Medición de daños y reparación del ADN en esplenocitos de ratón Después crónica En Vivo La exposición a dosis muy bajas de beta y gamma Radiación

Se presenta un protocolo para evaluar los cambios en los niveles de daño en el ADN y la capacidad de reparación del ADN que pueden ser inducidos por la irradiación crónica in vivo de baja dosis en linfocitos de bazo de ratón, mediante la medición de la histona fosforilada H2AX, un marcador de roturas de doble cadena de ADN, utilizando citometría de flujo.

El objetivo general del siguiente experimento es medir el daño y la reparación del ADN inducidos en las células del bazo de ratón por la exposición crónica in vivo a bajas dosis de radiación beta o gamma. Esto se logra exponiendo primero a los ratones a la irradiación beta interna o gamma externa para desencadenar cambios potenciales en el daño y la reparación del ADN. Como segundo paso, los citos PLE se aíslan e irradian con una dosis alta y desafiante de radiación gamma que induce daños detectables en el ADN para permitir el seguimiento de la reparación del ADN.

Con el tiempo, las células del bazo se marcan inmunológicamente con fluorescencia contra gamma H, dos A x, para permitir la cuantificación del daño en el ADN. En última instancia, el daño en el ADN producido por dosis de radiación gamma aguda tan bajas como 10 grados centígrados se puede medir mediante citometría de flujo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la protección radioeléctrica, como si las dosis bajas de radiación que normalmente se encuentran en un entorno laboral, médico o público realmente aumentan la probabilidad de efectos perjudiciales para la salud, como el cáncer.

Las principales ventajas de nuestra técnica sobre los métodos existentes, como el recuento de focos gamma H dos A X mediante microscopía inmunofluorescente, son que nuestra técnica requiere considerablemente menos tiempo para el análisis, lo que la hace adecuada para estudios a gran escala con animales, y reduce el sesgo relacionado con el operador en la cuantificación de gamma H dos A X. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la personalización de la medicina y la radioterapia del cáncer y que las sensibilidades individuales a la radio del paciente se pueden determinar utilizando linfocitos de sangre periférica para ajustar el régimen de dosis de radioterapia del paciente. Aunque este método proporciona información sobre la toxicidad de la radiación, también se puede aplicar a otros estudios, como la investigación de la toxicidad de los contaminantes químicos ambientales o los mecanismos fundamentales de la formación y reparación de daños en el ADN en ratones in vivo.

Para la irradiación beta interna, tratar a los animales durante un mes mediante el acceso AD libitum al agua de tritio para la irradiación gamma externa. Coloque toda la jaula de ratones a la distancia adecuada de una fuente de radiación gamma para que coincida con la tasa de dosis de la exposición al tritio. Iniciar y mantener la exposición durante un mes.

Utilice dosímetros de termoluminiscencia para medir las dosis totales de absorción al final de la exposición. El día de la recolección del bazo, coloque un colador de células dentro de una pequeña placa de Petri vacía por animal y agregue cinco mililitros de medio RPMI a cada placa. A continuación, coloque un ratón sacrificado en posición supina y rocíe el pelo con etanol al 70% cuando el animal esté completamente empapado.

Use fórceps para agarrar la piel anterior a la abertura uretral y hacer una pequeña incisión en la región perineal a partir de esta incisión. Corte a lo largo de la línea media ventral hasta la cavidad torácica, teniendo cuidado de cortar solo la piel y no la pared muscular que se encuentra debajo. Disecciona la piel lejos de la línea media.

A continuación, agarrar la pared abdominal con fórceps. Corta a lo largo del acceso mediano del músculo para abrir la cavidad abdominal. Localice el bazo y sujételo ligeramente con pinzas estériles.

A continuación, tira suavemente del tejido mientras maldices simultáneamente el tejido conectivo. Extirpar aproximadamente una décima parte del bazo para los análisis posteriores. Luego, transfiera el resto del tejido a uno de los filtros de células durante un máximo de dos horas después de que se hayan extraído todos los bazos.

Use pinzas curvas estériles para picar cada uno de los tejidos dentro de sus filtros celulares individuales. Cuando el bazo se haya homogeneizado lo suficiente, retire los filtros y transfiera la suspensión celular filtrada a tubos de 15 mililitros. Enjuague cada uno de los coladores con cinco mililitros adicionales de medio, tirando de los lavados con el resto de las suspensiones de celdas y centrifuga las celdas dos veces Resus, suspendiendo los pellets en 10 mililitros de RPMI fresco cada uno después del primer centrifugado.

Después del segundo giro. Vuelva a suspender los gránulos en cinco mililitros de RPMI y transfiera cuatro mililitros de las suspensiones celulares resultantes a matraces de cultivo de tejidos de 25 mililitros para su incubación a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono con 80% de humedad. Transfiera el resto de las suspensiones celulares a nuevos tubos de 1,5 mililitros y centrifuga celdas de cuatro grados centígrados.

Con una bomba de vacío, aspire cuidadosamente los sobrenadantes y vuelva a suspender suavemente los gránulos en un mililitro de tampón TBS y vuelva a centrifugar las células después de aspirar nuevamente el supinado. Reese suspende los pellets en 300 microlitros de TBS cada uno. Luego, mientras se agita en vórtice a baja velocidad, a 700 microlitros de menos 20 grados centígrados, 100% de etanol en cada tubo.

Invierta los tubos unas cuantas veces para mezclar más. A continuación, almacene las muestras a menos 20 grados centígrados durante un máximo de 12 meses. Para inducir roturas de doble cadena de ADN para desafiar la maquinaria de reparación.

Cultivo con irradiador con dos grays de radiación gamma a una tasa de dosis igual o inferior a 200 mini gras por minuto. Inmediatamente después del desafío, devuelva el cultivo a la incubadora de CO2. Una hora más tarde, transfiera el cultivo irradiado a un gabinete de seguridad biológica y use una pipeta para resuspender suavemente las células.

Transfiera un mililitro de la suspensión celular resultante a un tubo de 1,5 mililitros en hielo y luego gire las celdas. Utilice la bomba de vacío para aspirar cuidadosamente el supinato y luego resus suspender suavemente los pellets en un mililitro de TBS. Luego, después de un segundo lavado con TBS, fije las células en etanol como se acaba de demostrar para un almacenamiento de menos 20 grados Celsius para el análisis inmunofluorescente de las células.

En primer lugar, añada 0,5 mililitros de TBS helado a los tubos de muestra adecuados. El siguiente vórtice alícuota Eloqua, un fijo de menos 20 grados Celsius almacenó citos SPL durante cinco segundos. A continuación, transfiera 0,5 mililitros de las células a los tubos apropiados y gírelos suavemente para volver a suspender los gránulos en un mililitro de TBS helado que contiene 1% de FBS y células centrífugas.

De nuevo, incubar las muestras en un mililitro de tampón TST por tubo en hielo durante 20 minutos. Después de girar las células, nuevamente, vuelva a suspender los gránulos en 200 microlitros de anticuerpo primario anti gamma H dos ejes. A continuación, coloque el tubo en un agitador giratorio en un ángulo de 45 a 60 grados durante 1,5 horas a 300 veces G y a temperatura ambiente al final de la incubación.

Lave las muestras dos veces en un mililitro de TBS helado que contenga 2% de FBS. A continuación, vuelva a suspender los gránulos en 200 microlitros de anticuerpo secundario recién preparado en la plataforma de agitación. Después de una hora, lave las células en un mililitro de hielo llamado TBS que contiene 1% de FBS, seguido de un lavado en un mililitro de hielo llamado TBS solo.

Finalmente, vuelva a suspender los gránulos en 0,5 mililitros de TBS que contengan yoduro de propidio En estos gráficos, se muestran los resultados representativos de la citometría de flujo. La tinción con yodo propidio disperso confirmó que tanto las muestras de control como las de desafío a la radiación exhibieron una distribución normal del ciclo celular. Si bien la medición de la señal gamma H dos ejes demostró un aumento superior al doble en la rotura de la doble cadena de ADN dentro de las dos células irradiadas grises en comparación con los controles no tratados, los niveles relativos de gamma H dos AX en los citos de ratón, una hora después de la exposición ex vivo a dosis bajas o altas de radiación gamma, se muestran como se esperaba.

Se detectó una fuerte inducción triple de roturas de doble cadena después del desafío de dos grises. Se observó un aumento leve pero estadísticamente significativo después de la exposición a 0,1 grises, lo que indica una sensibilidad suficiente del método. El marcado patrón de fluorescencia similar a focos observado por microscopía indica que la señal se origina en las roturas de doble cadena de ADN individuales dentro de la cromatina CH, lo que valida la especificidad de la tinción.

Aquí, se muestra el nivel de roturas de doble cadena de ADN exhibidas por los citos PLE recolectados de ratones expuestos a un mes de agua tritiada. Aunque el tratamiento resultó en un aumento del 10% en el nivel basal de gamma H dos A X, el cambio no fue estadísticamente significativo. Además, no hay diferencias en la formación y pérdida medidas de gamma H dos ejes.

Después del desafío, se observó la cinética de la reparación de frenos de doble cadena de ADN entre las células de los ratones tratados con agua tritiada y el control. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe cumplir con las reglas y regulaciones establecidas por su asociación local de protección contra la radiación y utilizar un laboratorio o instalación certificada donde se puedan llevar a cabo proyectos de ratones a gran escala utilizando fuentes de radiación internas y externas. Una vez dominadas, estas técnicas solo requieren alrededor de un día y medio por cada 10 ratones para completarse si se realizan correctamente.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar el análisis de citometría de flujo de la expresión de Gamma H dos A X para medir las roturas y reparaciones de la hebra doble de ADN inducidas in vivo por la exposición a dosis bajas de tritio o radiación gamma. Además de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el M FISH en linfocitos sanguíneos, el ensayo MICRONUCLEUS de la médula ósea y el R-T-Q-P-C-R para medir la expresión de genes de respuesta al estrés para evaluar los riesgos para la salud asociados con la exposición a dosis bajas de radiación.