Visualización de condrocitos Intercalación y direccional proliferación a través de análisis celular clonal Zebrabow en el cartílago de la embrionaria Meckel

El objetivo general del siguiente experimento es visualizar la intercolación y extensión de los condrocitos mediante el análisis clonal de células de zebrafish con sistema Bow. Esto se logra generando una línea M de zebrafish SOX10 ERT2-CreERT para obtener una recombinación específica del tejido en el cartílago facial craneal y embriones para el análisis clonal. A continuación, los embriones se tratan con tamoxifeno en el estadio de 10 somitas durante tres horas para inducir el proceso de recombinación.

Luego, los embriones se seleccionan según la expresión de la actividad CRE y una fuerte expresión de fluorescencia roja o RFP, y los embriones se montan para la obtención de imágenes del cartílago craneofacial. Los resultados muestran un análisis celular multiespectral de los condrocitos craneofaciales basado en imágenes confocales. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la tinción S en azul o líneas transgénicas como so y GFP o SOX y kde, es que zebra bow nos permite observar y seguir específicamente poblaciones celulares clonales implicadas en la formación de un órgano.

Para preparar la recolección de embriones el día uno, configure varias parejas de machos y hembras de sox, 10 ERT dos Cree zebra bow M peces cebra transgénicos en tanques de apareamiento divididos entre las 5:00 y las 6:00 PM del día siguiente, después de verificar bajo un microscopio óptico que los embriones han alcanzado la etapa de 10 células, observando bajo un microscopio fluorescente con filtro RFP. Aísle los embriones de color rojo brillante y transfiéralos a una nueva placa de Petri con medio E tres fresco para inducir la recombinación Cree. Añada una solución de hidroxitamoxifeno de 10 micromolar a la placa de Petri e incube los embriones a 28,5 grados Celsius durante tres horas.

Luego, vierta la solución de tamoxifeno en un recipiente para desechos biológicos y use E3 para lavar los embriones varias veces tras incubarlos durante la noche hasta el estadio de 28 a 29 horas post fertilización. Transfiera los embriones a una solución de E3 con PTU y devuélvalos al incubador. Para visualizar las estructuras craneofaciales completamente desarrolladas, seleccione embriones a las 4 DPF con una señal roja intensa y expresión de Yellow Cree en la retina. Después de anestesiar un embrión en Trica, según el protocolo descrito, transfiéralo a una placa de Petri que contenga una gota de metilcelulosa sobre un portaobjetos limpio para microscopía confocal.

Coloque una gota de metilcelulosa fresca y utilice una punta de microcargador para montar el embrión en posición dorsal, teniendo cuidado de no tocarlo directamente con un cubreobjetos de 25 por 25. Cubra el embrión y use el cubreobjetos para manipularlo si es necesario. Para obtener imágenes del embrión, utilice un objetivo seco de 20 x.

Para enfocar el sujeto, presione el botón L 100 en el microscopio y luego seleccione el botón de configuración confocal. Haga clic en automático y seleccione CFP para el canal uno, GFP para el canal dos y RFP o M cherry para el canal tres. A continuación, cierre la ventana.

Encienda los canales dos y tres antes de hacer clic en el botón de retirar el interbloqueo. Luego, haga clic en reproducir para comenzar la exploración. Después de ajustar los parámetros, capture las imágenes deseadas y guárdelas en el formato de software confocal y también en formato TIF para el procesamiento de imágenes por canal.

Para realizar la imagenología de CFP, apague los canales dos y tres y encienda el canal uno sin cambiar el área de enfoque. Ajuste nuevamente la configuración de escaneo antes de capturar las imágenes, guarde las imágenes como se acaba de describir y realice el procesamiento de imágenes según lo descrito por Pan y colegas, como se muestra aquí. La visualización tradicional del cartílago mediante tinción con azul de Safranina en preparaciones completas ha sido invaluable para observar el desarrollo del cartílago de Meckel y se utiliza comúnmente para visualizar la organización celular final, con el fin de analizar más detalladamente la línea celular de los condrocitos en desarrollo a lo largo del tiempo.

El uso de líneas transgénicas de SOX 10 kda ha permitido estudiar la migración celular y la convergencia y extensión en embriones vivos mediante imágenes en vivo de la línea transgénica de pez cebra m. Para estudiar más a fondo la organización de los condrocitos en la estructura esquelética craneofacial, se revela el proceso de intercalación y alargamiento de los condrocitos que media la extensión y el crecimiento del cartílago de Meckel. Esta figura muestra la mandíbula inferior de embriones transgénicos de pez cebra M Sox 10 ERT2 Cre entre 3 y 5 días post-fertilización.

La mandíbula se observa mejor en vista ventral para permitir una visualización clara de la organización celular en el cartílago meles, como se muestra aquí. Los colores estables y heredados permiten un seguimiento sencillo de linajes y la cartografía del destino celular de las células de la cresta neural craneal. La única célula azul parece migrar e interpolarse con sus células vecinas, luego se alarga a lo largo del eje anterior-posterior para formar un sitio condral uniforme, manteniendo así la forma global del cartílago meles a medida que se extiende hacia delante.

Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo del desarrollo felino examinen el condro en la formación esquelética del pez cebra.