Name: Ratón directa Trauma / Burn modelo de osificación heterotópica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Aprende a inducir osificación heterotópica en ratones mediante tenotomía de Aquiles y quemadura del 30% sin factores exógenos. Este modelo permite estudiar la formación ósea ectópica postraumática durante cinco a nueve semanas.

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Agradecemos a Amanda Fair, la CMI, y Kathy Sweet y la ORL de UM por su ayuda con las imágenes y análisis de μCT. Financiación: BL financiado por 1K08GM109105-01 y el Premio Nacional de la Fundación de Cirugía Plástica.

Declaración de Ética: Todos los animales procedimientos se llevaron a cabo en estricta conformidad con las buenas prácticas de los animales como se define en las directrices establecidas en la Guía para el Uso y Cuidado de Animales de Laboratorio: Octava edición del Instituto de Investigación de Animales de Laboratorio (ILAR, 2011) y fueron aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Michigan (PRO0001553). 1. Ratón Procedimientos Quirúrgicos NOTA: El uso de 8-10 semanas de edad C57BL / 6 ratones. Otros edades, orígenes y cepas de ratones también se pueden utilizar para probar diferentes condiciones o genética. Para la parte tenotomía del procedimiento, mantener condiciones estériles usando mascarilla, capo de cabello y bata estéril, guantes, y los instrumentos. Sitios quirúrgicos se deben preparar de forma estéril con povidona yodada y drapeado estéril. Evite la hipotermia utilizando una almohadilla térmica veterinaria y el calentamiento de soluciones de reanimación a 37 ° C antes de ADMINISTRAción. <ol><li> Anestesiar al ratón usando 2,5% de isoflurano inhalado. Use un cono de la nariz para dejar el dorso y extremidades traseras de fácil acceso. Ajustar la velocidad de administración de isoflurano para mantener la tasa respiratoria apropiada y la coloración de las membranas mucosas y para asegurar la anestesia mediante la comprobación del tono muscular, pizca dedo del pie, y el reflejo corneal. Aplicar pomada oftálmica sosa para los ojos del ratón para evitar lesiones en los ojos secos durante el procedimiento. Mantener la temperatura corporal adecuada utilizando una almohadilla térmica veterinaria o caliente de recirculación de agua debajo del campo quirúrgico. </li><li> Administrar buprenorfina, 0.1 mg / kg, por vía subcutánea inmediatamente antes de la cirugía para la analgesia. </li><li> Estrechamente afeitar el sitio quirúrgico en la pata trasera izquierda usando máquinas de cortar desde el talón hasta la rodilla. </li><li> Estrechamente afeitar el dorso del ratón, comenzando sobre la columna vertebral y que se extiende el área afeitada a la izquierda de la línea media dorsal, la limpieza de un área de al menos 2 cm x 3 cm para acomodar la lesión por quemadura. </li><li>Preparar el lugar de la cirugía, incluyendo la pata trasera de la rodilla utilizando 3 alternas friega-povidona yodada. </li><li> Realice una incisión longitudinal a lo largo de la cara medial del tendón de Aquiles izquierdo. Extienda la incisión por lo que el tendón de Aquiles se puede visualizar fácilmente; aproximadamente 0,5 cm. </li><li> Realizar una tenotomía de Aquiles con disección aguda del tendón en el punto medio con unas tijeras afiladas tejido. Inserte una hoja de la tijera de tejido en el plano de tejido debajo de la tendón y diseccionar lo largo del plano hasta que la hoja es en el punto medio del tendón. Cierre las hojas de las tijeras para cortar el tendón bruscamente. NOTA: Asegúrese de que la inclusión de todos los tendones posteriores incluyendo gastrocnemio, sóleo y tendones Plantaris. </li><li> Lograr la hemostasia mediante la aplicación de presión con una gasa estéril (debe haber sangrado mínimo) y cerrar la incisión de la piel con una puntada 5-0 vicryl. </li><li> Realice el dorsal quemadura de espesor parcial con un bloque de aluminio con un peso de 35 g con MEDICIÓN aproximadasts 2 cm x 2 cm x 3 cm se calentó a 60 ° C en un baño de agua aplicada a la dorso afeitada del ratón para 17 seg. NOTA: Lograr la profundidad de la quemadura apropiado por el bloque descansando en la parte superior del ratón anestesiado, asegurando que toda el área de superficie del bloque se encuentra en contacto con el ratón, sin embargo evitar la aplicación de cualquier presión adicional para el bloque, es decir, permitir que la gravedad para ser la única fuerza que sostiene el bloque en su lugar. Un mango de plástico delgado unido a un lado del bloque es conveniente para la manipulación, la estabilización y recuperación del baño de agua caliente. Esto creará un área de superficie corporal total, aproximadamente el 30% se quema en un 8-10 semanas de edad C57BL / 6 mouse. Esta quemadura contacto fue elegido sobre otros métodos (llama quemadura o escaldadura) debido a la uniformidad de la profundidad de la quemadura sobre la herida y la reproducibilidad entre los animales. </li><li> Seque el lugar de la quemadura con una gasa y aplicar un apósito Tegaderm. </li><li> Administrar fluidos de resucitación calentado: Ringer lactato solución de 1 mlinyección intraperitoneal y 0,5 ml de la inyección subcutánea. Esta administración de una sola vez de la reanimación es adecuado para la recuperación de la lesión por quemadura y tenotomía. NOTA: No devuelva ratones anestesiados a las jaulas de vivienda con otros ratones, casa individualmente en jaulas limpias bajo vigilancia hasta que los ratones están totalmente recuperados. Recuperación típica se produce dentro de 1-6 horas. Sitios de quemaduras generalmente sanan dentro de 2-4 semanas y rara vez se complican por infección de la herida si se mantiene en entornos de vivienda limpias. </li><li> Administrar buprenorfina 0,1 mg inyección subcutánea / kg cada 12 horas durante 3 días después del procedimiento. Monitorear el crecimiento HO con exploraciones μCT serie a intervalos apropiados. El crecimiento del hueso ectópico es evidente por primera vez alrededor de 3 semanas después de la operación por μCT. NOTA: La mayoría de desarrollo HO es completa por 9 semanas después de la operación. No hemos observado una diferencia en el volumen de HO o ubicación con repetidas μCT escanea dos veces por semana durante 15 semanas en comparación a un solo punto final μCT escanear a las 15 semanas.Al final de los experimentos, la eutanasia de todos los ratones con inhalación de CO2 de acuerdo con las directrices institucionales y comprobar la muerte con dislocación cervical después de 10 min. </li></ol> 2. μCT Adquisición y Análisis <ol><li> Asegure el ratón anestesiado en el escáner en la posición prona. Pegue las patas traseras firmemente a la cama para evitar respirar artefacto de movimiento. Incluya el aire, el agua y la hidroxiapatita contiene fantasma bajo el ratón para la calibración de imagen. </li><li> Abra el software de análisis de hueso y definir una región de interés (ROI) que abarca ambas extremidades traseras de la articulación de la cadera proximalmente a la punta de la pata trasera distalmente. Obtener una imagen utilizando los siguientes parámetros:. 80 kV, 500 mu y 1.300 milisegundos de exposición, 48 micras de tamaño voxel 14,15 </li><li> Calibre la imagen para unidades Hounsfield (UH) dibujando un retorno de la inversión en cada una de las tres cámaras de fantasmas y la introducción de la densidad media en los campos apropiados enEl software. </li><li> Con la herramienta &quot;capturador&quot; en el software, vuelva a orientar la imagen para la tibia de la extremidad posterior izquierda es paralelo a lo largo del eje Z para permitir la vista anatómico más clara para la delimitación de las estructuras óseas corticales ortotópico y HO. </li><li> Comenzando en la rodilla, desplácese distalmente a través de los cortes de imagen hasta que se encuentre HO. Con la herramienta spline manual, hacer un retorno de la inversión alrededor del hueso ectópico en cada 5º rebanada continua distalmente a través de la pata o hasta HO ha sido superado. Utilice la herramienta de extrapolar para ampliar y unir las regiones de interés juntos en un retorno de la inversión que contiene toda la HO. </li><li> Hacer un ROI 3D y elegir el menú de análisis. Calcule el volumen de hueso mediante el establecimiento de los valores inferior y superior de umbral que mejor muestran la ventana de hueso. Utilice los mismos valores de umbral fijados para todos los análisis. </li></ol>

<ol><li>Leblanc, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP-9-induced+muscle+heterotopic+ossification+requires+changes+to+the+skeletal+muscle+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">BMP-9-induced muscle heterotopic ossification requires changes to the skeletal muscle microenvironment.</a> J Bone Miner Res. 26 (6), 1166-1177 (2011).</li>
<li>Shore, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoinductive+signals+and+heterotopic+ossification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Osteoinductive signals and heterotopic ossification.</a> J Bone Miner Res. 26 (6), 1163-1165 (2011).</li>
<li>Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+progenitors+resident+in+the+skeletal+muscle+interstitium+exhibit+robust+BMP-dependent+osteogenic+activity+and+mediate+heterotopic+ossification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification.</a> J Bone Miner Res. 27 (5), 1004-1017 (2012).</li>
<li>Potter, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+ossification+following+combat-related+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Joint+Surg+Am%22%5BJournal%5D)">Heterotopic ossification following combat-related trauma.</a> J Bone Joint Surg Am. 92, Suppl 2. 74-89 (2010).</li>
<li>Van den Bossche, L., Vanderstraeten, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+ossification%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Rehabil+Med%22%5BJournal%5D)">Heterotopic ossification: a review.</a> J Rehabil Med. 37 (3), 129-136 (2005).</li>
<li>Chakkalakal, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Acvr1+R206H+knock-in+mouse+has+fibrodysplasia+ossificans+progressiva%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">An Acvr1 R206H knock-in mouse has fibrodysplasia ossificans progressiva.</a> J Bone Miner Res. 27 (8), 1746-1756 (2012).</li>
<li>Yu, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+type+I+receptor+inhibition+reduces+heterotopic+%5Bcorrected%5D+ossification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic [corrected] ossification.</a> Nat Med. 14 (12), 1363-1369 (2008).</li>
<li>Culbert, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alk2+regulates+early+chondrogenic+fate+in+fibrodysplasia+ossificans+progressiva+heterotopic+endochondral+ossification%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Alk2 regulates early chondrogenic fate in fibrodysplasia ossificans progressiva heterotopic endochondral ossification.</a> Stem Cells. 32 (5), 1289-1300 (2014).</li>
<li>Dinther, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALK2+R206H+mutation+linked+to+fibrodysplasia+ossificans+progressiva+confers+constitutive+activity+to+the+BMP+type+I+receptor+and+sensitizes+mesenchymal+cells+to+BMP-induced+osteoblast+differentiation+and+bone+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">ALK2 R206H mutation linked to fibrodysplasia ossificans progressiva confers constitutive activity to the BMP type I receptor and sensitizes mesenchymal cells to BMP-induced osteoblast differentiation and bone formation.</a> J Bone Miner Res. 25 (6), 1208-1215 (1359).</li>
<li>Peterson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burn+injury+enhances+bone+formation+in+heterotopic+ossification+model%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">Burn injury enhances bone formation in heterotopic ossification model.</a> Ann Surg. 259 (5), 993-998 (2014).</li>
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<li>Tannous, O., Griffith, C., O'Toole, R. V., Pellegrini, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+ossification+after+extremity+blast+amputation+in+a+Sprague-Dawley+rat+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Trauma%22%5BJournal%5D)">Heterotopic ossification after extremity blast amputation in a Sprague-Dawley rat animal model.</a> J Orthop Trauma. 25 (8), 506-510 (2011).</li>
<li>Tannous, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+bone+formation+about+the+hip+undergoes+endochondral+ossification%3A+a+rabbit+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Orthop+Relat+Res%22%5BJournal%5D)">Heterotopic bone formation about the hip undergoes endochondral ossification: a rabbit model.</a> Clin Orthop Relat Res. 471 (5), 1584-1592 (2013).</li>
<li>Peterson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+heterotopic+ossification+through+remote+ATP+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment of heterotopic ossification through remote ATP hydrolysis.</a> Sci Transl Med. 6 (255), 255ra132(2014).</li>
<li>Peterson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+detection+of+burn+induced+heterotopic+ossification+using+transcutaneous+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Early detection of burn induced heterotopic ossification using transcutaneous Raman spectroscopy.</a> Bone. 54 (1), 28-34 (2013).</li>
<li>Perosky, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+detection+of+heterotopic+ossification+using+near-infrared+optical+imaging+reveals+dynamic+turnover+and+progression+of+mineralization+following+Achilles+tenotomy+and+burn+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Early detection of heterotopic ossification using near-infrared optical imaging reveals dynamic turnover and progression of mineralization following Achilles tenotomy and burn injury.</a> J Orthop Res. 32 (11), 1416-1423 (2014).</li>
<li>Peterson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Aging+on+Osteogenic+Response+and+Heterotopic+Ossification+Following+Burn+Injury+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Effects of Aging on Osteogenic Response and Heterotopic Ossification Following Burn Injury in Mice.</a> Stem Cells Dev. , (2014).</li>
<li>Alfieri, K. A., Forsberg, J. A., Potter, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blast+injuries+and+heterotopic+ossification%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+and+Joint+Research%22%5BJournal%5D)">Blast injuries and heterotopic ossification.</a> Bone and Joint Research. 1 (8), 174-179 (2012).</li>
<li>Hunt, J. L., Arnoldo, B. D., Kowalske, K., Helm, P., Purdue, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+ossification+revisited%3A+a+21-year+surgical+experience%5BTitle%5D)+AND+%22J+Burn+Care+Res%22%5BJournal%5D)">Heterotopic ossification revisited: a 21-year surgical experience.</a> J Burn Care Res. 27 (4), 535-540 (2006).</li>
<li>Ring, D., Jupiter, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Operative+release+of+ankylosis+of+the+elbow+due+to+heterotopic+ossification.+Surgical+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Joint+Surg+Am%22%5BJournal%5D)">Operative release of ankylosis of the elbow due to heterotopic ossification. Surgical technique.</a> J Bone Joint Surg Am. 86-A, Suppl 1. 2-10 (2004).</li>
<li>Crane, N. J., Polfer, E., Elster, E. A., Potter, B. K., Forsberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopic+analysis+of+combat-related+heterotopic+ossification%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopic analysis of combat-related heterotopic ossification.</a> Bone. 57 (2), 335-342 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar

La osificación heterotópica representa un importante deterioro funcional que enfrentan los pacientes que sufren traumatismos, quemaduras y procedimientos musculoesqueléticos invasivos. La población de mayor riesgo son los soldados en conflictos modernos con lesiones graves por explosiones causadas por mecanismos como artefactos explosivos improvisados (IED). 18 La mejora de los chalecos antibalas y las unidades médicas posicionadas en la parte delantera permiten mejorar la supervivencia de las lesiones grave...

La osificación heterotópica (HO) es la formación de hueso ectópico en el que se induce de forma aberrante a células osteopotentes a formar hueso endocondral fuera del esqueleto. Si bien los detalles de la vía de formación de HO aún se desconocen en gran medida, un paradigma aceptado incluye tres factores clave: un incidente incitador inflamatorio, un nicho permisivo y células madre mesenquimales capaces de formar hueso. 1-3 HO es una comorbilidad común que complica más del 60% de las lesiones por quemaduras graves, el 65% de las lesiones relacionadas con el combate y el 10% de los casos de cirugía ortopédica invasiva. 4,5 Sin embargo, a menudo es difícil predecir dónde se formará el HO porque puede ocurrir en sitios de lesión local o en lugares distantes que de otro modo podrían no estar lesionados. Esta variabilidad en la localización dificulta la intervención profiláctica para prevenir la formación de hueso reactivo de forma localmente dirigida. También existen formas congénitas de HO, como la fibrodisplasia osificante progresiva (FOP), en las que los pacientes son propensos al desarrollo de HO robusta en respuesta a un traumatismo menor o a una lesión inflamatoria. Potentes modelos animales utilizando ratones transgénicos han reproducido este fenotipo y han proporcionado información sobre las vías moleculares que también pueden ser importantes en la HO inducida por traumas.6-9 La investigación traslacional sobre la patogénesis de la HO no congénita ha utilizado una amplia variedad de constructos que van desde la lesión sola hasta la implantación de materiales y/o células osteoinductivas exógenas. De 10 a 13 años
En nuestro trabajo anterior hemos validado un modelo simple y fiable de la formación de HO en ratones que no requiere la administración de ningún material exógeno. 14-17 Este modelo creó dos condiciones clave para iniciar la HO: el trauma local y la inflamación global. Esto se logró mediante el uso de una tenotomía de Aquiles (traumatismo local) combinada con una lesión por quemadura a distancia (inflamación global). Los ratones recibieron ambos tratamientos simultáneamente y se descubrió que desarrollaban una cantidad robusta de HO que podía analizarse por medios histológicos, radiológicos y moleculares. Curiosamente, las lesiones por quemaduras concurrentes aumentaron significativamente la cantidad de HO que se formaba y aceleraron su curso temporal de desarrollo. 14-16 HO se desarrollaron en sitios predecibles alrededor del calcáneo, la articulación del tobillo y la tibia/peroné de la extremidad que recibió la tenotomía. La fiabilidad del desarrollo de HO en un lugar conocido permitió un examen centrado en las características moleculares e histológicas en las primeras etapas de la osificación ectópica. 14,17 Hasta la fecha, el 100% de los ratones (más de 50 animales) con una tenotomía y una lesión por quemadura concurrente han desarrollado HO. Además, se realizaron imágenes longitudinales en 2D y 3D y análisis espectroscópicos para examinar el patrón de crecimiento y la composición bioquímica del HO.15,16

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 ratones</td><td>Jackson Laboratory</td><td>664</td><td>8-10 semanas de edad</td></tr><tr><td>Isoflurano &ndash; Fluriso</td><td>VET one, Boise, ID</td><td>V1 501017</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina &ndash; Buprenex</td><td>Reckitt Benckiser Healthcare NDC</td><td>12496-0757-1</td><td>0,3 mg/ml solución</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Owens and Minor, Mechanicsville, VA</td><td>2047PVP202</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Suturas de vicryl</td><td>Ethicon, Summerville, NJ</td><td>J493</td><td></td></tr><tr><td>Tegaderm Film, 6 cm x 7 cm</td><td>3M</td><td>1624W</td><td>Cortado por la mitad para cubrir adecuadamente el sitio de la quemadura</td></tr><tr><td>&micro; CT - GE eXplore Locus SP</td><td>GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, Londres, ON, Canadá</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microview 2.2 Aplicación de análisis óseo avanzado</td><td>GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, Londres, ON, Canadá</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ratón directa trauma / burn modelo de osificación heterotópica

Direct Mouse Trauma/Burn Model of Heterotopic Ossification

La osificación heterotópica (HO) es la formación de hueso fuera del esqueleto que se forma después de un traumatismo importante, lesiones por quemaduras y procedimientos quirúrgicos ortopédicos. La mayoría de los modelos animales utilizados para estudiar la HO se basan en la aplicación de sustancias exógenas, como la proteína morfogenética ósea (BMP), construcciones celulares exógenas o mutaciones genéticas en la señalización de BMP. Si bien estos modelos son útiles, no reproducen con precisión los estados inflamatorios que causan la mayoría de los casos de HO. Aquí describimos un modelo de quemadura/tenotomía en ratones que produce de forma fiable un HO focalizado. Este protocolo implica la creación de una quemadura de contacto del 30% de la superficie corporal total, el grosor parcial en la piel dorsal, así como la división del tendón de Aquiles en su punto medio. Confiar únicamente en la lesión traumática para inducir HO en un lugar predecible permite el estudio del curso del tiempo de la formación ósea heterotópica endocondral a partir de procesos fisiológicos intrínsecos y el entorno únicamente. Este método podría resultar fundamental para comprender las vías inflamatorias y osteogénicas implicadas en la HO inducida por traumatismos. Además, debido a que la HO se desarrolla en una ubicación y curso de tiempo predecibles en este modelo, permite la investigación para mejorar las estrategias de imagen temprana y las modalidades de tratamiento para prevenir la formación de HO.

En el presente estudio, el protocolo se describe para el modelo previamente publicado ratón del trauma / quemadura inducida. HO 14-17 Esto implica la creación de lesiones musculoesqueléticas localizada concurrente con una tenotomía de Aquiles y el insulto inflamatorio global con un espesor parcial quemaduras. Esto da lugar a la formación fiable de hueso reactivo en el sitio de tenotomía que puede ser seguido con imágenes en serie. Hasta la fecha, todos los ratones (más de 50) que han sostenido tanto de Aquile...

Un modelo de tenotomía de Aquiles y lesión por quemaduras de osificación heterotópica permite el estudio fiable de la formación ósea ectópica inducida por el trauma sin la aplicación de factores exógenos.

Ratón directa Trauma / Burn modelo de osificación heterotópica

Heterotopic ossification (HO) is the formation of bone outside of the skeleton which forms following major trauma, burn injuries, and orthopaedic surgical ...

El objetivo general de este procedimiento es inducir la formación de hueso ectópico tras una lesión traumática, sin la aplicación de materiales exógenos. Esto se logra primero creando una lesión musculoesquelética focalizada. En este caso, una tenotomía del tendón de Aquiles.En el segundo paso, se induce una condición inflamatoria sistémica. Aquí, se muestra una quemadura por contacto de espesor parcial que abarca un 30% del área superficial. Luego, se permite que se desarrolle la osificación heterotópica o HO en la región de la tenotomía durante las próximas cinco a nueve semanas.Finalmente, la cantidad y ubicación del hueso ectópico pueden evaluarse mediante imágenes tomográficas microscópicas. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que tiene un correlato clínico en este modelo. Los ratones desarrollan un precursor cartilaginoso seguido de hueso heterotópico sin citocinas adicionales ni mutaciones adicionales en los ratones.Por lo tanto, consideramos que esto permitirá una mejor evaluación de terapias y otras modalidades de imagen, ya que imita adecuadamente el tipo de hueso que observamos en pacientes con osificación heterotópica. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento y el diagnóstico de la OH, ya que permite estudiar tratamientos potenciales para el desarrollo de hueso ectópico antes de que se produzca la osificación. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando observamos OH en pacientes con quemaduras graves que la desarrollaron en diversas localizaciones alejadas del sitio de la quemadura, así como en otros pacientes en zonas de trauma músculo-esquelético.Tras administrar anestesia, confirme la ausencia de respuesta al pellizco en el dedo y administre analgésico. Aplique pomada en los ojos de un ratón adulto C57BL/6 de ocho a diez semanas de edad. A continuación, coloque al animal sobre una almohadilla calefactora y use una máquina de afeitar para rasurar cuidadosamente la pata trasera desde el talón hasta la rodilla.Luego, comenzando desde la espina dorsal y extendiéndose hacia la izquierda de la línea media dorsal. Limpiar un área de al menos dos por tres centímetros para acomodar la lesión por quemadura. Cuando todo el vello haya sido eliminado, utilizar tres frotis alternos de yodopovidona para limpiar la zona quirúrgica y la pata trasera, y colocarse el equipo de protección personal adecuado, incluyendo mascarilla facial, gorro para el cabello y una bata estéril y guantes.Luego, utilizando instrumentos estériles, realice una incisión longitudinal de 0,5 centímetros a lo largo de la cara medial del tendón de Aquiles izquierdo. Cuando el tendón sea visible, inserte una hoja de unas tijeras afiladas para tejidos en el plano tisular por debajo del tendón y diseque a lo largo del plano hasta que la hoja se encuentre en el punto medio del tendón. A continuación, cierre bruscamente las hojas de la tijera para seccionar el tendón y aplique presión con una gasa estéril para lograr la hemostasia.Después de cerrar la incisión cutánea con una sutura de Vicryl 5-0, caliente un bloque de aluminio de 35 gramos y dos por dos por tres centímetros a 60 grados Celsius en un baño de agua. Cuando el bloque esté caliente, colóquelo encima del ratón durante 17 segundos, teniendo cuidado de que toda la superficie esté en contacto con el animal. Luego seque la quemadura dorsal de espesor parcial con gasa y coloque un apósito de Tegaderm; reanime al animal administrando solución de Ringer con lactato tibia mediante inyección intraperitoneal y subcutánea.Luego, coloque el ratón en una jaula individual para su monitoreo hasta que se recupere completamente. Para monitorear la osificación heterotópica de las lesiones mediante análisis de micro-TC en los puntos temporales adecuados posteriores a la quemadura dorsal de espesor parcial, sujete firmemente al ratón anestesiado sobre la camilla del escáner en posición prona. Fije la extremidad trasera firmemente a la camilla para evitar artefactos por movimiento respiratorio e incluya debajo del ratón el fantasma que contiene aire, agua e hidroxiapatito para la calibración de la imagen.A continuación, abra el software de análisis óseo y defina una región de interés que incluya ambas extremidades traseras, desde la articulación de la cadera proximalmente hasta la punta de la pata trasera distalmente. Obtenga una imagen utilizando los parámetros indicados. Luego, dibuje una región de interés en cada una de las tres cámaras del fantasma e introduzca la densidad promedio en los campos correspondientes del software para calibrar la imagen a las unidades del campo de hounds.Para obtener la vista anatómica más clara, utilice la herramienta de sujeción del software para reorientar la imagen de modo que la tibia de la extremidad trasera izquierda quede paralela al eje Z. A continuación, comience en la rodilla y desplácese distalmente a través de las rebanadas de la imagen. Cuando se encuentre el hueso heterotópico (HO), utilice la herramienta manual de spline para crear una región de interés alrededor del hueso ectópico en una de cada tres a cinco rebanadas, continuando en dirección distal hacia la pata o hasta que se haya sobrepasado completamente el hueso heterotópico.Luego, utilice la herramienta de extrapolación para extender y unir las regiones de interés en una única región de interés que contenga todo el HO. Finalmente, cree una región de interés en 3D y abra el menú de análisis, estableciendo los valores de umbral inferior y superior que mejor muestren la ventana ósea para calcular el volumen óseo hasta la fecha. Todos los ratones que han sufrido tanto una tenotomía del tendón de Aquiles como una lesión por quemadura, tal como se acaba de demostrar, han desarrollado una cantidad medible de HO en el sitio de la tenotomía para cuantificar la formación de hueso ectópico.Se utiliza el protocolo de micro-TC de imagen calibrada en cada punto de tiempo deseado. La adición de la lesión por quemadura en combinación con la tenotomía del tendón de Aquiles ha demostrado ser fundamental para inducir una osificación heterotópica significativa; de hecho, cuando ambas lesiones ocurren simultáneamente, se observa un aumento significativo en la cantidad de hueso ectópico formado en el sitio de la tenotomía en comparación con la tenotomía del tendón de Aquiles por sí sola. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 10 minutos o menos por animal si se lleva a cabo correctamente.Al realizar este procedimiento, es importante recordar que todos los tendones posteriores deben seccionarse completamente. Tras este procedimiento, podemos utilizar modalidades de imagen como espectroscopia RO, bioluminiscencia o tomografía computarizada para evaluar la cantidad de hueso formado y el efecto de ciertos fármacos. Además, podríamos utilizar histología, inmunohistoquímica e inmunofluorescencia para analizar los mecanismos de señalización reales detrás del desarrollo de la osificación heterotópica y el modo de acción de nuestros fármacos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Fuente: Wang, Y., et al. In Vivo Investigación de la terapia antimicrobiana de luz azul para infecciones por quemaduras multirresistentes a Acinetobacter baumannii mediante imágenes de bioluminiscencia. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demuestra cómo establecer una infección por quemaduras en un modelo murino aplicando un bloque de latón calentado seguido de un inoculo bacteriano patógeno. Las bacterias colonizan la matriz extracelular expuesta y forman un biofilm, lo que permite estudios in vivo...

Establecimiento de un modelo murino de infecciones por quemaduras con bacterias patógenas

Se presenta un modelo de osteogénesis de distracción tibial de ratón desarrollado utilizando un distractor por encargo. El uso de un ratón como un objetivo de análisis es ventajoso para el avance de la investigación.

Un modelo murino de osteogénesis de la distracción

Aquí, presentamos un protocolo de amputación de falange terminal de ratón adulto para investigar la formación de blastema de mamíferos y la osificación intramembranosa, analizada por inmunohistoquímica fluorescente y tomografía microcomputada secuencial in vivo.

Amputación y regeneración de dígitos de ratón adultos: un modelo simple para investigar la formación de Blastema de mamíferos y la osificación intramembranosa

El objetivo de este estudio fue desarrollar un modelo murino de cicatrización de la quemadura. Se indujo una quemadura térmica en la piel dorsal de los ratones utilizando una plantilla de latón precalentada. El tejido quemado fue desbridado y superpuesto con un injerto de piel cosechado de la cola de un ratón donante genéticamente similar.

Un modelo murino de una herida de quemadura reconstruida con un injerto de piel alogénico

Un modelo que imite el escenario clínico de lesiones por quemaduras e infecciones es necesario para avanzar en la investigación de quemaduras. El presente protocolo demuestra un modelo simple y reproducible de infección por quemaduras de rata comparable al de los seres humanos. Esto facilita el estudio de quemaduras e infecciones después de quemaduras para desarrollar nuevos tratamientos antibióticos tópicos.

Modelo de quemadura de rata para estudiar la quemadura térmica cutánea de espesor total y la infección

Este protocolo se centra en la neovascularización corneal inducida por quemaduras alcalinas en ratones. El método genera un modelo de enfermedad corneal reproducible y controlable para estudiar la angiogénesis patológica y los mecanismos moleculares asociados y probar nuevos agentes farmacológicos para prevenir la neovascularización corneal.

Un modelo de ratón para la neovascularización corneal por quemadura alcalina

Este protocolo explicará cómo establecer un modelo murino de cicatrización hipertrófica que aumente la señalización de mecanotransducción para simular una cicatrización similar a la humana. Este método consiste en aumentar la tensión mecánica a través de una incisión en cicatrización en un ratón y utilizar un dispositivo especializado para crear tejido cicatricial excesivo y reproducible para análisis histológicos y bioinformáticos detallados.

Un modelo de ratón de cicatrices hipertróficas similares a las humanas impulsadas por mecanotransducción

Se presenta un protocolo simplificado para establecer un modelo de cicatrización de heridas por quemaduras en ratones utilizando un dispositivo de calentamiento digital. Los sitios experimentales en forma de tablero de ajedrez creados en la piel facilitan un análisis funcional adicional para el ensayo de cicatrización de heridas.

Modelo de curación de heridas por quemaduras similar a un tablero de ajedrez de ratones basado en un dispositivo de calentamiento digital

Presentamos un modelo reproducible de ratón de alotrasplante compuesto vascularizado de extremidades posteriores a cuello heterotópico. Este protocolo supermicroquirúrgico, que implica anastomosis de vasos de 0,3-0,5 mm, integra guía con filamento de nailon y esposas venosas. Proporciona una plataforma fiable para estudios traslacionales sobre tolerancia, lesiones por isquemia-reperfusión y mecanismos inmunológicos en alotrasplantes compuestos vascularizados.

Trasplante heterotópico de extremidad posterior a cuello en ratón: un modelo supermicroquirúrgico de alotrasplante compuesto vascularizado

Se demuestra una técnica para el procedimiento microquirúrgico para el trasplante heterotópico de corazones en ratones, incluyendo métodos simplificados para la recolección de donantes y la anastomosis de los vasos receptores.

Un método modificado para heterotópico Ratón Corazón TRASPLANTE

Aprende a inducir osificación heterotópica en ratones mediante tenotomía de Aquiles y quemadura del 30% sin factores exógenos. Este modelo permite estudiar la formación ósea ectópica postraumática durante cinco a nueve semanas.

Ratón directa Trauma / Burn modelo de osificación heterotópica

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