. A medida que aumentan las tasas, también lo hace la adhesión bacteriana, lo que indica que las altas fuerzas de cizallamiento no inhiben, sino que refuerzan la adhesión de las bacterias a la proteína. En ausencia del factor de Von Vand, la adhesión del Staphylococcus aureus al colágeno disminuyó con el aumento de las tasas de cizallamiento.

Sin embargo, cuando el factor Von Vand estaba presente en el medio, la adhesión de las bacterias aumentó con el aumento de las tasas de cizallamiento, las células endoteliales activadas con un iono de calcio cuatro para liberar el factor Vand mostraron significativamente más adhesión bacteriana que las células no activadas. Además, las bacterias formaron patrones típicos en forma de cadena de grupos bacterianos marcados con fluorescencia que se alinearon en la dirección de la fuerza pura, lo que sugiere que la unión de las bacterias a lo largo de una molécula de VWF estirada linealmente para probar el efecto del factor Von Vbr in vivo Las células endoteliales de la circulación mesentérica se activaron para liberar el factor von Vbr. y luego se introdujeron células bacterianas marcadas con fluorescencia en el torrente sanguíneo. Las bacterias se adhirieron localmente a la pared del vaso activado y formaron agregados.

Después de ver este video, debería tener una mejor comprensión de cómo investigar la interacción con las bacterias y la pared del vaso en el esfuerzo cortante mediante el marcaje fluorescente de las bacterias y visualizándolas tanto en una cámara de flujo in vitro como en un modelo de profusión mesentérica intravital in vivo. Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de las infecciones cardiovasculares exploren la interacción entre los patógenos y la pared de los vasos en la endocarditis infecciosa y las infecciones metastásicas.