Name: Medición de daños y reparación del ADN en esplenocitos de ratón Después crónica En Vivo La exposición a dosis muy bajas de beta y gamma Radiación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Aprende a medir daños y reparación del ADN en esplenocitos de ratón expuestos a radiación beta y gamma de baja dosis usando citometría de flujo. Este método permite cuantificar roturas de doble cadena mediante marcadores de H2AX.

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Los autores desean agradecer la contribución de nuestros colegas Sandrine Roch-Lefevre y Eric Gregoire del Instituto de Radioprotección y Seguridad Nuclear (París, Francia). Este trabajo fue apoyado por el programa de Ciencia y Tecnología del Gobierno de Canadá en los Laboratorios Nucleares Canadienses (Chalk River, Ontario, Canadá), el Grupo de Propietarios de CANDU (Toronto, Ontario, Canadá), la Comisión Canadiense de Seguridad Nuclear y por el Instituto de Protección Radioeléctrica y Seguridad Nuclear (París, Francia).

Todos los procedimientos de manipulación y tratamiento de ratones deben adherirse a las normas establecidas por los programas de la legislatura y / o cuidado de los animales y aprobados por un comité local de cuidado de animales. Todos los métodos descritos en este protocolo se realizaron de acuerdo con las directrices del Consejo Canadiense de los Animales, con la aprobación del comité local de cuidado de animales. ATENCIÓN: Todos los trabajos con radiactividad (incluyendo, pero no limitado a la manipulación de tritio, γ-irradiación externa, la manipulación de tejidos animales, residuos radiactivos de cama) deben adherirse a las normas establecidas por las autoridades de la legislatura y / o de protección radiológica y se realizará por personal autorizado personal de un laboratorio y / o instalación certificada. 1. Trabajar Animal <ol><li> Agrupación Animal <ol><li> Si los ratones están llegando de una organización externa, aclimatar animales durante al menos 10 días en el animalario. Si el estudio incluye múltiples grupos de tratamiento, asegúrese de que el proveedor de los animales puede enviar all animales como un solo lote. </li><li> Asignar aleatoriamente los ratones a grupos de tratamiento de 10 ratones por grupo. Si el uso de ratones macho de la cepa C57BL / 6, que el proveedor de los animales pre-organizar aleatorización de muy corta edad C57BL / 6 machos en sus instalaciones para mitigar problemas de agresión. </li></ol></li><li> La exposición crónica de ratones de β-radiación interna <ol><li> Preparar las concentraciones de trabajo de tritio (10 kBq / L y 1 MBq / L) en el agua potable de ratón mediante la dilución de la población original de HTO y OBT (una mezcla de prolina tritiada, alanina y aminoácidos glicina) soluciones. </li><li> Validar las concentraciones finales de tritio en el agua potable mediante la medición de la radiactividad utilizando un contador de centelleo líquido. Ajuste concentraciones, si es necesario. </li><li> Tratar a los animales durante un mes mediante el acceso ad libitum al agua tritio. Si el agua de tratamiento se baja durante el período de dos semanas, añada más agua. De lo contrario, cambie las botellas a las dos semanas. </li><li> Farsa irradiado Tratar de controlratones idénticamente. Manténgalos en una habitación &quot;limpia&quot; separada o en un estante separado &quot;limpio&quot; bajo la presión de aire positiva para evitar tritio contaminación cruzada desde el aire. </li></ol></li><li> La exposición crónica de ratones a la radiación externa γ- Nota: facilidad de γ-irradiación / equipo variará dependiendo de la ubicación. </li><li> El uso de métodos disponibles de dosimetría, determinar las distancias de una fuente γ-radiación que tienen campos de radiación que producen las dosis deseadas. Garantizar la homogeneidad de los campos de radiación dentro de las áreas que cubren las jaulas de los animales. Nota: 1,7 μGy / h es equivalente a una tasa de dosis producida por 1 MBq / L tritio en el cuerpo. </li><li> Exponer los ratones mediante la colocación de jaulas de ratón en las distancias determinadas en el paso 1.3.1 para un mes. Minimizar interrupción diaria de la γ-irradiación a 30 min. Utilice dosímetros de termoluminiscencia para medir dosis total absorbida. </li></ol> 2. Sacrificio y Muestreo <ol&gt; <li> Preparar instrumentos quirúrgicos estériles, 60 mm placas de Petri con coladores insertados celulares 70 micras, 15 ml y tubos de 1,5 ml, medio RPMI suplementado con 5% de suero fetal bovino (FBS) y el lugar todo dentro de una cabina de seguridad biológica. Asegurar la esterilidad de la obra es crucial. </li><li> Dispense 5 ml de medio RPMI en cada 60 mm placa de Petri. </li><li> Sacrificar los ratones utilizando un método aprobado por el comité local de cuidado de los animales. Dislocación cervical es una buena opción para el trabajo de esplenocitos se describe en este protocolo. Sin embargo, si se requieren muestras de sangre para otros ensayos (por ejemplo, para el mFISH, el bloque de micronúcleos citocalasina u otros ensayos genetoxicity común), utilice la punción intracardiaca después de la anestesia con isoflurano. </li><li> Colocar el animal en decúbito dorsal, con la cabeza apuntando lejos de usted. Rocíe el ratón hacia abajo con etanol al 70%. Con unas pinzas, agarre la piel en sentido anterior a la abertura de la uretra y hacer una pequeña incisión con tijeras en la región perineal. <ol&gt; <li> De esta incisión, corte a lo largo de la línea media ventral a la cavidad torácica, teniendo cuidado de cortar solamente la piel y no la pared muscular debajo. Diseccionar la piel lejos de la línea media. </li><li> Agarre la pared abdominal con fórceps y cortar a lo largo del eje medio de la pared muscular de abrir la cavidad abdominal. </li></ol></li><li> Extirpar el bazo ligeramente agarre con pinzas estériles y suavemente tirando de él y al mismo tiempo cortando el tejido conectivo con unas tijeras. </li><li> Corte un pequeño trozo del bazo (aproximadamente 1/10 del bazo) y colocar en un tubo de 1,5 ml. Snap congelar en nitrógeno líquido para su posterior almacenamiento a -80 ° C para los ensayos suplementarios. </li><li> Coloque el resto del bazo en un filtro de células dentro de una placa de Petri de 60 mm con 5 ml de medio RPMI pre-dispensado. </li><li> Continúe con el siguiente ratón. Nota: Extraído bazos se pueden mantener en placas de 60 mm con los medios de comunicación (para un máximo de 2 horas), mientras que el resto de los ratones son Sacrificed. Dependiendo del número de personas que participan, entre 5 y 15 ratones se pueden procesar en un día. </li></ol> 3. Preparación de cultivos de esplenocitos <ol><li> Homogeneizar el bazo mediante el picado dentro de un filtro de células con unas pinzas estériles con un extremo curvo. </li><li> Retire el filtro de células y recoger la suspensión de células se filtra desde el plato de 60 mm en un tubo de 15 ml. </li><li> Enjuague el filtro de células con 5 ml de medio para recoger el resto de las células. </li><li> Tubos de centrifugar a 300 xg durante 5 min a TA. </li><li> Decantar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento en 10 ml de RPMI. </li><li> Tubos de centrifugar a 300 xg durante 5 min a TA. </li><li> Decantar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento en 5 ml de RPMI. </li><li> Transferencia de 4 ml de la suspensión celular en un matraz de cultivo de 25 ml de tejido y trasladarlo a un incubador de CO2 (37 ° C, 5% de CO 2, 80% de humedad) </li></ol> 4. Desafiando irradiación y Fijación <ol><li> Transferir elrestante 1 ml de suspensión celular desde el paso 3.8 en un tubo de 1,5 ml en hielo y centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Daño en el ADN medido en esta muestra representará tanto daño inducido por el tratamiento y t = 0 de datos punto para la construcción de una curva de reparación del ADN. </li><li> Aspirar con cuidado el sobrenadante utilizando una bomba de vacío. Suavemente volver a suspender el sedimento en 1 ml de tampón TBS (20 mM Tris pH 7,4, NaCl 150 mM, KCl 2,7 mM). </li><li> Tubos centrífuga a 300 g durante 5 min a 4 ° C. Aspirar con cuidado el sobrenadante utilizando una bomba de vacío. Suavemente volver a suspender el sedimento en 300 l de TBS. </li><li> Mientras se mezcla en un vórtice a baja velocidad, añadir 700 l de -20 ° C 100% de etanol. Cierre la tapa e invierta varias veces para mezclar. </li><li> Almacenar las muestras a -20 ° C. Los esplenocitos fijos en etanol se pueden almacenar a -20 ° C durante al menos 12 meses sin ninguna pérdida notable en la señal de γH2AX. </li><li> Irradiar los cultivos de esplenocitos del paso 3.8 con un desafiante γ-rad<html> iation dosis de 2 Gy a una tasa de dosis ≥ 200 mGy / min utilizando dispositivo de irradiación disponible. Nota: El propósito de esta irradiación es inducir ADN OSD para desafiar la maquinaria de reparación. Los rayos X también se pueden utilizar para este propósito. </li><li> Inmediatamente devolver las culturas para una incubadora de CO 2. </li><li> 1 hora después de la desafiante 2 Gy de irradiación, retire las culturas de la incubadora a una cabina de seguridad biológica. Para recoger una alícuota de la muestra representativa, suavemente volver a suspender las células utilizando una pipeta y la transferencia de 1 ml de la suspensión celular a un tubo de 1,5 ml en hielo. Devolver los cultivos celulares a una incubadora de CO 2. </li><li> Tubos centrífuga a 300 g durante 5 min a 4 ° C. Aspirar con cuidado el sobrenadante utilizando una bomba de vacío. Suavemente volver a suspender el sedimento en 1 ml de TBS. </li><li> Repita los pasos 4.3 a 4.5. </li><li> 24 horas después de la desafiante 2 Gy γ-irradiación, cosecha y fijar en = 24 hrs muestra como se describe en el paso 4.8 a 4.10. </li></ol>tle &quot;&gt; 5. El etiquetado de inmunofluorescencia con anticuerpos anti-γH2AX Nota: Por lo general, 15 a 30 muestras por día pueden immunofluorescently etiquetados y se analizaron por citometría de flujo en una sola corrida. Para garantizar una comparación exacta entre los grupos de tratamiento, incluyen la muestra (s) de cada grupo. Ver también Referencia 16 para más detalles. <ol><li> Preparar un conjunto marcado de tubos para el número de muestras a procesar y el lugar en el hielo. Utilice 12 x 75 mm tubos de vidrio debutantes. La esterilidad no se requiere para este trabajo. Incluir una muestra de control histórica adicional para el marcaje con anticuerpo secundario solamente (&quot;segunda Ab única&quot;). Utilice esta muestra histórica de control en todos los citometría de flujo funcionar dentro de un estudio. </li><li> Añadir 0,5 ml de TBS helado a cada tubo. </li><li> Eliminar esplenocitos fijos de -20 ° C, vórtice durante 5 s y transferir una alícuota de 0,5 ml a tubos preparados con TBS. Coloque el resto de las muestras de vuelta a -20 ° C y almacenamientomantener como muestra de respaldo. </li><li> Esplenocitos centrifugar a 300 g durante 5 min a 4 ° C. Decantar suavemente el sobrenadante y resuspender el sedimento en 1 ml de hielo-frío TBS que contiene 1% de FBS </li><li> Células centrifugar a 300 g durante 5 min a 4 ° C. Decantar el sobrenadante y volver a suspender suavemente el sedimento en 1 ml de tampón TST (0,05% de Triton X-100, 2% de FBS en TBS). Incubar durante 20 min en hielo. </li><li> Células centrifugar a 300 g durante 5 min a 4 ° C. Decantar el sobrenadante y volver a suspender suavemente el sedimento en 200 l de anticuerpo primario anti-γH2AX diluidos 1: 150 en tampón TST. Utilice 200 l de TST para el &quot;segundo Ab única&quot; muestra de control. </li><li> Tubos de posición en un agitador que gira a un ángulo de 45 - 60 ° y agitar durante 1,5 horas a 300 xg a temperatura ambiente. </li><li> Mientras que los tubos están incubando, preparar un volumen suficiente (200 l / muestra) de la cabra anti-ratón anticuerpo secundario conjugado con Alexa-488 en una dilución 1: 200 en tampón TST. Nota: Todos los trabajos que Alexa-488anticuerpo conjugado (pasos 5.10 a 5.16 más abajo) debe hacerse bajo condiciones de luz tenue y muestras etiquetadas debe protegerse de la luz, envolviendo los tubos en papel de aluminio. </li><li> Una vez completada la incubación 1,5 hrs, añadir 1 ml de TBS frío con hielo que contenía FBS al 2% a cada tubo y centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar el sobrenadante y volver a suspender suavemente el sedimento en 1 ml de TBS que contenía 2% de FBS. </li><li> Centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar suavemente el sobrenadante y resuspender el sedimento en 200 l de la solución de anticuerpo secundario desde el paso 5.8. </li><li> Incubar las muestras en una plataforma de agitación durante 1 hora como en el paso 5.7. </li><li> Añadir 1 ml de TBS frío con hielo que contenía 1% de FBS. </li><li> Centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar suavemente el sobrenadante y resuspender el sedimento en 1 ml de TBS enfriado con hielo. </li><li> Centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar el sobrenadante y volver a suspender suavemente el sedimento en 0,5 ml de TBS que contenía 50 mg / mlyoduro de propidio. </li><li> Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente protegido de la luz. </li><li> Analizar las muestras en un citómetro de flujo a través de protocolos específicos de los instrumentos 16. Leer al menos 10.000 células por muestra. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no se conocen intereses financieros en competencia.

El protocolo presentado en este documento es útil para la realización del ratón a gran escala en los estudios in vivo que examinan los efectos genotóxicos de los bajos niveles de diversos agentes químicos y físicos, incluyendo la radiación ionizante. Nuestra instalación de animales libres de patógenos específicos único equipado con un irradiador GammaBeam 150 y un pasillo largo irradiación 30 metros permite la realización de estudios de toda la vida que implican radiaciones bajas o muy bajas tasas de d...

Controversia significativa sobre los posibles efectos nocivos de cualquiera de las dosis bajas o muy bajas de radiación y el temor del público de la radiación, impulsado por las imágenes de los bombardeos atómicos de Hiroshima y Nagasaki y de accidentes en plantas nucleares raras ionizante (exacerbada por los medios de comunicación), ha dado lugar a muy estricta regulación de la protección radiológica y normas que potencialmente no son científicamente justificada. En las tres últimas décadas, numerosos informes han documentado tanto la falta de perjudicial y la presencia de efectos biológicos potencialmente beneficiosos inducidos por la radiación de baja dosis 1-4. El factor de riesgo para la salud de radiación mayor es la probabilidad de cáncer, que se calcula sobre la base de los estudios epidemiológicos de sobrevivientes de las bombas atómicas que reciben dosis altas o medianas de la radiación. Linear extrapolación de estos datos (los llamados lineal-no-umbral o modelo LNT) se utiliza para estimar los riesgos de cáncer a dosis bajas. Sin embargo, este enfoque no ha recibido la aceptación científica mundialy está fuertemente debatido 5. Es evidente que se necesitan más estudios para aclarar esta cuestión y, posiblemente, mejorar las normas de protección radiológica. Tales estudios deben incluir tratamientos crónicos (mejor aproximación de las exposiciones ambientales y ocupacionales), en modelos animales in vivo (en el mejor de los efectos para la salud humana) y la extrapolación de estos puntos finales como los tipos de daño en el ADN, la reparación del ADN y mutagénesis. Se sabe que el ADN es el principal objetivo de dañar efectos de la radiación y incompletos o mis-reparación puede conducir a mutagénesis y cáncer de desarrollo 6. Roturas de doble hebra de ADN (OSD) son uno de los tipos más perjudiciales de las lesiones del ADN y pueden conducir a la muerte celular y tumorigénesis 7. Es, por lo tanto, importante para ser capaz de medir de forma fiable y precisa el nivel de DSB después de la exposición a bajas dosis de radiación y / o otros factores de estrés, tales como contaminantes químicos. Uno de los marcadores más sensibles y específicosde DSB de ADN es la histona H2AX fosforilada, llamado γH2AX 8, sin embargo, otros marcadores y métodos Se han sugerido 9,10. Se estima que miles de moléculas de H2AX, en las proximidades de un OSD inducida, están implicados en la formación de γH2AX que permite la detección de individuo OSD, mediante el etiquetado de inmunofluorescencia con un anticuerpo y microscopía de fluorescencia anti-γH2AX 11. La respuesta es muy rápida, alcanzando su máximo entre 30 y 60 min. Existen pruebas de que γH2AX facilita la reparación de DSB de ADN mediante la atracción de otros factores de reparación a los sitios de las pausas y al modificar la estructura de la cromatina para anclar los extremos de ADN rotos y facilitar el acceso de otras proteínas de reparación (revisado en 12). Sobre la terminación de la reparación de DSB de ADN, se γH2AX De fosforilada y / o se somete a la degradación, y las moléculas recién sintetizadas H2AX reemplazar γH2AX en las zonas afectadas de la cromatina 10. La formación y la pérdida de γH2AX Vigilancia puede,por lo tanto, proporcionar una estimación precisa de la cinética de reparación del ADN OSD. Este enfoque ha sido utilizado para estudiar la reparación de DSB en diversas líneas celulares tumorales humanas irradiadas con altas dosis de radiación y su tasa de OSD y los niveles residuales se han demostrado que se correlaciona con la radiosensibilidad 13-15. Hemos modificado este enfoque experimental y lo aplicamos a un estudio en ratones in vivo para examinar los efectos de las dosis bajas de γ- crónica y β-irradiación en los niveles de ADN del OSD y reparación (Figura 1). En primer lugar, demostramos un método para realizar una exposición crónica a largo plazo de ratones para β-radiación sea emitida por tritio (hidrógeno-3) en forma de agua tritiada (HTO) o como tritio orgánico (OBT) disuelto en el agua potable . Se espera que las dos formas de acumular y / o distribuir de manera diferente en el cuerpo y por lo tanto, producir diferentes efectos biológicos. Ambas formas son posibles peligros en la industria nuclear. Este tratamientoes paralelo por la exposición crónica a la radiación γ-a una tasa de dosis equivalente para permitir una correcta comparación de los dos tipos de radiación, que es crucial para la evaluación de su eficacia biológica relativa. Beta-radiación se compone de electrones, lo que es muy diferente de la γ-radiación, fotones de alta energía. Debido a esta diferencia, Β-radiación representa peligro para la salud principalmente interna y puede producir diferentes efectos biológicos en comparación con γ-radiación. Esta complicación se tradujo en controversias significativas sobre la regulación de la exposición a β-radiación emitida por OTA. Por lo tanto, los niveles de regulación de HTO en el agua potable para el público varían de 100 Bq / L en Europa a 75.000 Bq / L en Australia. Es, por lo tanto, importante para comparar los efectos biológicos de HTO a dosis equivalentes de γ-radiación. En segundo lugar, la tasa de DSB de ADN se mide en esplenocitos aislados a la finalización de las exposiciones crónicas usando immunofluorescently marcado γH2AX detectared por citometría de flujo. Esto permite la evaluación de la extensión del daño de ADN infligido por las exposiciones in vivo. Sin embargo, es razonable esperar que tales exposiciones de bajo nivel pueden no producir ningún tasas detectables de ADN OSD; en cambio, / puede esperarse algunos cambios ocultos respuestas que afectaría a la capacidad de las células para reparar el daño del ADN. Estos cambios, si se encuentra, pueden ser o bien estimulador (produciendo un efecto beneficioso) o inhibidor (produciendo un efecto perjudicial). El protocolo propuesto permite revelar tales cambios desafiando a los esplenocitos extraídos con una alta dosis de radiación que produce una cantidad significativa de daño (por ejemplo, 2 Gy producir aproximadamente 50 DSB de ADN por célula o un 3 -. Incremento de 5 veces en nivel total γH2AX) . Posteriormente, la formación y la pérdida de γH2AX, lo que refleja el inicio y la finalización de la reparación de DSB, se controla mediante citometría de flujo. De esta manera, no sólo basal y los niveles inducidos por el tratamiento de DSB de ADN pueden medirse, perotambién su efecto potencial sobre la capacidad de las células para responder y daño del ADN inducido por la reparación de los niveles estresantes mucho más altas.

<table><tbody><tr><td>HTO: agua tritiada, [3H]</td> <td>obtenida localmente de un reactor nuclear&nbsp;</td><td></td><td>actividad de stock 3.7 GBq/mL;&nbsp; puede ser sustituido por HTO de Perkin Elmer</td></tr><tr><td>OBT: Alanina, L-[3-3H]: tritio unido orgánicamente (OBT)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET348005MC</td><td>1 mCi/ml (185 MBq)</td></tr><tr><td>OBT: Glicina, [2-3H]: tritio unido orgánicamente</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET004005MC</td><td>1 mCi/ml (185 MBq)</td></tr><tr><td>OBT: Prolina, L-[2,3-3H]: tritio unido orgánicamente (OBT)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET323005MC</td><td>1 mCi/ml (185 MBq)</td></tr><tr><td>agua tritiada, [3H] (HTO)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET001B005MC</td><td>sustituto de HTO de origen local&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>El irradiador GammaBeam 150</td><td>de Atomic Energy of Canada Limited</td><td>, fabricado localmente</td><td>, puede sustituirse por otra fuente de radiación g de actividad suficientemente baja.</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025501</td><td>Hyclone RPMI 1640 con L-Glutamina y HEPES 500mL</td></tr><tr><td>suero fetal bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1051-100ML</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo anti-gH2AX, clon JBW301</td><td>Millipore</td><td>05-636</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor-488 cabra anti-ratón anticuerpo</td> Life <td>Technologies (anteriormente Invitrogen)</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>yodo propidio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4864-10ML</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>etanol</td><td>Alcoholes comerciales</td><td>P006-EAAN</td><td>Botellas de 500 ml Etanol absoluto</td></tr><tr><td>Tubos de 1,5 ml</td><td>Tubos de microcentrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>2682550</td></tr><tr><td>tubos de 15 ml</td><td>Tubos de centrífuga de polipropileno estériles</td> <td>Fisher Scientific</td><td>05-539-5</td></tr><tr><td>nitrógeno líquido</td><td>Linde</td><td>P110403</td><td></td></tr><tr><td>12 x 75 mm tubos de vidrio sin tapón</td><td>Fisher Scientific</td><td>K60B1496126</td><td>tubos de vidrio de borosilicato desechables con extremo liso</td></tr><tr><td>Matraces T25</td><td>VWR</td><td>CA15708-120</td><td>nunc Tisue Culture Matraz de 25 ml (n.º de proveedor 156340)</td></tr><tr><td>tijeras</td><td>Fine Science Tools</td><td>14068-12</td><td>tijeras Wagner pinzas afiladas/afiladas de 12 cm</td></tr><tr><td>, </td><td>recta Fine Science Tools</td><td>11008-13</td><td>Pinza Semken 13 cm,</td></tr><tr><td>recta pinza curvada</td><td>Pinza Fine Science Tools</td><td>11003-12</td><td>Narrow Pattern 12 cm, curvada</td></tr><tr><td>60 mm placas de Petri</td><td>VWR</td><td>CA25382-100</td><td>BD Falcon Placa de cultivo de tejidos 60 x 15 mm</td></tr><tr><td>, 70 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td>Filtros de células Falcon 50/caja</td></tr><tr><td>Receta PBS: 1 tableta disuelta en 200 ml de agua desionizada, ajuste el pH a 7,4 si es necesario.</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td>Tabletas de solución salina tamponada con fosfato</td></tr><tr><td>Receta de TBS: para hacer 10x caldo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 g TRIS HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3253-1KG</td><td>Clorhidrato de Trizma</td></tr><tr><td>88 g NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>Cloruro de sodio</td></tr><tr><td>2 g KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td>Cloruro de potasio</td></tr><tr><td>Disolver en 1 L de agua desionizada, ajustar el pH a 7,4</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

medición de daños y reparación del adn en esplenocitos de ratón después crónica<em&gt; en vivo</em&gt; la exposición a dosis muy bajas de beta y gamma radiación

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Exposición a la radiación en dosis bajas puede producir una variedad de efectos biológicos que son diferentes en cantidad y calidad de los efectos producidos por dosis altas de radiación. Abordar las cuestiones relacionadas con la seguridad ambiental, ocupacional y de salud pública de una manera adecuada y científicamente justificada en gran medida se basa en la capacidad de medir con precisión los efectos biológicos de los contaminantes de dosis bajas, tales como sustancias químicas y radiación ionizante. Daños en el ADN y la reparación son los más importantes indicadores tempranos de riesgos para la salud debido a sus posibles consecuencias a largo plazo, tales como el cáncer. Aquí se describe un protocolo para estudiar el efecto de la crónica exposición in vivo a dosis bajas de γ- y β-radiación en daños y reparación del ADN en las células de bazo de ratón. Utilizando un marcador comúnmente aceptada de ADN de doble filamento se rompe, la histona H2AX fosforilada llamado γH2AX, se demuestra cómo se puede utilizar para evaluar no sólo los niveles de daño en el ADN, pero también cambiaen la capacidad de reparación del ADN potencialmente producido por una baja dosis de exposición in vivo. La citometría de flujo permite la medición rápida, precisa y fiable de immunofluorescently marcado γH2AX en un gran número de muestras. Reparar el ADN de doble filamento romper puede evaluarse mediante la exposición de esplenocitos extraídos a una dosis de 2 Gy reto de producir un número suficiente de ADN se rompe para desencadenar la reparación y midiendo la inducida (1 hora después de la irradiación) y daño del ADN residual (24 hrs después de la irradiación). Daño en el ADN residual sería indicativo de reparación incompleta y el riesgo de la inestabilidad genómica a largo plazo y el cáncer. Combinado con otros ensayos y puntos finales que pueden ser fácilmente medidos en tales estudios in vivo (por ejemplo, las aberraciones cromosómicas, frecuencias de micronúcleos en reticulocitos de la médula ósea, la expresión de genes, etc.), este enfoque permite una evaluación precisa y contextual de los efectos biológicos de los factores de estrés de bajo nivel.

La Figura 2 muestra ejemplos de gráficos de citometría de flujo esperados para esplenocitos preparados usando el método descrito aquí. Las células se gated primero basado en el &lt;electrónica de dispersión del lado del volumen&gt; gráfico de dispersión (Figura 2A y 2D; volumen electrónico es equivalente a dispersión frontal). Histogramas de yodo FL3 / propidio (Figura 2B y 2E) confirman la distribución del ciclo celular normal. Señal γ...

Se presenta un protocolo para evaluar los cambios en los niveles de daño en el ADN y la capacidad de reparación del ADN que pueden ser inducidos por la irradiación crónica in vivo de baja dosis en linfocitos de bazo de ratón, mediante la medición de la histona fosforilada H2AX, un marcador de roturas de doble cadena de ADN, utilizando citometría de flujo.

Medición de daños y reparación del ADN en esplenocitos de ratón Después crónica<em&gt; En Vivo</em&gt; La exposición a dosis muy bajas de beta y gamma Radiación

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

El objetivo general del siguiente experimento es medir el daño en el ADN y su reparación inducidos en células del bazo de ratón mediante exposición crónica in vivo a bajas dosis de radiación beta o gamma. Esto se logra primero exponiendo a los ratones a radiación beta interna o radiación gamma externa para desencadenar posibles cambios en el daño y reparación del ADN. Como segundo paso, se aíslan los linfocitos PLE y se irradian con una dosis elevada de desafío de radiación gamma que induce daño en el ADN detectable, lo que permite monitorear la reparación del ADN.Con el tiempo, las células del bazo se marcan inmunológicamente con fluorescencia contra γH2AX para permitir la cuantificación del daño al ADN. En definitiva, el daño al ADN producido por dosis de radiación gamma aguda tan bajas como 10 centigrados puede medirse mediante citometría de flujo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la radioprotección, como si las bajas dosis de radiación habitualmente encontradas en entornos laborales, médicos o públicos aumentan realmente la probabilidad de efectos adversos para la salud, tales como el cáncer.Las principales ventajas de nuestra técnica frente a

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Biología

La cuantificación de ADN de doble filamento se rompe sobre la base de γH2AX focos se ha convertido en una herramienta de valor incalculable, sobre todo en biología de la radiación, para la evaluación de la radiosensibilidad del tejido y los efectos de los compuestos de la radiación modificar. Aquí se demuestra el uso de un ensayo de inmunofluorescencia para la cuantificación de γH2AX focos en muestras de tejido.

La cuantificación de γH2AX focos en muestras de tejido

Se describe aquí una plataforma que permite la detección ensayo cometa de daño en el ADN con un rendimiento sin precedentes. Los patrones de dispositivos células de mamífero en un microarray y permite el procesamiento paralelo de 96 muestras. El enfoque facilita el análisis de daño en el DNA nivel de base, daño en el ADN inducido por la exposición-y de reparación del ADN cinética.

CometChip: Un gran procesamiento Plataforma 96-Bueno, para medir el daño del ADN en las células en micromatriz Humanos

Aquí se describe un ensayo in vivo mutagénesis por un pequeño número de células hematopoyéticas purificadas utilizando el modelo de ratón transgénico LacI. El gen LacI puede ser aislado para determinar la frecuencia, la ubicación y tipo de mutantes de ADN espontáneamente surgido o después de la exposición a genotoxinas.

La identificación de mutaciones del ADN en Purificada hematopoyéticas células madre / progenitoras

La administración de dos análogos de timidina, edu y BrdU, en ratones embarazada permite el análisis de la progresión del ciclo celular en células progenitoras neurales y en el cerebro de ratón embrionario. Este método es útil para determinar los efectos del estrés genotóxico, incluyendo la radiación ionizante, durante el desarrollo del cerebro.

La evaluación de la progresión del ciclo celular de la madre neurales y células progenitoras en el cerebro en desarrollo del ratón después de estrés genotóxico

Presentamos un enfoque espectroscópico óptico difuso (DOS) que proporciona biomarcadores ópticos cuantitativos de la respuesta de la piel a la radiación. Describimos el diseño de la instrumentación del DOS, los parámetros ópticos, los algoritmos de extracción y los procedimientos de manejo de animales necesarios para obtener datos representativos de un modelo preclínico de eritema inducido por radiación en ratones.

Espectroscopia óptica difusa para la evaluación cuantitativa de la radiación ionizante aguda La toxicidad cutánea inducida utilizando un modelo de ratón

El objetivo de este protocolo es describir cómo utilizar microirradiation de láser para inducir a diferentes tipos de daños en el ADN, como roturas de cadena relativamente simple y complejo daño, para el estudio de ADN daños reparación y señalización de factor Asamblea en sitios de daño en vivo .

Microirradiation láser para estudiar In Vivo las respuestas celulares al daño en el ADN Simple y complejo

Confocal de la fluorescencia microscopía láser micro-irradiación oferta herramientas y para inducir daño en el ADN y control de la respuesta de proteínas de reparación del ADN en áreas seleccionadas de las nucleares. Esta técnica ha avanzado significativamente nuestro conocimiento de detección de daño, las señales y reclutamiento. Este manuscrito muestra estas tecnologías para examinar reparación de rotura de filamento solo y doble.

Aplicación de Micro-la irradiación del Laser para la examinación de Single y doble filamento romper reparación en células de mamíferos

Este protocolo describe varios procedimientos para preparar muestras de tejido congelado de alta calidad en el momento de la necropsia para su uso en el ensayo del cometa para evaluar el daño del ADN: 1) tejido picado, 2) células epiteliales raspadas del tracto gastrointestinal, y 3) tejido en cubos muestras, que requieren homogeneización utilizando un dispositivo de picado de tejido.

Uso de tejido congelado en el ensayo de cometas para la evaluación del daño causado por el ADN

El tracto gastrointestinal es uno de los órganos más sensibles a las lesiones en los tratamientos radioterapéuticos contra el cáncer. Es simultáneamente un sistema de órganos con una de las capacidades regenerativas más altas después de tales insultos. El protocolo presentado describe un método eficiente para estudiar la capacidad regenerativa del epitelio intestinal.

Regeneración epitelial intestinal en respuesta a la irradiación ionizante

El protocolo describe un estudio de los efectos sistémicos y locales en la piel de la exposición a los rayos ultravioleta B en ratones.

Estudio de la exposición crónica de ratones a la radiación ultravioleta B 

Aprende a medir daños y reparación del ADN en esplenocitos de ratón expuestos a radiación beta y gamma de baja dosis usando citometría de flujo. Este método permite cuantificar roturas de doble cadena mediante marcadores de H2AX.

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Medición de daños y reparación del ADN en esplenocitos de ratón Después crónica

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