Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de Frozen Buffy Coats utilizando para no integrar episomal plásmidos

El objetivo general de este procedimiento es generar células madre pluripotentes inducidas a partir de células mononucleares de sangre periférica humana obtenidas de abrigos leucocitarios congelados utilizando un protocolo rentable y libre de virus. Esto se logra primero mediante el aislamiento de las MNC PB de las capas Buffy después de la centrifugación de sangre total sin un gradiente de densidad, seguida de la expansión en un medio de cultivo sanguíneo específico. El segundo paso es transfectar las MNC PB de la capa buffy con plásmidos episomales por electroporación.

A continuación, las MNC PB transfectadas se siembran en células alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón frescos. El paso final es seleccionar manualmente las células madre pluripotentes inducidas del cultivo y transferirlas a nuevas placas de células alimentadoras para su expansión. En última instancia, la reprogramación eficiente de las MNC PB en células madre pluripotentes inducidas con una morfología humana típica se puede demostrar mediante inmunofluorescencia y medición de la expresión génica.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que la degeneración de los IPC libres de virus a partir de OT congelados reduce el coste, el tiempo de trabajo y los pasos manuales para los operarios durante el procesamiento de las muestras. Otra ventaja de esta técnica es que permite el uso de OTs congelados almacenados en un Biobanco a gran escala recolectados a partir de estudios poblacionales como material de partida para la producción de IPS. Comience recolectando ocho mililitros de sangre periférica venosa en un tubo de plástico tamponado con citrato de sodio.

Almacene la sangre a 25 grados centígrados y procésela dentro de las 12 horas. El primer paso del procesamiento es centrifugar la sangre a 2000 Gs durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Utilice un rotor de cucharón oscilante y no aplique los frenos centrífugos de la separación.

Recoge el pelaje beige nublado. Esta es la capa entre la fase plasmática superior y la fase inferior. La capa leucocitaria es la fracción P-B-M-N-C enriquecida que transfiere unos 500 microlitros de cada muestra de ocho mililitros a un tubo de vial criogénico.

Ahora Resus suspende la capa leucocitaria añadiendo un volumen igual de dos veces el medio de congelación, y luego congela el vial en un recipiente de congelación de velocidad controlada a menos 80 grados centígrados durante un máximo de una semana. Para un almacenamiento más prolongado, las células se pueden almacenar en nitrógeno líquido para comenzar a descongelar Una suspensión congelada de un mililitro de MNC PB obtenida de capas leucocitarias congeladas en un baño de agua a 37 grados centígrados. A continuación, diluya las células a dos mililitros con PBS.

A continuación, mueva la dilución a un tubo de 50 mililitros y agregue 10 mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos. Deje que esta mezcla se incube a temperatura ambiente durante unos 10 minutos. Después de 10 minutos, aumente el volumen total a 50 mililitros con PBS estéril.

A continuación, centrifugar las células a 300 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después del centrifugado, deseche el sobrenadante y lave el pellet con 50 mililitros de PBS. Ahora vuelve a girar las células y vuelve a suspenderlas en un mililitro de PBM y medio C.

Tome una alícuota de células resuspendidas y mida la densidad de células utilizando una cámara de recuento. Luego ajústelo a 2 millones de células por mililitro. Ahora establezca una cultura de suspensión.

Cargue las células en un pocillo de una placa estándar de 12 pocillos y colérelas incubarlas durante 48 horas. Cambie el medio cada dos días, aspire las células con una pipeta y transfiérelas a un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar el tubo cargado a 300 GS durante 10 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en un mililitro de medio P-B-M-N-C fresco. La contaminación de los glóbulos rojos es habitual durante los primeros días de cultivo de PB MNC. Antes de devolver las células a una nueva, revíselas bien bajo un microscopio invertido cuando estén a un 80% de fluidez dividida en el cultivo durante la transferencia.

Dos semanas después de comenzar el cultivo de PB MNC, las células deben estar listas para transfectar. Prepare cuatro plásmidos, uno portador de T, tres, cuatro y S-H-R-N-A contra P 53, 1 portador de SOX dos y KLF cuatro, uno portador de lmic y lin 28, y un plásmido portador de EGFP. Para empezar, recoja las MNC PB en un tubo cónico de 15 mililitros y cuente el número de células viables utilizando triam blue.

A continuación, prepare 2 millones de células viables, centriléguelas y vuelva a suspender las células en una mezcla de transfección que contenga 100 microlitros de tampón de resuspensión T y un microgramo de cada uno de los cuatro plásmidos. Ahora llene el recipiente de transfección con tres mililitros de tampón electrolítico. E dos, aspirar la mezcla de transfección en una punta de 100 microlitros y expulsar la muestra verticalmente en el tubo de electroporación preparado.

Luego comió las células usando tres pulsos Después de la electroporación, vuelva a suspender las células en dos mililitros de PBM de preguerra y medio C con butirato de sodio de 0,25 milimolares. A continuación, cuente el número de células viables como antes y transfiera la suspensión a un pocillo de una placa de seis pocillos sin recubrir. Ponga la placa a incubar con una agitación suave durante 24 horas.

Mantener las células transfectadas sin dividirlas durante tres días a partir del día de la transfección en días opuestos. Reemplace el medio con dos mililitros de medio P-B-M-N-C recién preparado con butirato de sodio de 0,25 milimolares un día antes de establecer el cocultivo, prepare la primera capa MES, los pocillos de una placa de seis pocillos con un mililitro de matriz de membrana basal y deje que las placas se incuben a 37 grados centígrados durante 15 minutos. A continuación, aspire la matriz de la membrana basal y coloque 200.000 MEF en cada pocillo con dos mililitros de DMEM que contengan un 10% de FBS al día siguiente, recoja las MNC de PB en una punta de un mililitro.

Transfiérelos a un tubo cónico de 15 mililitros y gíralos hacia abajo. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en dos mililitros de medio fresco. Luego, coloque las células en los pozos recubiertos de metanfetamina e incube la placa después de dos días.

Reemplace el medio con dos mililitros de medio IPSC con butirato de sodio de 0.25 milimolares y continúe reemplazando el medio IPSC cada dos días. Después de unos 22 a 25 días, las primeras colonias de PSC I deberían ser visibles a los 30 a 35 días. Las colonias deben estar listas para recoger y reproducir el día antes de empaquetar las colonias de IPSC que colocan las celdas alimentadoras de metanfetamina en un 12.

Placa de pocillo a 125.000 células por pocillo e incubarlas durante la noche. Al día siguiente, reemplace el medio de las células de metanfetamina con un mililitro de medio IPSC suplementado. Luego, bajo un microscopio de disección, use una aguja para seleccionar una colonia a la vez para colonias más grandes que forman pequeños grupos.

Transfiéralos individualmente con una pipeta, transfiera una colonia a cada pocillo de la placa recubierta de metanfetamina e incube la placa hasta el pasaje. Las colonias de IPSC utilizan inicialmente la misma técnica de selección, pero después de dos o tres pasadas, utilizan el procedimiento basado en enzimas, las MNC PB aisladas que muestran una forma redondeada típica se expandieron en un medio de cultivo sanguíneo específico durante 14 días y luego se transfectaron con plásmidos epismales de 10 a 15 días después de la transfección. Pequeñas colonias redondeadas y brillantes con márgenes definidos y morfología similar a la de las células madre embrionarias comenzaron a aparecer alrededor de 20 a 30 días después de la transfección.

Aparecieron colonias de IPSC muy compactas con bordes afilados y aumentaron de tamaño hasta que fueron lo suficientemente grandes como para recogerlas para los primeros pasos del empaquetado. Las colonias de IPSC mantuvieron su estado indiferenciado y mostraron una morfología típica de células madre embrionarias humanas. El aumento muestra células individuales dentro de las colonias y la alta proporción de núcleo a citoplasma.

Los clones seleccionados de IPSE se pasaron entre 10 y 15 veces más. Se analizaron alrededor de 20 metafases de varios cultivos independientes para determinar la estabilidad genética. Todas las muestras mostraron un gramo normal después de cinco a 10 expansiones in vitro.

Estos clones se caracterizaron por su tallo y pluripotencia. Los clones fueron positivos para la tinción de fosfatasa alcalina. El estudio cuantitativo R-T-P-C-R verificó que los clones expresaban genes pluripotentes endógenos a niveles mucho más altos que las MNC PB iniciales.

Si bien los niveles de CMIC endógeno y KLA cuatro permanecieron más o menos igual, no se pudo detectar la expresión de transgén episomal exógeno en los IPC, lo que indica la activación exitosa de genes pluripotentes endógenos. Finalmente, el análisis de inmunofluorescencia reveló que los IPC expresaron marcadores de pluripotencia como OC tres cuatro SSEA cuatro TRA 180 1, SOX dos y TRA uno 60. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar IPC a partir de ko, aislados de sangre periférica humana de manera rentable y utilizando plásmidos emosmales no integradores.