Visualización de condrocitos Intercalación y direccional proliferación a través de análisis celular clonal Zebrabow en el cartílago de la embrionaria Meckel

El objetivo general del siguiente experimento es visualizar la intercotejación y extensión de condrocitos a través del análisis de células clonales de arco de cebra. Esto se logra mediante la generación de una línea M de arco de cebra SOX 10 ERT dos Cree para lograr la recombinación específica de tejido en el cartílago facial craneal y embriones para análisis clonal. A continuación, los embriones se pulsan con tamoxifeno a las 10, por lo que se emiten ácaros durante tres horas para inducir el proceso de recombinación.

A continuación, se seleccionan los embriones para la expresión de la actividad CRE y la fuerte expresión de fluorescentes rojos o RFP, y los embriones se montan para la obtención de imágenes del cartílago craneofacial C. Los resultados muestran un análisis celular multiespectral de los condrocitos craneofaciales basado en imágenes confocales. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes como la tinción S en azul o líneas transgénicas como so y GFP o SOX y kde, es que el arco de cebra nos permite observar y seguir específicamente las poblaciones de células clonales implicadas en la formación de un órgano.

Para prepararse para la recolección de embriones el primer día, coloque varias parejas de machos y hembras de sox, 10 ERT dos peces cebra transgénicos Cree bow M en tanques de apareamiento divididos entre las cinco y las 6:00 p.m. del día siguiente después de verificar bajo un microscopio óptico que los embriones han alcanzado la etapa de celulitis 10 bajo un microscopio fluorescente con un filtro RFP. Aísle los embriones de color rojo brillante y transfiéralos a una nueva placa de Petri con medio E tres fresco para inducir la recombinación de Cree. Agregue 10 micromolares de solución de hidroxi tamoxifeno a la placa de Petri e incube los embriones a 28,5 grados Celsius durante tres horas.

Luego decantar la solución de tamoxifeno en un contenedor de desechos biológicos y usar E tres para lavar los embriones varias veces después de incubar los embriones durante la noche hasta la etapa de 28 a 29, por lo que los ácaros, transfiera los embriones a la solución E tres PTU y devuélvalos a la incubadora. Para visualizar las estructuras craneofaciales C completamente desarrolladas, seleccione embriones a cuatro DPF con una señal roja intensa y una expresión amarilla de Cree en la retina. Después de anestesiar un embrión en Trica, de acuerdo con el protocolo de texto, transfiéralo a una placa de Petri que contenga una gota de metilcelulosa en un portaobjetos confocal limpio.

Coloque una gota de metilcelulosa fresca y use una punta de micro cargador para montar el embrión colocado dorsalmente teniendo cuidado de no tocarlo directamente con un cubreobjetos de 25 por 25. Cubra el embrión y utilice el cubreobjetos para manipular el embrión si es necesario. Para obtener una imagen del embrión, use un objetivo de lente seco de 20x.

Para enfocar el sujeto, pulse el botón L 100 del microscopio y, a continuación, seleccione el botón de configuración confocal. Haga clic en automático y seleccione el CFP para el canal uno, GFP para el canal dos y RFP o M cherry para el canal tres. A continuación, cierre la ventana.

Encienda los canales dos y tres antes de hacer clic en el botón de eliminación de enclavamiento. A continuación, haga clic en reproducir para comenzar a escanear. Después de ajustar la configuración, capture las imágenes deseadas y guárdelas en el formato de software confocal, así como en formato TIF para el procesamiento de imágenes por canal.

Para llevar a cabo la adquisición de imágenes CFP, apague los canales dos y tres y active el canal uno sin cambiar el área de enfoque. Vuelva a ajustar la configuración de escaneo antes de capturar imágenes, guarde las imágenes como se acaba de describir y lleve a cabo el procesamiento de imágenes como lo describen Pan y colegas, como se muestra aquí. La visualización tradicional del cartílago mediante la tinción completa de azul de Mount Sian ha sido invaluable para observar el cartílago mekel en desarrollo y se usa comúnmente para visualizar la organización celular final para analizar más a fondo los condrocitos en desarrollo a lo largo del seguimiento del linaje con el tiempo.

El uso de líneas transgénicas SOX 10 kda se ha utilizado para estudiar la migración celular y la convergencia y extensión en embriones vivos utilizando imágenes en vivo de la línea transgénica zebra bow m. Para profundizar en el estudio de la organización de los condrocitos en el C, la estructura esquelética craneofacial revela el proceso de intercolado y elongación de los condrocitos que media la extensión y el crecimiento del cartílago de Meckel. Esta figura muestra la mandíbula inferior de los embriones transgénicos M Sox 10 ERT de UI zebra bow M Sox 10 Cree entre 3D PF y cinco días después de la fertilización.

La mandíbula inferior se representa mejor ventralmente para permitir una visión clara de la organización celular en el cartílago meles, como se muestra aquí. Los colores mantenidos y heredados de manera estable permiten un fácil rastreo del linaje y el mapeo del destino de las células de la cresta neural craneal. La única célula azul parece migrar e interpolarse con sus células vecinas, luego se alarga a lo largo del eje anterior posterior para formar un sitio de condra de forma uniforme, manteniendo así la forma global del cartílago meles a medida que se extiende anteriormente.

Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo del desarrollo felino examinen el condro en la formación del esqueleto del pez cebra.