Implementación de In Vitro Droga Resistencia Ensayos: Maximizar el Potencial de Descubrimiento clínicamente relevantes mecanismos de resistencia

El objetivo general de este procedimiento es facilitar el descubrimiento preclínico rápido de variantes de un solo nucleótido clínicamente relevantes que puedan impulsar funcionalmente la resistencia a varias clases de terapias. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la oncología, como qué mutaciones genéticas pueden contribuir a la resistencia funcional a las terapias en la clínica que, en última instancia, pueden guiar la mejora de las terapias y las estrategias alternativas de tratamiento clínico para los pacientes resistentes a los medicamentos. La principal ventaja de esta técnica es que, dado que estamos facilitando la aparición de mutaciones espontáneas y aplicando una tecnología de cribado no sesgada en clones resistentes, existe una mayor probabilidad de que estas variantes estén impulsando terapias dirigidas a la recaída en la clínica.

Demostrando el procedimiento estará un investigador muy talentoso de mi laboratorio para evaluar el GI 50 para líneas celulares. Prepare una placa de ensayo sembrando células en transparente no transparente. Placas inferiores de 96 pocillos en 100 microlitros de medio celular de acuerdo con el mapa que se muestra aquí.

Prepare una placa de control de manera similar, agregando celdas a los pocillos azules y solo medianos a los pocillos blancos. Después de incubar las placas a 37 grados centígrados durante la noche, equilibre el reactivo de viabilidad de la célula luminiscente a temperatura ambiente y mezcle suavemente invirtiendo. Para obtener una solución homogénea, agregue 80 microlitros de reactivo a los pocillos de la placa de control y agite el contenido durante 30 minutos.

Para inducir la lisis celular. Utilice un luminómetro con una exposición de 0,1 a 1,0 segundos y una longitud de onda de detección de 560 nanómetros para registrar la luminiscencia. A continuación, para agregar los compuestos de prueba a las placas de ensayo, realice una serie de diluciones de uno de cada cuatro compuestos en DMSO comenzando con una concentración de 2000 micromolares para un total de 10 diluciones.

A continuación, añada los compuestos diluidos en serie al medio para hacer una mezcla de compuesto medio a una concentración final de 10 veces. Guarde la placa compuesta a menos 20 grados centígrados para usarla en el tercer día del ensayo. A continuación, agregue 10 microlitros de los compuestos diluidos a las células por triplicado de modo que la dosis más alta sea de 10 micromolares.

Incubar las placas a 37 grados centígrados durante tres días. El tercer día, prepare una mezcla mediana compuesta de 400 microlitros one X utilizando las placas compuestas preparadas tres días antes. Invierta las placas de ensayo para eliminar el medio y seque con toallas de papel de autoclave dos o tres veces.

Agregue un x compuesto al pozo sombreado en azul y agregue 100 microlitros de pozo medio a los pozos perimetrales para evitar la evaporación. En el sexto día, evalúe el número relativo de células viables tomando una lectura de luminiscencia como se muestra anteriormente en el video. A continuación, calcule los valores de GI 50 utilizando un software como PRISM, utilizando los valores de GI 50 calculados, configure las células para los ensayos de resistencia a los medicamentos.

Si se trabaja con un agente citostático, siembre células a 30 a 40% de confluencia en placas de cultivo cuadradas de 150 milímetros. Si trabaja con un agente tóxico, observe las células a una confluencia del 70 al 80%. Después de determinar las concentraciones iniciales de compuestos de acuerdo con el protocolo de texto, trate las células con los compuestos de prueba para compuestos altamente tóxicos, que causan la muerte celular en un ensayo de viabilidad de seis días.

Comience con el GI 50 y aumente gradualmente la concentración cada dos o tres semanas hasta que se observe una resistencia robusta. Para aislar clones de células individuales, utilice la microscopía de contraste de fase con un aumento de 40x para examinar la placa de cultivo e identificar grupos viables de células en la parte inferior de la placa. Use un bolígrafo para marcar clones que sean de tamaño promedio y que estén bien aislados de otras colonias para seleccionar clones con una pipeta P 200.

Retire el medio de crecimiento del plato y use un XPBS para enjuagar las células flotantes. Con la punta de la pipeta, levante los clones y transfiéralos a los pocillos de una placa de 48 pocillos que contiene 50 microlitros de tripsina al 0,25% e incube a 37 grados centígrados durante uno o dos minutos. A continuación, añadir 200 microlitros de medio fresco con la mitad de la concentración de compuesto para permitir una recuperación óptima de las células.

Para aislar los clones utilizando discos de clonación de tres milímetros, coloque los discos en una placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros que contenga cinco mililitros de 0,25% de trips en EDTA durante dos minutos. A continuación, aspire el medio de la placa que contiene los clones resistentes y superponga los clones con los trips y los discos de clonación empapados. Incuba a 37 grados centígrados durante uno o dos minutos, dependiendo de la facilidad con la que los clones se levanten de las placas.

Luego, usando pinzas estériles, recoja los discos de clonación y transfiéralos a placas de 48 pocillos con 200 microlitros de medio fresco, y haga que la concentración de compuesto suba y baje suavemente para desalojar las células de los discos de clonación e incubar a 37 grados durante la noche del día siguiente, retire los discos de clonación, incube las células, A continuación, evalúe la resistencia a los medicamentos. De acuerdo con el protocolo de texto, como se muestra aquí, el HCT 16 células fueron tratadas durante un período prolongado con citotóxico. El compuesto número uno condujo a la aparición espontánea de clones resistentes que continuaron creciendo durante el tratamiento.

Los clones se seleccionaron con un hombre pipeta. En esta figura, los clones resistentes del uno al tres demostraron una resistencia significativa al compuesto número uno, y a su compuesto análogo cercano número dos, mientras que todos los clones mostraron sensibilidad a un compuesto citotóxico no relacionado. Velcade. Tras la confirmación de la resistencia fenotípica, se aisló el GDNA y se sometió a un análisis de secuenciación del exoma completo.

Las variantes estructurales que eran recurrentes y tenían el potencial de impacto funcional fueron confirmadas por una herramienta de secuenciación independiente como la secuenciación de Sanger. Un ejemplo que se muestra aquí portaba una mutación heterocigota con cambio de sentido, y la línea celular parental fue posteriormente modificada para expresar el CDNA mutado. Mientras que la sobreexpresión del tipo salvaje CDNA no logró conferir resistencia a los medicamentos.

El mutante CD NA confirió significativamente resistencia fenotípica al compuesto número uno, lo que confirma el papel funcional de la variación estructural como impulsor de la resistencia. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo desarrollar un crecimiento resistente espontáneo para detectar los genes que son responsables de la resistencia a los medicamentos en las células cancerosas después de su desarrollo. Esta técnica abre el camino para que los investigadores en el campo de la oncología exploren los mecanismos de resistencia a los fármacos de forma imparcial tanto en líneas celulares de cáncer como en modelos animales.