Name: In vitro e in vivo modelo para estudiar la adhesión bacteriana a la pared del recipiente en condiciones de flujo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Aprende a estudiar la adhesión bacteriana a la pared vascular bajo estrés de cizallamiento usando modelos in vitro e in vivo con Staphylococcus aureus. Este método permite visualizar en tiempo real las interacciones patógeno-hospedador.

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Este trabajo fue apoyado por el Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO) Vlaanderen G0466.10, 11I0113N; &quot;Eddy Merckx Beca de Investigación&quot; y el &quot;Sporta investigación Grant&quot; la cardiología pediátrica, UZ Lovaina, Bélgica (JC); el Centro de Molecular y Biología Vascular es apoyado por el Programmafinanciering KU Leuven (PF / 10/014), por el &quot;Geconcentreerde Onderzoeksacties&quot; (GOA 2009/13) por la Universidad de Lovaina y una beca de investigación de Boehringer Ingelheim.

Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Ético de la Universidad Católica de Lovaina. 1. Las bacterias Preparación para In Vitro perfusiones e in vivo <ol><li> Se utilizó S. aureus cepa Newman para todos los experimentos descritos en este manuscrito. S. aureus Newman se almacenó en infusión cerebro corazón (BHI) con 10% de glicerol a -80 ° C. </li><li> Use un asa estéril para raspar las bacterias congeladas fuera e inocular en 5 ml de caldo de soja tríptico (TSB) O / N a 37 ° C (OD 600&gt; 3). </li><li> Lavar las bacterias por centrifugación (2600 g, RT, 5 min) y resuspender el sedimento bacteriano en 5 ml de PBS (tampón fosfato salino). </li><li> Preparar una solución de 1 mg / ml de 5 (6) éster de N-hidroxisuccinimidilo-carboxi fluoresceína (carboxi-fluoresceína) en etanol. Diluir el / solución de 1 mg ml carboxi-fluoresceína a 150 g / ml en agua de calidad de laboratorio (por ejemplo, agua MilliQ). Proteja los tubos de luzcon papel de aluminio y se almacena a -20 ° C. </li><li> Centrifugar las bacterias (2.600 xg, RT, 5 min). Resuspender el sedimento bacteriano en 800 l de PBS y añadir 200 l (concentración final de 30 mg / ml para los experimentos de perfusión) o 400 l (concentración final 50 mg / ml para los experimentos in vivo) de la / ml solución carboxi-fluoresceína 150 g. Proteja los tubos de la luz con papel de aluminio y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador. </li><li> Después del marcaje, bloque con una solución de 6% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS. </li><li> Diluir bacterias usando densitometría óptica (DO), un OD 600 de 0,65 para los experimentos in vitro (correspondiente a aproximadamente 3 x 10 8 unidades formadoras de colonias (UFC) / ml para S. aureus) y un OD 600 de 1,8 para experimentos in vivo ( correspondiente a aproximadamente 1 x 10 9 UFC / ml para S. aureus) en PBS. Proteja los tubos de la luz con papel de aluminio y dejar en hielo. </li></ol> 2. Los experimentos in vitro de perfusión <ol><li> Recubrimiento de cubreobjetos de vidrio <ol><li> Diluir el factor de von Willebrand (VWF) (Haemate P, concentración de stock 2,400 g / ml) en agua de calidad de laboratorio (destilada desionizada) a una concentración final de 50 mg / ml. </li><li> Diluir colágeno en solución isotónica de glucosa (solución SKF, pH 2.7 a 2.9, tal como se suministra por el fabricante) a una concentración final de 160 mg / ml. </li><li> Escudo cubreobjetos de vidrio (24 × 50 mm) con VWF o colágeno dejando caer 200 l de la capa en Parafilm y colocar el cubreobjetos en la parte superior de la gotita. La gota se extenderá a lo largo de la superficie del cubreobjetos. </li><li> Incubar el cubreobjetos en un recipiente humidificado durante 4 horas a RT. Levante con cuidado el cubreobjetos de la parafina con una aguja roma. Montar el cubreobjetos en la parte inferior de la cámara de flujo. </li></ol></li><li> El recubrimiento de plástico desliza con células endoteliales <ol><li> Resbalones plástico Escudo(1-así ​​cámara de cultivo celular PCA, Sarstedt, Alemania) con 1 ml de una solución de gelatina al 1% en PBS e incubar durante 30 min a 37 ° C. Sembrar las células endoteliales de vena umbilical humanas (HUVEC) en las hojas de plástico recubiertos con gelatina y crecer a 70-80% de confluencia. Montar la hoja de plástico en la parte inferior de la cámara de flujo. </li></ol></li><li> Experimento de perfusión NOTA: Una visión esquemática del modelo in vitro de perfusión en está representado en la figura 1. <ol><li> Realizar estudios in vitro la adhesión bacteriana en una cámara de flujo placa de micro-paralelo a un esfuerzo de cizalla laminar entre 2,5 dinas / cm 2 y 20 dinas / cm 2 para simular diferentes condiciones de flujo fisiológicas. </li><li> El (diseño en-casa) cámara de flujo consiste en una estructura de metal y una cámara de perfusión hecha de plexiglás (poli (metil) metacrilato (PMMA)). Por lo conecta a una bomba de infusión de alta precisión (PHD 2000 Infusión, Harvard Apparatus, EE.UU.), podemos generar ra flujotes entre 0,0001 l / min y 220,82 ml / min. </li><li> Conectar el tubo a la parte superior de la cámara de flujo e inyectar medio en el tubo. Colocar suavemente la parte superior de la cámara de flujo en la parte superior de la parte inferior y montar la cámara de flujo. Tenga cuidado para evitar las burbujas de aire. Inyectar 1 ml de medio a través de la cámara para asegurarse de que la cámara no tenga fugas y para eliminar la solución de revestimiento en exceso. Evite las burbujas de aire. </li><li> Coloque el ratón sobre una almohadilla caliente termo-controlado a 37 ° C en una bandeja microscopio. Dado que este es un procedimiento de terminal, no hay necesidad de procedimientos asépticas estrictas. Hacer una incisión cerca de la vena yugular, eliminar suavemente el lado derecho del músculo cervical y aislar la vena yugular del tejido circundante. </li><li> Configure la bomba de infusión y el microscopio de fluorescencia. Ajustes de la bomba de infusión dependen del diámetro de la jeringa y el caudal deseado (ver sección 2.4). A partir de ahora, trabajar en un cuarto oscuro. </li><li> VWF Recubrimiento: <ol><li> Llene una jeringa con bacterias marcadas con fluorescencia y conectarlo al tubo de entrada. Evite las burbujas de aire. Encienda la bomba de infusión durante 10 minutos. El tiempo de infusión depende de la velocidad de cizallamiento y el recubrimiento, las bacterias y medio utilizado y debe representar el estado estacionario de la adhesión. </li><li> Después de 10 min, lavar las bacterias no unidas mediante la conexión de una jeringa con PBS al tubo de entrada y de arrancar la bomba de infusión. </li><li> Tomar por lo menos 15 imágenes o películas en diferentes lugares después del proceso de lavado. Las bacterias son pequeñas y potencialmente difícil de enfocar. Antes del experimento de flujo in vitro, el plano focal apropiada puede ser recuperada mediante la colocación de una gota de bacterias marcadas con fluorescencia en un cubreobjetos y colocar el cubreobjetos en la cámara de flujo. A continuación, busque el plano focal apropiado y guardar la configuración. NOTA: Durante el experimento de flujo in vitro, la captura de las imágenes durante la etapa de lavado (± 5 min después del inicio) asegura que sólo elseñal para las bacterias adherentes es capturado. </li></ol></li><li> Colágeno Recubrimiento: <ol><li> Añadir 60 g / ml VWF a las bacterias marcadas fluorescentemente justo antes de comenzar la perfusión. Llene una jeringa con bacterias marcadas con fluorescencia o bacterias marcadas fluorescentemente suplementado con 60 g / ml VWF y conectarlo al tubo de entrada. Evite las burbujas de aire. Repita los pasos 2.3.5.2 a 2.3.5.3 </li></ol></li><li> Células Endoteliales: <ol><li> Activar las células endoteliales por perfusión con una solución 0,1 mM del Ca 2+ -ionophore A23187 (solución madre 10 mM disueltos en dimetil sulfóxido (DMSO)) en DMEM a la misma velocidad de cizallamiento como la perfusión bacteriana durante 10 min por perfusión con una 0,1 mM. Repita los pasos 2.3.5.2 a 2.3.5.3. </li></ol></li></ol></li><li> Calcula la velocidad de cizallamiento y la tensión de cizallamiento de la siguiente manera. Velocidad de cizallamiento = 6Q / wh 2 Donde: Q: tasa en ml / min, flujo w: Ancho en cm, h: altura en cm Esfuerzo de corte (τ) = rata cizallaex viscosidad (μ) Donde μ: media: 0,01 dinas x seg / cm 2, la sangre total: 0,04 x seg dinas / cm 2 </li><li> Análisis de imagen <ol><li> Obtener imágenes en directo usando un microscopio de fluorescencia invertida con una cámara en blanco y negro y desarrollar el uso de software de imágenes. Utilice el tiempo de exposición de 1,5 seg. Tome varias instantáneas (al menos 15) distribuidas al azar sobre la superficie revestida de la cámara de flujo y guardarlos en el formato de archivo apropiado. </li><li> Realizar análisis de imágenes con ImageJ. Reste el fondo para eliminar fondos continuos suaves de la imagen (Proceso - Antecedentes Resta) y definir el umbral para establecer los valores de umbral inferior y superior, la segmentación de imágenes en escala de grises en las características de interés. Mida la zona limitada al umbral. </li><li> Comparar la adhesión bacteriana, expresado como área fluorescente, por ejemplo, usando software de análisis estadístico. Comparar los grupos usando ANOVA de una vía o two-cola prueba t de Student. Denuncie todos los valores como media ± error estándar de la media (SEM). Considere un valor de p &lt;0,05 significativo (* p &lt;0,05; ** p &lt;0,01; *** p &lt;0,001). </li></ol></li></ol> 3. En Vivo Modelo de perfusión mesentérica <ol><li> Preparación / cirugía del ratón <ol><li> Fast el ratón la noche antes del experimento con el fin de limitar el movimiento intestinal. </li><li> Dale un ratón viejo 6-8 semanas (C57BL / 6) analgesia preoperatoria mediante una inyección subcutánea de buprenorfina (0,1 mg / kg de peso corporal (PC)) 20 a 30 minutos antes de la cirugía. </li><li> Anestesiar el ratón por inyección intraperitoneal de ketamina (125 mg / kg de peso corporal) y xilazina (12,5 mg / kg de peso corporal). Compruebe por reflejo pedal. Aplique un ungüento veterinario para evitar la sequedad. </li><li> Coloque el ratón sobre una almohadilla caliente termo-controlado a 37 ° C en una bandeja microscopio. Dado que este es un procedimiento de terminal, no hay necesidad de una estricta asceptiprocedimientos c. Hacer una incisión cerca de la vena yugular, eliminar suavemente el lado derecho del músculo cervical y aislar la vena yugular del tejido circundante. </li><li> Insertar un catéter intravenoso francesa 2 en la vena yugular derecha para la infusión de bacterias marcadas fluorescentemente u otras soluciones. Abra la cavidad peritoneal a través de una incisión abdominal en la línea media y el uso de hisopos de algodón para difundir el mesenterio y para visualizar el arteriolas mesentéricas y circulación venular. </li><li> Coloque el ratón en el lado derecho en una placa transparente y asegurar la cánula con cinta adhesiva. Utilice una compresa caliente para evitar la hipotermia. Para prevenir la deshidratación del tejido, la caída de 500 l 0,9% de NaCl en los intestinos. </li></ol></li><li> Microscopía de fluorescencia de la adhesión bacteriana a la circulación mesentérica <ol><li> Trabajar en un cuarto oscuro. Use hisopos de algodón para inmovilizar los vasos y visualizarlos en un microscopio invertido. </li><li> Por vía tópica aplicar 5 l de una solución 10 mM of Ca 2+ -ionophore A23187 disolvió en DMSO. Después de 10 seg, inyectar 100 l bacterias marcadas (ver paso 1) a través del catéter yugular. Tomar imágenes con lapso de tiempo. Una vez finalizado el experimento, la eutanasia el ratón de acuerdo con las directrices aprobadas institucionales. </li></ol></li><li> Análisis De Imagen <ol><li> Obtener imágenes en directo utilizando un microscopio de fluorescencia invertida, capturaron con una cámara en blanco y negro y desarrollado utilizando cualquier software de imágenes. Aplicar tiempo de exposición automatizada y el contraste optimización específica para el equipo utilizado. </li><li> Adquirir imágenes con lapso de tiempo utilizando la herramienta de &#39;Adquisición&#39; en la barra de herramientas (Adquisiciones multidimensionales - Tiempo) usando 40 ciclos de 1.000 imágenes / seg. Guarde las imágenes en un formato de archivo de imagen correspondiente. </li><li> Imágenes de proceso utilizando el software de análisis ImageJ para medir el área de la señal fluorescente por imagen. Definir el umbral para establecer los valores de umbral inferior y superior, la segmentación de imágenes en escala de grises en fsticasoperativas de interés. Identificar la región de interés (vaso sanguíneo) y medir el área limitada al umbral y la región de interés. Comparar la adhesión bacteriana, expresado como el área de fluorescencia utilizando cualquier software estadístico o de gráficos. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Vanassche, T., Peetermans, W. E., Herregods, M. C., Herijgers, P., Verhamme, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-thrombotic+therapy+in+infective+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Cardiovasc+Ther%22%5BJournal%5D)">Anti-thrombotic therapy in infective endocarditis.</a> Expert Rev Cardiovasc Ther. 9 (9), 1203-1219 (2011).</li>
<li>Heying, R., van de Gevel, J., Que, Y. A., Moreillon, P., Beekhuizen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin-binding+proteins+and+clumping+factor+A+in+Staphylococcus+aureus+experimental+endocarditis%3A+FnBPA+is+sufficient+to+activate+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Fibronectin-binding proteins and clumping factor A in Staphylococcus aureus experimental endocarditis: FnBPA is sufficient to activate human endothelial cells.</a> Thromb Haemost. 97 (4), 617-626 (2007).</li>
<li>Pappelbaum, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultralarge+von+Willebrand+factor+fibers+mediate+luminal+Staphylococcus+aureus+adhesion+to+an+intact+endothelial+cell+layer+under+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Ultralarge von Willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress.</a> Circulation. 128 (1), 50-59 (2013).</li>
<li>Claes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+Staphylococcus+aureus+to+the+vessel+wall+under+flow+is+mediated+by+von+Willebrand+factor%E2%80%93binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Adhesion of Staphylococcus aureus to the vessel wall under flow is mediated by von Willebrand factor–binding protein.</a> Blood. 124 (10), 1669-1976 (2014).</li>
<li>Thiene, G., Basso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+and+pathogenesis+of+infective+endocarditis+in+native+heart+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathology and pathogenesis of infective endocarditis in native heart valves.</a> Cardiovasc Pathol. 15 (5), 256-263 (2006).</li>
<li>Sixma, J. J., Schiphorst, M. E., Verweij, C. L., Pannekoek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+deletion+of+the+A1+domain+of+von+Willebrand+factor+on+its+binding+to+heparin%2C+collagen+and+platelets+in+the+presence+of+ristocetin%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%2FFEBS%22%5BJournal%5D)">Effect of deletion of the A1 domain of von Willebrand factor on its binding to heparin, collagen and platelets in the presence of ristocetin.</a> Eur J Biochem/FEBS. 196 (2), 369-375 (1991).</li>
<li>Theilmeier, G., Lenaerts, T., Remacle, C., Collen, D., Vermylen, J., Hoylaerts, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+activated+platelets+assist+THP-1+monocytoid%2Fendothelial+cell+interaction+under+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Circulating activated platelets assist THP-1 monocytoid/endothelial cell interaction under shear stress.</a> Blood. 94 (8), 2725-2734 (1999).</li>
<li>Bjerketorp, J., Jacobsson, K., Frykberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+von+Willebrand+factor-binding+protein+%28vWbp%29+of+Staphylococcus+aureus+is+a+coagulase%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">The von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of Staphylococcus aureus is a coagulase.</a> FEMS Microbiol Lett. 234 (2), 309-314 (2004).</li>
<li>Friedrich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylocoagulase+is+a+prototype+for+the+mechanism+of+cofactor-induced+zymogen+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Staphylocoagulase is a prototype for the mechanism of cofactor-induced zymogen activation.</a> Nature. 425 (6957), 535-539 (2003).</li>
<li>Vanassche, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+formation+by+staphylothrombin+facilitates+Staphylococcus+aureus-induced+platelet+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Fibrin formation by staphylothrombin facilitates Staphylococcus aureus-induced platelet aggregation.</a> Thromb Haemost. 107 (6), 1107-1121 (2012).</li>
<li>Vanassche, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+staphylothrombin-mediated+fibrin+deposition+in+catheter-related+Staphylococcus+aureus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The role of staphylothrombin-mediated fibrin deposition in catheter-related Staphylococcus aureus infections.</a> J Infect Dis. 208 (1), 92-100 (2013).</li>
<li>Buerkle, M. A., Lehrer, S., Sohn, H. Y., Conzen, P., Pohl, U., Krötz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+inhibition+of+cyclooxygenase-2+enhances+platelet+adhesion+in+hamster+arterioles+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Selective inhibition of cyclooxygenase-2 enhances platelet adhesion in hamster arterioles in vivo.</a> Circulation. 110 (14), 2053-2059 (2004).</li>
<li>Kim, K. H., Barazia, A., Cho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+heterotypic+platelet-neutrophil+interactions+on+the+activated+endothelium+during+vascular+inflammation+and+thrombus+formation+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice.</a> J Vis Exp. 2 (74), (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El esfuerzo cortante es un factor crucial para la pronta adhesión bacteriana a la pared del vaso y para la posterior generación de endovascular o vegetaciones endocárdicas e infecciones metastásicas 4,5. Hemos descrito complementario in vitro y en modelos in vivo para estudiar la patogénesis de las infecciones endovasculares bajo estrés de cizalla fisiológica. Estos modelos han permitido identificar la proteína de unión del factor de von Willebrand (vWbp) como el principal S. proteína aureus para interactuar bajo flujo con una pared vascular lesionada exponer VWF 4. Infecciones endovasculares y la endocarditis infecciosa, en particular, son motivo de preocupación no sólo por la insuficiencia orgánica inducida por sepsis y muerte, pero también a causa de (&#39;&#39;) metastásicos complicaciones locales y distantes. Para provocar endocarditis infecciosa e infecciones metastásicas, las bacterias tienen que adherirse a la pared del vaso y por lo tanto resistir el esfuerzo cortante de la sangre que fluye. Másestudios sobre bacterias factores de virulencia se han realizado en condiciones estáticas. Sin embargo, estas interacciones establecidas no pueden soportar las fuerzas de corte y estudios en condiciones de flujo puede revelar nuevos factores, no reconocidos previamente en la interacción bacteria-huésped. El uso de la cámara de flujo micro-paralelo, nosotros y otros han demostrado la importancia de FVW de adhesión vascular. Bajo esfuerzo de corte, FVW progresivamente se despliega a partir de su estructura globular de descanso, y expone el dominio A1 que interactúa con las plaquetas a través de su receptor GPIb 6. Cámaras de flujo se han utilizado ampliamente para estudiar la función plaquetaria 7. Sorprendentemente, también S. aureus adherencia bajo flujo requiere VWF, y en particular el dominio A1 que se expone a cizallamiento. Identificamos vWbp para mediar FVW vinculante. vWbp es un coagulasa que contribuye a S. aureus fisiopatología mediante la activación de la protrombina del anfitrión. Staphylothrombin, la resulting complejo de un coagulasa bacteriana y protrombina, convierte el fibrinógeno en fibrina insoluble 8,9. Nuestros estudios han demostrado que vWbp no sólo activar la protrombina, pero desencadena la formación de agregados de bacterias de fibrina-plaquetas, que mejoran la adherencia a los vasos sanguíneos bajo flujo de 4,10,11. El modelo de cámara de flujo in vitro permite estudiar los diferentes actores de la adhesión bacteriana a componentes celulares o matriz. Factores de virulencia bacterianos pueden ser estudiados utilizando mutantes o bacterias inocuas que expresan proteínas de superficie específicas. Alternativamente, los inhibidores farmacológicos o anticuerpos bloqueantes pueden añadirse al medio en la cámara de flujo. El papel de los factores del huésped tales como diferentes constituyentes de la matriz extracelular se puede estudiar mediante el uso de cubreobjetos con diferentes recubrimientos. Los cubreobjetos también pueden ser cubiertos con células endoteliales, de los cuales el estado de activación puede modularse mediante la adición de estimuladores específicos. Apart de la pared vascular, la contribución de las células de la sangre de acogida y las proteínas plasmáticas puede ser estudiada mediante la adición de estos factores al medio que fluye. Por lo tanto, diferentes condiciones de creciente complejidad se pueden estudiar en condiciones estandarizadas de flujo laminar para desentrañar las interacciones que permiten que las bacterias se adhieran a la pared del vaso in vivo. Interacciones identificadas en el modelo in vitro se estudian posteriormente en un modelo animal para probar su relevancia en un organismo complejo. Otros modelos in vivo para estudiar las interacciones dinámicas bajo flujo han sido descritos, tales como la cámara de pliegue cutáneo dorsal de hámster 12 y el modelo 13 cremáster. En comparación, el modelo de perfusión mesentérica descrito aquí ofrece varias ventajas debido a su facilidad de uso, la posibilidad de variar el anfitrión de antecedentes genéticos de los ratones y para evaluar las intervenciones farmacológicas. En conclusión, los modelos descritosofrecer la posibilidad de estudiar las proteínas de superficie no sólo de S. aureus, sino de muchos otros microorganismos en los diferentes orígenes de acogida, para comprender mejor la patogénesis de las infecciones vasculares.

Para establecer infecciones endovasculares, los patógenos requieren un mecanismo para adherirse al endotelio, que recubre la pared de los vasos y la superficie interna del corazón, y para persistir y establecer una infección a pesar de estar expuestos al estrés de cizallamiento de la sangre que fluye rápidamente. El patógeno más frecuente que causa infecciones endovasculares potencialmente mortales y endocarditis infecciosa es el Staphylococcus aureus (S. aureus)1. 
Varias moléculas adhesivas bacterianas unidas a la superficie median la adhesión al tejido huésped al interactuar con los componentes de la matriz extracelular. Estos MSCRAMMs (componentes de superficie microbiana que reconocen moléculas de matriz adhesiva) reconocen moléculas como la fibronectina, el fibrinógeno, el colágeno y el factor de von Willebrand (VWF). Los MSCRAMMs son importantes factores de virulencia de S. aureus y están implicados en la colonización e invasión del huésped2. La mayoría de los estudios sobre estos factores de virulencia se han realizado en condiciones estáticas y, por lo tanto, pueden no ser representativos de las infecciones humanas en las que la adhesión inicial de las bacterias se produce en la sangre que fluye. 
En el caso de las infecciones del torrente sanguíneo, las bacterias necesitan superar las fuerzas de cizallamiento de la sangre que fluye para adherirse a la pared del vaso. Por lo tanto, los modelos que investigan la interacción entre las bacterias y el endotelio o subendotelio en condiciones de flujo son de particular interés. 
Un estudio reciente demostró que la adhesión de S. aureus a los vasos sanguíneos bajo esfuerzo cortante está mediada por VWF3. El VWF, una proteína operativa por estrés de cizallamiento, se libera de las células endoteliales tras la activación. El FVW circulante se une a las fibras de colágeno de la matriz subendotelial expuesta. Nuestro grupo informó que la proteína de unión al factor de von Willebrand (vWbp) de S. aureus es crucial para la adhesión mediada por cizallamiento al VWF4. 
En este artículo, presentamos un modelo de cámara de flujo in vitro donde se puede evaluar la adhesión bacteriana a diferentes componentes de la matriz extracelular o a las células endoteliales. Para validar los hallazgos de los datos in vitro, hemos desarrollado un modelo in vivo que visualiza y cuantifica la interacción directa de las bacterias con la pared del vaso y la formación de trombos bacteriano-plaquetario en la circulación mesentérica de ratones, utilizando microscopía vascular intravital en tiempo real.

<table><tbody><tr><td>Infusión Cerebro-Corazón (BHI)</td><td>BD Plastipak&nbsp;</td><td>237500</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de soja tríptico (TSB)</td><td>Oxoid</td><td>CM0129</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-169</td><td>D-PBS</td></tr><tr><td>5(6)-carboxi-fluoresceína N-hidroxisuccinimidilo éster&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21878-25MG-F</td><td>etiquetado fluorescente&nbsp;</td></tr><tr><td>Fracción V de albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Roch</td><td>10 735 086 001</td><td></td></tr><tr><td>Haemate-P</td><td>CSL Behring</td><td>PL 15036/0010</td><td>VWF</td></tr><tr><td>Horm colágeno</td><td>Takeda</td><td>10500</td><td>colágeno</td></tr><tr><td>1 pocillo cámaras de cultivo celular PCA</td><td>Sarstedt</td><td>94.6140.102</td><td>barbotinas de plástico</td></tr><tr><td>Temgesic</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>283716</td><td>bruprenorfina</td></tr><tr><td>Anesketin (Clorhidrato de ketamina 115 mg/ml (100 mg/ml ketaminum))Eurovet</td><td></td> <td>BE-V136516</td><td>ketamin</td></tr><tr><td>XYL-M 2% (clorhidrato de xilacina 23,32 mg/ml (xilacina 20 mg/ml))</td><td>VMD Arendonk</td><td>BE-V170581</td><td>xilacina</td></tr><tr><td>2 catéter intravenoso francés</td><td>verde Portex</td><td>200/300/010</td><td></td></tr><tr><td>0,9% Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Baxter Healthcare</td><td>W7124</td><td></td></tr><tr><td>algodón hisopos</td><td>International Medical Product</td><td>300230</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+-ionóforo solución A23187</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7522-10 MG</td><td></td></tr><tr><td>calibre 26 jeringa de 1 ml&nbsp; &nbsp;</td><td>BD Plastipak&nbsp;</td><td></td><td></td>300013</tr><tr><td>Jeringa de 1 ml calibre 26&nbsp; con aguja</td><td>BD Plastipak&nbsp;</td><td>300015</td><td>inyección intraperitoneal</td></tr><tr><td>centrífuga 5810-R</td><td>Eppendorf</td><td>5811 000.320</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio (24x50)</td><td>VWR</td><td>BB02405A11</td><td>Espesor No, 1</td></tr><tr><td>PHD 2000 Infusion</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702100</td><td>Bomba de infusión Harvard de alta precisión</td></tr><tr><td>Axio-observer DI</td><td>Carl-Zeiss</td><td>Microscopio</td><td></td></tr> <tr><td>de fluorescencia invertidaImageJ</td><td>Software</td><td></td><td>del Instituto Nacional de Análisis de la Salud</td></tr><tr><td>Graphpad Prism 5,0</td><td>Software Graphpad</td><td>Software de análisis</td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MRm</td><td>Carl-Zeiss&nbsp;</td>Cámara <td></td><td>en blanco y negro</td></tr></tbody></table>

in vitro e in vivo modelo para estudiar la adhesión bacteriana a la pared del recipiente en condiciones de flujo

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

Con el fin de causar infecciones endovasculares y endocarditis infecciosa, las bacterias deben ser capaces de adherirse a la pared del vaso mientras se expone a la tensión de cizallamiento de la sangre que fluye. Para identificar los factores bacterianos y de acogida que contribuyen a la adhesión vascular de los microorganismos, se necesitan modelos apropiados que estudian estas interacciones en condiciones de cizallamiento fisiológicas. Aquí, se describe un modelo in vitro de cámara en flujo que permite investigar la adhesión bacteriana a diferentes componentes de la matriz extracelular o a las células endoteliales, y un modelo de microscopía intravital que fue desarrollado para visualizar directamente la adherencia inicial de las bacterias a la circulación esplácnica in vivo . Estos métodos pueden ser utilizados para identificar los factores bacterianos y del huésped requeridos para la adherencia de las bacterias bajo flujo. Ilustramos la relevancia de la tensión de cizallamiento y el papel del factor von Willebrand para la adhesión de Staphylococcus aureus utilizando tanto el modelo in vitro y in vivo.

S. aureus adhesión a FVW, la matriz subendotelial y las células endoteliales es un fenómeno dependiente de la tensión de cizallamiento Para enfatizar el papel del esfuerzo cortante en la interacción entre S. aureus y VWF, que realizaron perfusiones más de FVW cubreobjetos recubiertos a diferentes velocidades de corte (una visión esquemática del modelo in vitro de perfusión en se da en la figura 1. La adhesión de S. aureus a FVW incrementa con velocidades de cizalla crecientes de 250 seg -1 a 2000 sec -1 (Figura 2), lo que indica que las fuerzas de alto cizallamiento no inhiben pero refuerzan la adhesión de las bacterias a VWF. Con el fin de investigar la contribución de VWF a la adhesión bacteriana a colágeno, el componente principal de la matriz subendotelial, que perfundidos marcado con fluorescencia S. aureus sobre colágeno en presencia o ausencia de VWF. En ausencia de VWF, la adhesión de S. laureus al colágeno disminuye con el aumento de velocidades de cizallamiento. Sin embargo, cuando VWF estaba presente en el medio, la adherencia de S. aureus aumentó con el aumento de las tasas de corte (Figura 3). El modelo de flujo in vitro también nos permite examinar la adhesión de las bacterias a las células endoteliales bajo flujo. Nos perfundidos HUVECs con fluorescencia etiquetados S. aureus a velocidades de cizallamiento de 500 a 2000 seg -1. Donde se indique, HUVECs se activa con un Ca 2+ -ionophore, para provocar la liberación de FVW. La activación de células endoteliales y la posterior liberación VWF, aumento de la adhesión de S. aureus (Figura 4A), que se formó patrones típicos &quot;-cadena como&quot; de marcado con fluorescencia agrupaciones bacterianas alineados en la dirección de la fuerza de corte (Figura 4B), lo que sugiere la unión de bacterias a lo largo de una molécula lineal VWF-estirado. Inicial in vivola adhesión bacteriana en las venas esplácnico está mediada por VWF Desde S. aureus es capaz de adherirse a VWF, hemos utilizado ratones de tipo salvaje (vWF + / +) y VWF-ratones deficientes (vWF - / -) para investigar la adhesión bacteriana a la pared del vaso activado in vivo. Videomicroscopia en tiempo real de las venas esplácnicos permitió la visualización in vivo de la circulación de la etiqueta fluorescente S. aureus (visión general esquemática del modelo de perfusión en vivo se representa en la figura 5). Después de la activación farmacológica del endotelio por el Ca 2+ -ionophore, se observó una rápida acumulación local de las bacterias y los agregados de bacterias individuales a la pared del vaso de ratones WT (Videos suplementario 1 y 2). Se observó casi ninguna adherencia de bacterias en la pared del vaso activada de vWF -deficieratones nt (suplementario Video 3) en comparación con la adhesión en ratones WT (Figura 6). La ausencia de VWF disminuye la capacidad de S. aureus de adherirse a la pared del vaso activado. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig1.jpg" /> Figura 1. Una representación esquemática del modelo de flujo in vitro. El modelo de flujo in vitro es un modelo multifuncional, que permite el estudio de diferentes mecanismos dependientes de cizallamiento tales como la adhesión bacteriana a la matriz subendotelial, sino también la formación de trombos. La cámara de flujo micro-paralelo se coloca sobre un cubreobjetos (de plástico o vidrio) con diferentes recubrimientos de proteínas y células endoteliales. La adhesión de bacterias diferentes (naranja y puntos grises) puede ser analizada, y el impacto de la presencia de las proteínas del plasma, plaquetas y sangre entera puede ser evaluada. Marcadores fluorescentes para plaquetas (óvalos azules) o fibrinogen cadenas (azul) se puede utilizar en combinación con diferentes inhibidores (óvalos negros) para distinguir factores bacterianos y del huésped. Imágenes representativas de la adhesión bacteriana de S. aureus al recubrimiento de colágeno en presencia (inferior) o ausencia (superior) del FVW se muestra (barra de escala es de 100 micras). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig2.jpg" /> Figura 2. La adhesión de S. aureus a los aumentos de FVW con el aumento de velocidades de cizallamiento. Micro-paralelo perfusión cámara de flujo sobre revestido VWF (50 g / ml) con marcado con fluorescencia S. aureus Newman a velocidades de cizallamiento de 250 a 2000 s-1 (s-1) en el medio (n&gt; 5). Todos los resultados se expresan como media ± SEM. * P &lt;0,05, ** p &lt;0,01. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig3.jpg" /> Figura 3. La adhesión de S. aureus a subendotelio es cizallamiento y VWF dependiente. Micro-paralelo perfusión cámara de flujo sobre colágeno recubierto (160 g / ml) con la etiqueta fluorescente S. aureus Newman a velocidades de cizallamiento de 250 a 2000 seg -1 en medio (n&gt; 5). VWF (60 g / ml) estaba presente en el medio donde se indica. Todos los resultados se expresan como media ± SEM. ** P &lt;0,01. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig4.jpg" /> Figura 4. La adhesión de S. aureus a las células endoteliales activadas es cizalla dependiente. perfusión cámara de flujo-Micro paralelo sobre las células endoteliales. (A) las células endoteliales de la vena umbilical humana se activaron con el Ca 2+ -ionophore A23.187 (0,1 mM) seguido de una perfusión de 10 min marcado con fluorescencia S. aureus Newman a velocidades de cizallamiento de 500 a 2000 seg -1 en medio (n&gt; 5). Todos los resultados se expresan como media ± SEM. * P &lt;0,05. (B) Imagen de la micro-cámara de flujo paralelo de perfusión durante HUVECs activadas con S. aureus a una velocidad de cizallamiento de 1000 seg -2. S. aureus forma cadenas de ± 200 micras de longitud, lo que sugiere la adhesión a multímeros de FVW (barra de escala es de 100 micras). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig5.jpg" /> Figura 5. Una visión esquemática del modelo de perfusión mesentérica in vivo. Un catéter en la vena yugular derecha (línea amarilla) está insertada para la administración de fluorbacterias escently marcados (puntos de color naranja), anestésicos adicionales u otros componentes tales como inhibidores farmacéuticos y anticuerpos. La cavidad peritoneal se abre y el mesenterio se extiende para visualizar los vasos sanguíneos (venosos y arteriales) bajo un microscopio de fluorescencia. Después de la activación farmacológica del endotelio por un -ionophore Ca 2+, que induce la liberación de FVW, las bacterias pueden ser inyectados a través del catéter de la vena yugular. Microscopía de vídeo intravascular en tiempo real permite la visualización en vivo de bacterias circulantes marcados con fluorescencia y la formación resultante de bacterias en plaquetas trombos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig6.jpg" /> Figura 6. La adhesión inicial de S. aureusal endotelio activado in vivo está mediada por FVW En vivo venosa modelo perfusión mesentérica con C57BL / 6-FVW + / + y C57BL / 6-vWF -. / - ratones. La adhesión de la etiqueta fluorescente S. aureus a la pared del vaso localmente activado es significativamente menor en vWF - / - ratones. Todos los resultados se expresan como media ± SEM. *** P &lt;0.001, n&gt; 7. <img alt="Vídeo Figura 1" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV1.jpg" /> Video 1: adherencia en tiempo real de S. aureus a la pared del vaso activado en FVW + / + ratones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video1JorienClaes.mov" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo.</a> Video 2: formación de agregados en tiempo real y la embolización de S. aureus en FVW ratones + / +. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video2JorienClaes.mov" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo.</a> <img alt="Vídeo Figura 3" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV3.jpg" /> Video 3: adherencia en tiempo real de S. aureus a la pared del vaso activado en FVW - / -. ratones in vivo modelo de perfusión mesentérica con FVW + / + y vWF - / - ratones. Cinco l de una -ionophore Ca 2+ (10 mM) se aplied a la región de la cama vascular visualizado. Una suspensión de la etiqueta-carboxi-fluoresceína S. aureus se inyectó a través del catéter yugular. La circulación mesentérica se visualizó bajo un microscopio invertido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video3JorienClaes.mov" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo.</a>

Para estudiar la interacción de las bacterias con los vasos sanguíneos sometidos a esfuerzo cortante, se describe una cámara de flujo y un modelo de microscopía mesentérica intravital in vivo que permiten diseccionar los factores bacterianos y del huésped que contribuyen a la adhesión vascular.

In vitro e in vivo modelo para estudiar la adhesión bacteriana a la pared del recipiente en condiciones de flujo

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

El objetivo general del siguiente experimento es investigar la interacción entre las bacterias y el endotelio y subendotelio bajo estrés de cizalladura. Esto se logra mediante la etiquetación fluorescente de bacterias para visualizarlas en tiempo real utilizando microscopía de video como un segundo paso. Se utiliza una cámara de flujo in vitro para estudiar los diferentes participantes involucrados en la adhesión de bacterias en movimiento a componentes celulares o matriciales.A continuación, las interacciones identificadas en el modelo in vitro se estudian en el modelo de perfusión mesentérica in vivo para evaluar su relevancia en un organismo complejo; los resultados muestran que Staphylococcus aureus es capaz de adherirse a células endoteliales activadas y a la subendotelio bajo esfuerzo cortante. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que incluye tanto un modelo in vitro como un modelo in vivo, que son complementarios para estudiar la patogénesis de las infecciones endovasculares bajo esfuerzo cortante. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de las enfermedades infecciosas y la biología vascular, como la forma en que se establecen la endocarditis infecciosa y las infecciones metastásicas bajo esfuerzo cortante fisiológico, demostrando un procedimiento mediante el cual Malin, una técnica especializada en trabajo con animales de nuestro laboratorio, comienza preparando el colorante fluorescente utilizado para rastrear las bacterias.Añada 150 microlitros de una solución fluorescente de carboxi en stock a 850 microlitros de agua de grado de laboratorio y mezcle. Almacene la solución protegida de la luz a menos 20 grados Celsius hasta que sea necesaria. A continuación, haga un pellet de un cultivo de cinco mililitros de S reus.Bacterias cultivadas durante la noche en caldo de soya tripticasa se lavan una vez con PBS y luego se resuspenden. Al nuevo precipitado en 800 microlitros de PBS, añadir 200 microlitros de la solución de colorante para experimentos de perfusión in vitro, o 400 microlitros de la solución de colorante para experimentos in vivo. Cubrir los tubos con papel de aluminio para evitar el blanqueo fotodegradante del colorante e incubar en agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente.A continuación, agregue solución de albúmina sérica bovina al 6 % en PBS a la mezcla para bloquear la unión no específica. Verifique la concentración de células utilizando citometría óptica y diluya las bacterias en PBS a diversas concentraciones según su aplicación. Una vez diluidas, proteja los tubos de la luz y colóquelos en hielo.Diluya el factor von Willebrand en agua de grado de laboratorio hasta una concentración final de 50 microgramos por mililitro. También diluya el colágeno en solución isotónica de glucosa hasta una concentración final de 160 microgramos por mililitro. Luego, agregue 200 microlitros de cada recubrimiento sobre una tira de paraform.Coloque las laminillas sobre las gotas para recubrirlas con las proteínas. Incube las laminillas en un recipiente humedecido durante cuatro horas a temperatura ambiente. Luego, levante cuidadosamente las laminillas del paraform con una aguja roma y monte la laminilla en la parte inferior de una cámara de flujo para experimentos con células endoteliales; recubra laminillas de plástico con un mililitro de una solución al 1 % de gelatina en PBS e incube durante 30 minutos a 37 grados Celsius.Luego, siembre células endoteliales de vena umbilical humana sobre las laminillas de plástico recubiertas con gelatina y cultívelas hasta alcanzar una confluencia del 70 al 80%. Monte la laminilla cubierta con proteína o la laminilla de plástico recubierta con células endoteliales en la parte inferior de la cámara de flujo. A continuación, conecte los tubos de entrada y salida a la parte superior de la cámara de flujo y conecte el tubo de salida a un recipiente de desecho.Coloque suavemente la parte superior de la cámara de flujo sobre la parte inferior y ensamble la cámara de flujo, evitando la formación de burbujas de aire. Inyecte un mililitro de medio a través de la cámara para asegurarse de que no haya fugas y para eliminar el exceso de solución de recubrimiento.A continuación, prepare la bomba de infusión para una jeringa de un mililitro de manera que fluya a 75 microlitros por minuto. Trabajando en una habitación oscura, llene una jeringa de un mililitro con un mililitro de bacterias marcadas con fluorescencia y colóquela en la bomba de infusión. Conecte la salida de la jeringa a la entrada de la cámara de flujo.Asegurándose de evitar burbujas de aire, encienda la bomba de infusión durante 10 minutos a 75 microlitros por minuto. Después de 10 minutos, retire la primera jeringa y conecte una jeringa de un mililitro que contenga PBS o DMEM al tubo de entrada. Inicie la infusión, bombee y enjuague durante 10 minutos para eliminar cualquier bacteria no unida.Una vez enjuagado, mantenga la bomba de infusión encendida y capture al menos 15 imágenes en blanco y negro utilizando un tiempo de exposición de 1,5 segundos en ubicaciones aleatorias distribuidas sobre la superficie recubierta de la cámara de flujo. Utilizando un programa de análisis de imágenes como Image J, reste el fondo para eliminar los fondos continuos y suaves de la imagen y defina el umbral para establecer los valores umbral inferior y superior, lo que segmenta las imágenes en escala de grises en las características de interés. A continuación, mida el área limitada al umbral recién creado y guarde este valor, conocido como área fluorescente, para cada muestra.Sometió a ayuno a ratones de ocho semanas de edad la noche anterior al experimento para reducir el movimiento intestinal. El día del experimento, comience inyectando 0,1 miligramos de buprenorfina por kilogramo de peso corporal como analgésico. A continuación, anestesie al ratón y aplique pomada en los ojos.Coloque el ratón sobre la placa calefactora con control térmico bajo el microscopio estereoscópico y verifique que el ratón no muestre reflejo plantar. Realice una incisión de un centímetro paralela a la vena yugular. Retire el músculo cervical derecho y luego aísle la vena yugular del tejido circundante.Inserte un catéter intravenoso de dos French en la vena yugular derecha y asegúrelo en su lugar mediante puntos de sutura. A continuación, realice una incisión abdominal en línea media para abrir la cavidad peritoneal. Coloque al ratón sobre su lado derecho sobre una placa transparente y asegure la cánula con cinta adhesiva.Extraiga suavemente los intestinos utilizando hisopos de algodón y extienda el mesenterio. Para visualizar la circulación arteriolar y venular mesentérica. Coloque una bolsa térmica sobre el ratón para prevenir hipotermia y agregue 500 microlitros de NaCl 0,9 % sobre los intestinos cada 30 minutos para evitar la deshidratación del tejido.Utilice hisopos de algodón para inmovilizar los vasos y visualizarlos bajo un microscopio invertido. A continuación, aplique tópicamente cinco microlitros de una solución de 10 milimolares de ionóforo de calcio cuatro disuelto en DMSO. Esto activará la liberación del factor de Von Willebrand por las células endoteliales de los vasos.Después de 10 segundos, inyecte 100 microlitros de las bacterias marcadas con fluorescencia a través del catéter yugular. En ese momento, comience a tomar imágenes de lapso de tiempo; adquiera las imágenes de lapso de tiempo utilizando la herramienta de adquisición en la barra de herramientas, con 40 ciclos de 1000 imágenes por segundo. Una vez que finalice la adquisición de imágenes, sacrifique al ratón de acuerdo con las normas institucionales.Guarde las imágenes en un formato de archivo de imagen adecuado y luego procese las imágenes utilizando el software de análisis ImageJ, como se describió previamente, para resaltar el papel del esfuerzo cortante en la adhesión bacteriana. Se realizaron perfusiones de Staphylococcus aureus a diferentes tasas de corte sobre laminillas recubiertas con factor de Von Willebrand. A medida que aumentan las tasas de corte, también aumenta la adhesión bacteriana, lo que indica que las fuerzas de corte elevadas no inhiben, sino que refuerzan la adhesión de las bacterias a la proteína. En ausencia del factor de Von Willebrand, la adhesión de Staphylococcus aureus al colágeno disminuyó con el aumento de las tasas de corte.Sin embargo, cuando el factor de Von Vand estaba presente en el medio, la adhesión de las bacterias aumentó con tasas de cizallamiento crecientes; las células endoteliales activadas con un ionóforo de calcio para liberar el factor Vand mostraron una adhesión bacteriana significativamente mayor que las células no activadas. Además, las bacterias formaron patrones típicos en forma de cadenas de agrupaciones bacterianas marcadas con fluorescencia que se alinearon en la dirección de la fuerza de cizallamiento, lo que sugiere la unión de bacterias a lo largo de una molécula de VWF estirada linealmente. Para probar el efecto del factor de Von Vbr in vivo, las células endoteliales de la circulación mesentérica fueron activadas para liberar el factor de Von Vbr, y luego se introdujeron bacterias marcadas con fluorescencia en la corriente sanguínea. Las bacterias se adhirieron localmente a la pared vascular activada y formaron agregados.Después de ver este video, debería tener una mejor comprensión sobre cómo investigar la interacción entre las bacterias y la pared del vaso sanguíneo bajo tensión de cizallamiento, marcando fluorescentemente las bacterias y visualizándolas tanto en una cámara de flujo in vitro como en un modelo de perfusión mesentérica intravital in vivo. Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de las infecciones cardiovasculares exploren la interacción entre patógenos y la pared del vaso sanguíneo en la endocarditis infecciosa y en las infecciones metastásicas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este es un método para visualizar adhesión de los leucocitos con el endotelio en cosechados recipientes a presión. La técnica permite el estudio de adhesión vascular en el flujo de corte con diferentes presiones intraluminales hasta 200 mmHg por lo tanto imitan-ción de las condiciones fisiopatológicas de la hipertensión arterial.

Imágenes de la adhesión de leucocitos al endotelio vascular en la presión intraluminal de alta

Durante el proceso de infección, un paso clave es la adhesión de los patógenos con las células huésped. En la mayoría de los casos este paso la adhesión se produce en presencia de la tensión mecánica generada por el flujo de líquidos. Se describe una técnica que presenta el esfuerzo cortante como un parámetro importante en el estudio de la adhesión bacteriana.

La introducción de la tensión de cizallamiento en el Estudio de la adhesión bacteriana

Fuente: Ditkowski, B., et al. Un modelo in vitro de un sistema de perfusión de placas paralelas para estudiar la adherencia bacteriana a tejidos de injerto. J. Vis. Exp. (2019).Este vídeo demuestra el método de utilizar una cámara de flujo de placas paralelas para perfundir bacterias marcadas con fluorescencia sobre tejidos de injertos vasculares, permitiendo un análisis controlado de la adhesión bacteriana y la patogénesis temprana bajo condiciones de flujo cortante.

Modelo in vitro de flujo paralelo de placas para estudiar la adhesión bacteriana en una biopsia tisular

Fuente: Calatayud Arroyo, M., et al. Evaluación de la viabilidad de un consorcio bacteriano sintético en la interfaz intestino-microbio in vitro. J. Vis. Exp. (2018).Este vídeo demuestra un modelo intestino-microbio in vitro para estudiar la viabilidad bacteriana. Se incuba un cocultivo de células Caco-2 y HT29-MTX con bacterias pretratadas bajo condiciones digestivas simuladas. Se evalúa la integridad de la barrera epitelial utilizando resistencia eléctrica transepitelial, y se recogen...

Modelo intestinal in vitro para evaluar la adhesión bacteriana e internalización

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

Presentamos un método in vitro que permite cuantificar el número real de células adhesivas dentro de una monocapa de células endoteliales.

La cuantificación de la adhesividad de la célula endotelial<em&gt; In Vitro</em

Leucocitos con avidez interactúan con las células vasculares y las plaquetas después de lesión de pared del recipiente o durante la inflamación. Aquí, describimos un análisis sencillo basado en el flujo laminar para caracterizar los mecanismos moleculares que subyacen a las interacciones entre los leucocitos y sus socios celulares.

Ensayos de flujo laminar para investigar el reclutamiento leucocitario en cultivos de células vasculares y las plaquetas adherentes

Describimos un interno diseñado en vitro cámara modelo de flujo, que permite la investigación de la adherencia bacteriana a los tejidos de injerto.

Un modelo In Vitro de un sistema de placas paralelas de la perfusión para el estudio de adherencia bacteriana a los tejidos de injerto

Presentamos un modelo de enfermedad vascular in vitro para investigar interacciones sanguíneas enteras con endotelio derivado del paciente. Este sistema permite el estudio de las propiedades trombogénicas de las células endoteliales primarias en diversas circunstancias. El método es especialmente adecuado para evaluar la trombogenicidad in situ y la terapia de anticoagulación durante diferentes fases de la coagulación.

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

Aprende a estudiar la adhesión bacteriana a la pared vascular bajo estrés de cizallamiento usando modelos in vitro e in vivo con Staphylococcus aureus. Este método permite visualizar en tiempo real las interacciones patógeno-hospedador.

In vitro e in vivo modelo para estudiar la adhesión bacteriana a la pared del recipiente en condiciones de flujo

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