Name: Producción de Nurr-1 específico anticuerpos policlonales Libre de reactividad cruzada contra su estrecha homólogos, NOR1 y Nur77 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Aprende a aumentar la especificidad de anticuerpos policlonales contra proteínas homólogas mediante la eliminación de anticuerpos cruzados. Este método utiliza dominios proteicos divergentes y cromatografía de afinidad.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los NIH (NS070577 y NS084869).

Nota: La composición de todas las soluciones citadas a continuación se puede encontrar en la Tabla de Materiales / Equipo. 1. columna de proteína A Purificación de anticuerpos <ol><li> Equilibrar una proteína de una columna de centrifugación y todos los tampones necesarios a temperatura ambiente durante 15 min antes de iniciar el procedimiento. </li><li> Diluir el suero inmune 1: 1 con Proteína A IgG Binding Buffer. (Se recomienda 5 ml de suero). </li><li> Golpee suavemente una columna de proteína vuelta en la mesa de trabajo para desalojar cualquier resina que puede ser alojada en la tapa. Retire la tapa superior y coloque suavemente el cierre inferior. Colocar la columna en un tubo de recogida de 15 ml y permita que la solución de almacenamiento para drenar. </li><li> Añadir 5 ml de Proteína A IgG Binding Buffer y permita que la solución drene. </li><li> Aplicar el suero inmune diluido a la columna y recoger el flujo a través. Para obtener los mejores resultados, añadir un volumen de muestra que contiene una concentración de anticuerpos de menos de 80% de la unión del anticuerpo-capacit de la columnay. </li><li> Lavar la columna con 15 ml de Proteína A IgG Binding Buffer o hasta que la absorbancia a 280 nm es inferior a 0,1. </li><li> Añadir 100 l de tampón de neutralización a cinco tubos de recogida etiquetados. </li><li> Añadir 5 ml de tampón de elución de IgG a la columna de Proteína A y recoger fracciones de 1 ml en cada uno de los tubos que contienen los 100 l de tampón de neutralización. </li><li> Medir la absorbancia de cada fracción a 280 nm y las fracciones de la piscina con una absorbancia mayor que 0.5. Mantenga las fracciones agrupadas en hielo hasta que esté listo para la diálisis. </li><li> Regenerar la columna mediante la adición de 8 ml de IgG tampón de elución y permita que la solución fluya a través de la columna. </li><li> Lavar la columna con una solución de proteína de unión Una IgG hasta que el pH eluyente vuelve a 7.4. </li><li> Almacenar la columna mediante la adición de 5 ml de solución de almacenamiento (azida de sodio 0,02% en PBS). Cuando aproximadamente 3 ml permanecen en la columna, la tapa inferior y asegurar la tapa superior. Guarde la columna a 4 ° C. </li><li> Determinar la longitud otubos de diálisis f necesario de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El uso de tubos de 16 mm de diámetro plana usar 5,47 cm de longitud del tubo por ml de solución que se dializa. Corte el tubo y enjuagar con PBS pH 7,4 durante 15 a 30 min. </li><li> Doblar y el clip un extremo del tubo de diálisis, transferir la IgG reunidas que contienen fracciones a tubos de diálisis equilibrada en PBS pH 7,4 y cerrar el otro extremo. </li><li> Se dializa a temperatura ambiente contra 200 volúmenes de PBS pH 7,4 durante 2 h. </li><li> Cambiar el tampón de diálisis (fresco PBS pH 7,4) y se dializa durante otras 2 horas a temperatura ambiente. </li><li> Cambiar el tampón de diálisis (fresco PBS pH 7,4) y se dializa durante la noche a 4 ° C. </li><li> Mantener la solución de anticuerpo dializada a 4 ° C hasta que esté listo para proceder con etapas de purificación adicionales. </li><li> Evaluar la concentración de anticuerpo utilizando su absorbancia a 280 nm y el coeficiente de absorción molar de anticuerpos a 280 nm de 210.000 M -1 cm -1 12. </li></ol> 2. Acoplamiento de LBD proteínas para Aminolink Acoplamiento Resina <ol><li> Prepare dos columnas, una para NOR1 y el otro para Nur77. Siga el mismo protocolo para ambas proteínas. </li><li> Descongelar la proteína que se acopla a la resina en hielo. Determinar la concentración de proteína usando su coeficiente de extinción molar y su absorbancia a 280 nm 12. <ol><li> Alternativamente, utilizar un ensayo de determinación de proteínas tales como el ensayo de 13 ácido bicinconínico. Si la proteína se disuelve en un intercambio de Diálisis tampón que contiene amina o tampón contra el enganche de tope. Si la proteína es en un tampón adecuado (no hay aminas libres) diluirlo 4 veces en tampón de acoplamiento. </li></ol></li><li> Utilice 2 ml de resina para 2 mg de proteína. Todos los pasos que siguen son para la resina de 2 ml en una columna de 10 ml. Hasta 10 mg de proteína puede ser vinculado por 1 ml de resina (2 ml de 1: 1 de suspensión). </li><li> Preparar una columna de 10 ml empujando una frita a la parte inferior y funcionando PBS pH 7,4 a través de él. Cap tél parte inferior de la columna y añadir 2 ml de Coupling Buffer. </li><li> Añadir el volumen deseado de suspensión (4 ml para obtener 2 ml de resina) a la columna, retire la tapa inferior y dejar que el drenaje de la columna. Lavar la columna con un total de 6 ml (volumen 3 de resina de lecho) de acoplamiento de búfer y permitir que la columna se drene. Después de que el tampón de acoplamiento ha drenado, coloque la tapa inferior. </li><li> Añadir 2-4 ml de proteína en suspensión en tampón de acoplamiento a la columna (mantener una alícuota de la solución de proteína para evaluar la eficiencia de acoplamiento mediante la comparación de la concentración de proteína del eluato en el paso 2.11 utilizando la absorbancia a 280 nm o el ensayo bicinconínico) . Tapar y mezclar de punta a punta para tener una solución homogénea. </li><li> Pesar un tubo de microcentrífuga de 1,8 ml vacío y pasar a la campana de humos. Transferir cuidadosamente NaCNBH3 (aproximadamente 0,05 g) en el tubo pesado previamente. Cerrar el tubo y pesar el tubo que contiene NaCNBH3. No abra el tubo fuera del capó. </li><li> Basado en el peso deNaCNBH3 transferido en el tubo, hacer una solución 5 M mediante la adición de 1 M NaOH. El peso molecular de NaCNBH3 es 62,84 g, por lo tanto 0.05 g es igual a (0,05 / 62,84 = 7,96 x 10 -4 moles) 7,96 x 10 -4 moles. Para hacer una solución add 5 M (7,96 x 10 -4/5) 159 l de 1 M NaOH. </li><li> Medir el volumen total de la reacción que tiene el volumen de resina en consideración. Añadir 10 l de 5 M NaCNBH3 por ml de reacción. <ol><li> Por ejemplo: para un volumen de reacción 4 ml añadir 40 l de 5 M NaCNBH3. Para 1 ml de resina y 3 ml de proteína añadida, el volumen total es de 4 ml. </li></ol></li><li> Tape la columna y la mezcla de punta a punta. Asegure la columna en un rotador tubo y dejar que la reacción continúe durante la noche a 4 ° C. </li><li> Por la mañana, llevar la columna a la campana química y cuidadosamente quite la tapa como un poco de gas puede haberse formado. Escurrir la columna en un tubo limpio y guardar el eluido para medir la concentración de proteínacentración mediante la absorbancia a 280 nm Método 12 o el ensayo de ácido bicinconínico y compararla con la concentración de proteína de partida en el paso 2.6. </li><li> Lavar la resina con 4 ml de acoplamiento Buffer y dejar que la fuga de la columna. </li></ol> 3. Sitios Bloqueo restante <ol><li> Lavar la resina con 4 ml de tampón de enfriamiento. Escurra y coloque la tapa inferior. Añadir 2 ml de tampón de extinción y suspensión de la resina. </li><li> Evaluar el volumen total de reacción midiendo el volumen de resina y el volumen de tampón de temple a continuación, añadir 10 l de 5 M NaCNBH3 por ml de volumen de reacción. </li><li> Mezclar suavemente a temperatura ambiente durante 30 min de extremo a extremo. Después de 30 min, traer la columna en la campana de humos. Retire con cuidado la tapa y retire la tapa inferior y dejar que la fuga de la columna en un tubo de residuos. </li><li> Lavar la columna con 5 volúmenes de resina de solución de lavado. Monitorear los lavados para la presencia de proteínas residuales mediante la medición de abso del eluatorbance a 280 nm. Proteínas desacopladas se lavan a cabo por la alta concentración de sal. </li><li> Lavar la resina con 6 ml de desgasificado PBS pH 7,4 que contiene azida de sodio al 0,02%. Mantenga la columna a 4 ° C hasta que se necesite. </li></ol> 4. Purificación de Nurr1 anticuerpos específicos <ol><li> Enjuague la columna junto Nur77 LBD con 10 ml de PBS pH 7,4 y dejar que la fuga de la columna. Tapar el fondo de la columna y colocar el Nur77 LBD columna junto drenado en un nuevo tubo de recogida de 15 ml. </li><li> Añadir 5 ml de proteína A anticuerpos anti-Nurr1 purificados, limitar la columna y colocar en un rotador a 4 ° C durante 1 hora. Retire las tapas superior e inferior y recoger el flujo a través. Ponga a un lado en el hielo hasta que esté listo para agregar a la columna junto NOR1 LBD. </li><li> Enjuague la columna junto NOR1 LBD con 10 ml de PBS pH 7,4 y dejar que la fuga de la columna. Tapar el fondo de la columna y colocar el NOR1 LBD columna acoplada en un tubo de recogida de 15 ml. </li><li> Añadir el flujo a través del golpe Nur77 LBDcolumna encabezada, la tapa de la columna y colocar en un rotador a 4 ° C durante 1 hora. Retire las tapas superior e inferior y recoger el flujo a través. </li><li> Medir la concentración de anticuerpo midiendo la absorbancia a 280 nm. </li></ol> Análisis basado en ELISA 5. purificada de Anti-Nurr1 Anticuerpo <ol><li> Añadir 100 l de proteína (2,5 g / ml) a los pocillos de una placa de 96 pocillos. Si las pruebas 3 proteínas diferentes, añadir 100 l de proteína 1 de pozos A1 a H4, 100 l de la proteína 2, a pozos A5 a H8 y 100 l de proteína 3 a pozos A9 a H12. Cubrir la placa e incubar durante la noche a 4 ° C. </li><li> Lavar los pocillos recubiertos dos veces con 300 l por pocillo de PBS pH 7,4 y añadir 300 l de tampón de bloqueo ELISA a la totalidad de los pocillos recubiertos de antígeno y se incuba 2 horas a temperatura ambiente. </li><li> Mientras que la placa está bloqueando preparar una dilución de partida deseado de anticuerpo anti-Nurr1 purificado (que van de 10 a 100 g / ml) en tampón de bloqueo ELISA. </li><li> Después de 2 horas de bloqueo, reemplazar el tampón de bloqueo ELISA con 100 l de tampón bloque fresca ELISA a todos los pocillos. </li><li> Añadir 100 l de anticuerpo anti-Nurr1 purificada diluida a todos los pocillos de la fila A. En serie diluir los anticuerpos mediante la transferencia de 100 l de solución de la fila A de los pozos en la fila B seguido de la transferencia de 100 l de solución de la fila B a la fila C continuando hasta la fila G. Después de mezclar las soluciones en los pocillos de la fila G descartar los extra de 100 l. Wells en la fila H sólo reciben los iniciales 100 l de tampón de bloqueo. Incubar a temperatura ambiente durante 1 hr. </li><li> Lavar la placa tres (3) veces con 300 l por pocillo de 0,05% de Tween 20 en PBS pH 7,4 y seque la placa para eliminar el exceso de tampón de lavado. </li><li> Añadir 100 l de peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado de cabra anti-IgG de conejo diluido en tampón de bloqueo ELISA (1: 8000 dilución; la gama típica es de 1: 5.000 a 1: 25.000). Incubar a temperatura ambiente durante 1 hr. </li><li> Lavar las placas ªree (3) veces como se describe en 5.6. Enjuague todos los pocillos llenándolos con 300 l de agua desionizada. Seque el exceso de agua invirtiendo la placa sobre papel absorbente. </li><li> Añadir 100 l de 3, 3 &#39;, 5, 5&#39; tetrametilbencidina (calentó a temperatura ambiente) a todos los pocillos e incubar 15 a 30 min en la oscuridad a temperatura ambiente. </li><li> Detener la reacción mediante la adición de 50 l de 2 NH 2 SO 4. </li><li> Leer la absorbancia a 450 nm restando fondo a 650 nm. </li></ol>

<ol><li>Hawk, J. D., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+NR4A+transcription+factors+in+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Bull%22%5BJournal%5D)">The role of NR4A transcription factors in memory formation.</a> Brain Res. Bull. 85 (1-2), 21-29 (2011).</li>
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<li>Hawk, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NR4A+nuclear+receptors+support+memory+enhancement+by+histone+deacetylase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">NR4A nuclear receptors support memory enhancement by histone deacetylase inhibitors.</a> J. Clin. Invest. 122 (10), 3593-3602 (2012).</li>
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<li>Gill, S. C., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+protein+extinction+coefficients+from+amino+acid+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data.</a> Anal. Biochem. 182 (2), 319-326 (1989).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Zetterström, R. H., Williams, R., Perlmann, T., Olson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+expression+of+the+immediate+early+transcription+factors+Nurr1+and+NGFI-B+suggests+a+gene+regulatory+role+in+several+brain+regions+including+the+nigrostriatal+dopamine+system%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Mol.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular expression of the immediate early transcription factors Nurr1 and NGFI-B suggests a gene regulatory role in several brain regions including the nigrostriatal dopamine system.</a> Brain Res. Mol. Brain Res. 41 (1-2), 111-120 (1996).</li>
<li>Xiao, Q., Castillo, S. O., Nikodem, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+messenger+RNAs+for+the+orphan+nuclear+receptors+Nurr1+and+Nur77+%28NGFI-B%29+in+adult+rat+brain+using+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distribution of messenger RNAs for the orphan nuclear receptors Nurr1 and Nur77 (NGFI-B) in adult rat brain using in situ hybridization.</a> Neuroscience. 75 (1), 221-230 (1996).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El éxito de este protocolo se basa en la disponibilidad de proteínas puras para la caracterización de los anticuerpos generados contra un miembro específico de la familia de proteínas de interés. No hay necesidad de purificar los anticuerpos usando proteína A / G hasta que se establezca claramente que no son significativas reactividades cruzadas por ELISA y Western Blot. Como se indica en el texto, es importante para evitar la suspensión de la proteína (s) a ser reticulado a la columna en un...

El factor de transcripción Nurr1 y sus homólogos (Nur77 y NOR1) pertenecen a la subfamilia de receptores nucleares 4A (NR4A) 1. También son receptores huérfanos porque sus ligandos endógenos no son identificados todavía. Nurr1 se clonó por primera vez en 1992 y aunque sabe que se expresa en el cerebro 2, su papel esencial para el desarrollo y mantenimiento de las neuronas de dopamina del cerebro medio fue revelado por estudios de ratones knockout 3. Además, su importante papel para el mantenimiento de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo se demostró recientemente por un estudio knockout condicional 4. Debido a estos estudios elegantes que muestran papeles críticos de Nurr1 para las neuronas de dopamina del cerebro medio, muchos estudios posteriores se han centrado en gran medida en el cerebro medio neuronas de dopamina y trastorno neurodegenerativo relacionada con la dopamina, enfermedad de Parkinson (PD) 5. Notablemente, Nurr1 se expresa no sólo en las neuronas de dopamina del cerebro medio (MDA), sino también en diáreas cerebrales versículo 2, lo que sugiere que puede tener un papel funcional en muchas áreas no-DA, que está fuertemente apoyadas por estudios más recientes muestran que Nurr1 juega un papel importante en varias funciones cerebrales. Para ejemplos, se demostró que las actividades de inducción de memoria tales como el aprendizaje, u otras tareas dependiente del hipocampo da lugar a la regulación de la expresión de Nurr1 en el hipocampo 6,7. Además, derribar de expresión Nurr1 en el hipocampo fue suficiente para afectar la memoria a largo plazo y / o la plasticidad sináptica 8-11, lo que sugiere fuertemente que Nurr1 juega diversos papeles en muchas áreas del cerebro. Por lo tanto, para entender mejor la expresión de tipo celular específico y subcelular de Nurr1, es deseable usar anticuerpos-Nurr1 específico, que no presentan ninguna reactividad cruzada con sus homólogos Nur77 o NOR1. En este trabajo se describe un protocolo pre-adsorción para generar anticuerpos Nurr1 específica y presentar datos adicionales que muestran su especificidad.

<table><tbody><tr><td>Dominio de unión de ligando purificado de la columna Nurr1, Nor 1 y Nur77</td><td></td><td></td><td>Solución de almacenamiento</td></tr><tr><td>Resina y kit de acoplamiento AminoLink Thermo</td><td>Scientific</td><td>44890</td><td></td></tr><tr><td>Columna de centrifugación de proteína A</td><td>Thermo Scientific</td><td>89978</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>96 pocillos. Placas de fondo de flauta, brida alta, 330 y mu; l</td><td>Thermo Scientific</td><td>3455</td><td></td></tr><tr><td>10% Suero de cabra normal</td><td>KPL</td><td>50-675-69</td><td></td></tr><tr><td>Diluyente de leche / Concentrado bloqueante &nbsp;</td><td>KPL</td><td>50-82-01</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de elución IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>21004</td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA Kit de ensayo de proteínas</td><td>Thermo Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Rábano picante Peroxidasa conjugada de cabra anti-conejo IgG (H+L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>31460</td><td></td></tr><tr><td>Resina Ni-NTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>88221</td><td></td></tr><tr><td>3, 3', 5, 5' Tetrametilbencilidina</td><td>Thermo Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>2N H2SO4</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>H381 05</td><td></td></tr><tr><td>Proteína A Tampón de unión a IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>21001</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de elución de IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>21004</td><td></td></tr><tr><td>Solución</td><td></td><td></td> de almacenamiento en columna <td>Fosfato tamponado Solución salina que contiene azida sódica al 0,02 %</td></tr><tr><td>Spectra/Por 7 Tubo de diálisis pretratado</td><td>Spectrum Labs</td><td>132128</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Columnas desechables</td><td>Thermo Scientific</td><td>29924</td><td></td></tr><tr><td>AminoLink Tampón</td><td></td><td></td> de acoplamiento <td>0,1M Fosfato de sodio, 0,05% NaN3, pH 7,0</td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> de enfriamiento <td>1M Tris. HCI, 0,05% NaN3, pH 7,4</td></tr><tr><td>Solución de</td><td></td><td></td> lavado <td>1M NaCl, 0,05% NaN3</td></tr><tr>Tampón <td></td><td></td><td>de bloqueo ELISA</td><td>1% Suero normal de caballo (NHS), 1% Suero normal de cabra (NGS) en 1X KPL diluyente de leche</td></tr><tr><td>Solución</td><td></td><td></td><td>de almacenamiento PBS pH 7,4 que contiene 0,02% azida sódica</td></tr><tr><td>Micropipetas: 10 &mu; l; 20 &mu; l; 200 &mu; l; 1000 &mu; l</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

producción de nurr-1 específico anticuerpos policlonales libre de reactividad cruzada contra su estrecha homólogos, nor1 y nur77

Production of Nurr-1 Specific Polyclonal Antibodies Free of Cross-reactivity Against Its Close Homologs, Nor1 and Nur77

La subfamilia de receptores nucleares 4 (NR4A) está compuesta por 3 proteínas relacionadas que comparten un dominio de unión al ADN (DBD) y un dominio de unión al ligando (LBD). La proteína 1 relacionada con el receptor nuclear (Nurr1 o NR4A2) desempeña un papel clave en el mantenimiento del sistema dopaminérgico. Las disfunciones de dopamina asociadas con el gen Nurr1 incluyen la enfermedad de Parkinson, la esquizofrenia y la depresión maníaca, entre otras. Además, la evidencia reciente indica que Nurr1 también se expresa en otras áreas del cerebro, como el hipocampo, y desempeña un papel fundamental para el aprendizaje y la memoria. Los otros miembros de la familia son el factor de crecimiento nervioso IB (Nur77 o NR4A1) y el receptor huérfano derivado de neuronas 1 (NOR1 o NR4A3). Para ayudar a investigar las funciones precisas de Nurr1 en las disfunciones neuronales dopaminérgicas y otras disfunciones neuronales relacionadas con la región cerebral, se necesitaban anticuerpos desprovistos de reactividades cruzadas contra Nur77 y NOR1. Dado que las proteínas son más divergentes en sus LBD que en sus dominios de unión al ADN, la inmunización con LBD purificadas debería producir anticuerpos específicos para Nurr1 con reactividades mínimas contra Nur77 y/o NOR1. Aunque los anticuerpos anti-Nurr1 se generaron con éxito, estos mostraron una inmunorreactividad significativa contra los demás miembros de la familia. La cromatografía de afinidad sobre la proteína A inmovilizada, seguida de preadsorción contra las LBD Nur77 y NOR1 inmovilizadas, produjo anticuerpos específicos de Nurr1 libres de reactividad cruzada. Aquí, dirigimos selectivamente los anticuerpos contra un miembro específico de una familia de proteínas altamente conservadas mediante la inmunización de animales con sus regiones más divergentes y luego la eliminación de anticuerpos reactivos cruzados mediante preadsorción. El objetivo del protocolo es aumentar la especificidad de los anticuerpos policlonales a través de la preadsorción frente a antígenos de reacción cruzada.

Una comparación de columna de proteína A purificada anticuerpos Nurr1 específica con la proteína A anticuerpos anti-Nurr1 purificados seguido por paso a través Nur77 LBD y NOR1 LBD columnas se muestra en la Figura 1. Como puede verse, la proteína A-anticuerpo purificado Nurr1 exhibió una fuerte unión a Nurr1 LBD. Sin embargo, también mostró unión significativa a Nur77 LBD y para NOR1 LBD. Cuando Proteína A-Nurr1 anticuerpos purificados se purificaron adicionalmente contra Nur77 LBD y NOR1 LBD, la afinid...

Aquí, dirigimos selectivamente anticuerpos contra un miembro específico de una familia de proteínas altamente conservadas mediante la inmunización de animales con sus regiones más divergentes y luego la eliminación de anticuerpos reactivos cruzados por preadsorción.

Producción de Nurr-1 específico anticuerpos policlonales Libre de reactividad cruzada contra su estrecha homólogos, NOR1 y Nur77

The nuclear receptor subfamily 4 (NR4A) is composed of 3 related proteins sharing a DNA binding domain (DBD) and a ligand-binding domain (LBD). The ...

El objetivo general de este procedimiento es aumentar la especificidad de los anticuerpos contra proteínas estrechamente relacionadas mediante la eliminación de anticuerpos cruzados. Esto se logra primero identificando los dominios proteicos con mayor divergencia entre proteínas homólogas. El segundo paso consiste en expresar y purificar estos dominios proteicos.A continuación, estos dominios proteicos se acoplan mediante el extremo N o C a una matriz de cromatografía. En esta demostración se utiliza Spheros. El paso final consiste en incubar suero inmune con resinas acopladas a cada dominio cruzado-reactivo.Finalmente, se realizan ELISA y transferencia Western para evaluar la eficacia del procedimiento. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como el uso de anticuerpos monoclonales o la purificación por afinidad, es que podemos mantener la afinidad contra el objetivo deseado mientras eliminamos los epítopos conocidos por reacción cruzada. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la proteína que intentan estudiar es inestable.El Dr. Uri Kim, investigador postdoctoral de nuestro laboratorio, demostrará este procedimiento. Este estudio requiere dos columnas, una para el receptor huérfano derivado de neuronas, también conocido como nor1, y otra para el factor de crecimiento neuronal IB o nor-77. Dado que el mismo protocolo se aplica a ambas proteínas, solo se demostrará la preparación de una columna.Deshiele la proteína que se va a acoplar a la resina sobre hielo y luego determine la concentración de la proteína utilizando su coeficiente de extinción molar y su absorbancia a 280 nanómetros. Utilice dos mililitros de resina por dos miligramos de proteína. Todos los pasos siguientes son para dos mililitros de resina.En una columna de 10 mililitros, prepare una columna de 10 mililitros empujando un FR hasta el fondo y pasando PBS pH 7,4 a través de ella. Tape el extremo inferior de la columna y agregue dos mililitros de tampón de acoplamiento. Añada cuatro mililitros de la suspensión a la columna para obtener dos mililitros de resina.Retire el tapón inferior y deje escurrir la columna. Lave la columna con un total de seis mililitros o tres volúmenes de lecho de resina del tampón de acoplamiento y permita que la columna se drene. Una vez drenado el tampón de acoplamiento, sustituya el tapón inferior.A continuación, agregue de dos a cuatro mililitros de proteína suspendida en tampón de acoplamiento a la columna. Guarde una alícuota de la solución de proteína para evaluar la eficiencia de acoplamiento. Posteriormente, tape la columna y mezcle de extremo a extremo.Para obtener una solución homogénea, mida el volumen total de la reacción, teniendo en cuenta el volumen de la resina, y agregue 10 microlitros de borohidruro de sodio cinco molar por mililitro de reacción. Tape la columna y mezcle de extremo a extremo. Fije la columna en un rotador de tubos y deje que la reacción continúe durante la noche.A cuatro grados Celsius a la mañana siguiente, lleve la columna a la campana química y retire cuidadosamente la tapa, ya que podría haberse formado algo de gas. Drene la columna en un tubo limpio y guarde el ilu. Se medirá la concentración de proteína del IIT y se comparará con la concentración de proteína inicial.Para evaluar la eficiencia de acoplamiento, lave la resina con cuatro mililitros de tampón de acoplamiento y deje que la columna drene. Una vez que el dominio de unión al ligando o LBD se ha acoplado a la resina, el siguiente paso consiste en bloquear los sitios restantes. Para iniciar este procedimiento, lave la resina con cuatro mililitros de tampón de bloqueo, drene y reemplace la tapa inferior.Añada dos mililitros de tampón de apagado y suspenda la resina. Evalúe el volumen total de la reacción midiendo el volumen de la resina y el volumen del tampón de apagado. Añada 10 microlitros de borohidruro de sodio cianuro cinco molar por mililitro de volumen de reacción.Mezcle suavemente a temperatura ambiente durante 30 minutos. Al finalizar, lleve la columna a la campana extractora. Retire cuidadosamente la tapa superior y luego retire la tapa inferior y deje que la columna drene en un tubo de desecho.Lave la columna con cinco volúmenes de resina de la solución de lavado. Monitoree los lavados en busca de la presencia de proteínas residuales midiendo la absorbancia a 280 nanómetros. Las proteínas no acopladas se eliminan mediante la alta concentración de sal. Por último, lave la resina con seis mililitros de PBS DGAs que contenga azida sódica al 0,02 %, y mantenga la columna a cuatro grados Celsius hasta que sea necesaria.Comience el procedimiento para purificar anticuerpos anti neuro uno específicos lavando la columna acoplada con NORE 77 LBD con 10 mililitros de PBS y dejando que la columna drene; tape el extremo inferior de la columna y coloque la columna acoplada con neuro 77 LBD drenada en un nuevo tubo colector de 15 mililitros. Añada cinco mililitros de proteína, anticuerpos anti neuro uno purificados, a la columna y tápela. Coloque la columna en un rotador a cuatro grados centígrados durante una hora.A continuación, retire las tapas superior e inferior y recoja el flujo que atraviesa. Coloque el flujo que atraviesa aparte en hielo hasta que sea momento de añadirlo al nor. Una columna acoplada LBD. Lave la columna acoplada a no one LBD con 10 mililitros de PBS y deje que la columna drene; tape el extremo inferior de la columna y coloque la columna acoplada a nor one LBD en un tubo colector de 15 mililitros. Añada el flujo proveniente de la columna acoplada a north 77 LBD. Tape la columna y colóquela en un rotor a cuatro grados Celsius durante una hora.Después de una hora, retire las tapas superior e inferior y recoja el flujo que atraviesa. Mida la concentración de anticuerpos midiendo la absorbancia a 280 nanómetros.El anticuerpo anti nore uno purificado se analiza posteriormente mediante ELISA. Añada 100 microlitros de proteína a los pocillos de una placa de 96 pocillos. Si se están probando tres proteínas diferentes, añada 100 microlitros de la proteína uno a los pocillos A1 a H4, 100 microlitros de la proteína dos a los pocillos A5 a H8, y 100 microlitros de la proteína tres a los pocillos A9 a H12.Cubra la placa e incube durante la noche a cuatro grados Celsius hasta la mañana siguiente. Lave los pocillos recubiertos dos veces con 300 microlitros por pocillo de PBS. A continuación, agregue 300 microlitros de tampón bloqueador Eliza a todos los pocillos recubiertos con antígeno e incube a temperatura ambiente durante dos horas.Después de dos horas de bloqueo, reemplace el tampón de bloqueo de ELIZA en cada pocillo con 100 microlitros de tampón de bloqueo de Eliza fresco. Añada 100 microlitros de anticuerpo anti-EU uno purificado y diluido a todos los pocillos de la fila A e incube a temperatura ambiente durante una hora tras una hora.Lave la placa tres veces con tween 20 al 0,05 %. Después del tercer lavado, seque la placa para eliminar el exceso de tampón de lavado. Añada 100 microlitros de peroxidasa de rábano picante, anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de rabia conjugado, diluido en tampón bloqueante de ELISA a cada pocillo e incube a temperatura ambiente durante una hora. Pasada una hora, lave la placa tres veces con tween 20 al 0,05 % como se indicó anteriormente, tras el tercer lavado.Lave todos los pocillos llenándolos con 300 microlitros de agua desionizada; elimine el exceso de agua colocando la placa boca abajo sobre papel absorbente. Añada 100 microlitros de tres tres prima, cinco, cinco prima tetraetil benzidina, caliente a temperatura ambiente en todos los pocillos e incube de 15 a 30 minutos a oscuras y a temperatura ambiente. Detenga la reacción añadiendo 50 microlitros de ácido sulfúrico 2 N a cada pocillo.Por último, lea la absorbancia a 450 nanómetros. Reste el fondo a 650 nanómetros. Comparación de proteínas. Un anticuerpo purificado sin especificidad frente a la proteína.Unos anticuerpos anti-Noro uno purificados mediante paso a través de columnas de LBD no. 77 y LBD no. uno muestran que, aunque los anticuerpos anti-no. uno purificados por proteína A exhibieron unión fuerte al LBD no. uno, también mostraron unión significativa al LBD no. 77 y al LBD no. uno. Una purificación adicional de anti-no. uno frente a LBD no. 77 y LBD no. uno eliminó completamente esta reactividad cruzada. Esta especificidad se demostró además mediante análisis por inmunotransferencia de extractos de células transfectadas con vectores de expresión que portaban noruno, noruno y nor77 completos etiquetados con Mick. Los anticuerpos anti-Mick revelaron que cada proteína completa se expresó en su peso molecular esperado. Los anticuerpos anti-noruno purificados por proteína A detectaron de manera robusta la proteína noruno completa, pero también detectaron noruno y nor77, aunque con menor eficiencia.En contraste, el anticuerpo nor uno completamente purificado no mostró ninguna reactividad cruzada detectable frente a nor uno ni frente a nor 77. El análisis inmunohistoquímico de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo con el anticuerpo nor uno completamente purificado confirmó la expresión prominente de nor uno. La inmunohistoquímica utilizando tirosina hidroxilasa reveló además que neuro uno también se expresa exclusivamente en el núcleo de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo en el área de la sustancia negra. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos días si se lleva a cabo correctamente. No olvide que trabajar con hidruro de sodio puede ser extremadamente peligroso y que siempre deben tomarse precauciones, como trabajar bajo campana extractora de gases, durante la realización de este procedimiento.

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Investigación

JoVE Journal

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Biología

Este video muestra un procedimiento para la producción de anticuerpos recombinantes contra la metaloproptisasa. Los plásmidos recombinantes portadores de genes para el anticuerpo, la proteína fluorescente verde y la resistencia a los antibióticos se transfectan a las células epiteliales con lipofectamina. Las células transfectadas se seleccionan y cultivan para generar anticuerpos recombinantes.

Un método para producir anticuerpos recombinantes contra la metalopéptidasa

Durante los últimos años, los ensayos basados ​​en células vivas se han utilizado con éxito para detectar anticuerpos contra antígenos de superficie y conformacionales. Aquí se describe un método que utiliza el flujo de alto rendimiento citometría permite el análisis de grandes cohortes de pacientes. La detección de nuevos anticuerpos será mejorar el diagnóstico y el tratamiento de trastornos del sistema inmune-mediada.

Ensayo de alto rendimiento basado en células citometría de flujo para detectar anticuerpos a la N-metil-D-aspartato receptor o dopamina-2 del receptor en suero humano

A continuación, se describe un método para expresar y purificar el norovirus alta calidad que sobresale dominios (P) en E. coli para su uso en estudios de cristalografía de rayos X. Este método se puede aplicar a otros dominios calicivirus P, así como las proteínas no estructurales, es decir., La proteína viral unida al genoma (VPg), proteasa, y ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp).

La producción de norovirus dominios que sobresale en humanos<em&gt; E. coli</em&gt; Para la cristalografía de rayos X

Aquí, los autores presentan un protocolo simple y eficiente para definir un epítopo antigénico lineal utilizando un anticuerpo monoclonal purificado y escaneo de péptidos a través de hibridación dot-blot. El epítopo identificado puede utilizarse en aplicaciones terapéuticas y diagnósticas.

La identificación de un epítopo lineal de células B reconocido por anticuerpos monoclonales péptido Escaneo-asistida

Se describe un método para la producción de anticuerpos humanos específicos para un antígeno de interés, a partir de células B circulantes en la sangre humana. Generación de estos anticuerpos naturales es eficiente y rápido, y los anticuerpos obtenidos pueden discriminar entre antígenos muy similares.

Generación de anticuerpos monoclonales humanos discriminativo de células B antígeno específicas raras circulan en sangre

Hemos expresado ectopically subunidad NR1 del receptor NMDA etiquetada con proteína verde fluorescente en células embrionarias humanas (HEK293) como antígeno para detectar autoanticuerpos contra el receptor de NMDA en la sangre de pacientes con encefalitis autoinmune. Este sencillo método puede ser adecuado para la detección de propósitos en contextos clínicos.

Un análisis de la inmunofluorescencia celular Simple para detectar autoanticuerpos contra el Receptor N-metil-D-Aspartato (NMDA) en sangre

Este artículo proporciona un protocolo detallado para la preparación y evaluación de anticuerpos monoclonales contra productos naturales para su uso en inmunoensayos diferentes. Este procedimiento incluye vacunación, fusión celular, indirecta ELISA competitivo para clon positiva proyección y preparación de hibridomas monoclonal. También se proporcionan las especificaciones para la caracterización de anticuerpos mediante MALDI-TOF-MS y los análisis de ELISA.

Generación de anticuerpos monoclonales contra productos naturales

Aquí presentamos un método de citometría de flujo basadas en células para detectar anticuerpos neutralizantes u otros factores que interfieren con la absorción celular de terapias de reemplazo de la enzima en una matriz humana, tales como líquido cefalorraquídeo (LCR) o suero humano.

Detección de anticuerpos que neutralizan la absorción celular de terapias de reemplazo enzimático con un ensayo basado en células

La proteína de anticuerpo recombinante expresada en células pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO y anticuerpos monoclonales producidos utilizando la tecnología tradicional de hibridoma puede reconocer y unirse a la proteína N aminopeptidasa porcina (APN).

Producción de anticuerpos monoclonales dirigidos a la aminopeptidasa N en el epitelio de la mucosa intestinal porcina

Medir el par de atados de guiñada Drosophila con el medidor de par motor permite que el control neurocientífico exquisito de la naturaleza del estímulo de los animales de experimentación. Junto con las herramientas de genética única disponible en la mosca de la fruta, este paradigma se utiliza para una amplia variedad de la investigación neurobiológica.

El aprendizaje operante de Drosophila en el medidor de torque

Aprende a aumentar la especificidad de anticuerpos policlonales contra proteínas homólogas mediante la eliminación de anticuerpos cruzados. Este método utiliza dominios proteicos divergentes y cromatografía de afinidad.

Producción de Nurr-1 específico anticuerpos policlonales Libre de reactividad cruzada contra su estrecha homólogos, NOR1 y Nur77 (Video) | JoVE Journal

Producción de Nurr-1 específico anticuerpos policlonales Libre de reactividad cruzada contra su estrecha homólogos, NOR1 y Nur77

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