Name: Instilación y Fijación Métodos Útiles en pulmón de ratón Cancer Research (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Aprende métodos de instilación y fijación pulmonar en ratones para investigación oncológica. Estas técnicas permiten administrar células cancerígenas directamente y medir volúmenes pulmonares con precisión.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

El siguiente protocolo describe un sistema que funciona bien en 20-35 g ratones. El método podría ser fácilmente adaptable a los ratones grandes o más pequeñas simplemente cambiando el tamaño del catéter. Todos los animales protocolos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Johns Hopkins. 1. La instilación de pulmón <ol><li> Seleccionar una de una pulgada de largo 20 g cánula intravenosa comercial a utilizar para la intubación. </li><li> Modificar la punta del catéter de flexión manualmente para generar una ligera curvatura en la punta como se ilustra en la Figura 1. </li><li> Anestesiar al ratón con una mezcla de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (15 mg / kg) inyectada IP, y confirmar la anestesia por la ausencia de movimiento reflejo. Aplicar la pomada veterinaria en los ojos inmediatamente después de la anestesia. Inmediatamente después de la anestesia se aplican pomada de veterinaria en los ojos y dan carprofeno (5-10 mg / kg SQ) para analgesia post quirúrgico y la instilación. </li><li> Coloque el mouse supina sobre una plataforma inclinada. Como se muestra en la Figura 2, una gran aglutinante de oficina con lazos de sutura grabada el funciona perfectamente bien. </li><li> Afeitarse la parte ventral del cuello y limpiar y desinfectar la zona del cuello con un 70% de alcohol. Con nuevos de látex y guantes sin pólvora, utilice instrumentos quirúrgicos desinfectados con un 70% de alcohol. </li><li> Usando tijeras afiladas hacen una pequeña incisión quirúrgica en el cuello de aproximadamente 12 mm por debajo del incisivo inferior. </li><li> Con unas pinzas tire suavemente de la piel en el cuello caudalmente hasta que la pared ventral de la tráquea puede ser visto. </li><li> Retraer la lengua suavemente e inserte la cánula con la punta doblada inclinada hacia la superficie ventral del ratón. Al igual que en 1.4, tire suavemente sobre la piel en el cuello, e insertar la cánula en la tráquea. NOTA: Con un poco de práctica, el catéter será visible en movimiento por la tráquea. Si se va en el esófago, entonces no habrá ninguna observación visual del movimiento del catéter. No hay incisionesse hacen en la tráquea. </li><li> Una vez que el catéter se ve en la tráquea en el cuello, lo adelantó unos 5 mm para ser fiable pasado las cuerdas vocales, pero todavía muy por encima de la carina. </li><li> Prepárese para inculcar hasta 50 l de líquido mediante la inyección a través del catéter con una punta de pipeta de carga de gel. Coloque la punta en el conector luer, pero antes de inyectar mirada cuidadosamente para observar el movimiento del fluido en el sincrónica punta con la respiración del ratón. Entonces inyectar el instilado. </li><li> Con una jeringa de 1 ml, inmediatamente hacer un relativamente rápida inflación de 0,6 ml de aire a los pulmones a través del catéter para ayudar a distribuir la profunda líquido en los pulmones. Retire la cánula. </li><li> Retire la cánula. </li><li> Use una pequeña cantidad de adhesivo de cianoacrilato para cerrar la pequeña herida quirúrgica según las instrucciones prospecto de Vetbond. Coloca los ratones en jaulas individuales y controlar visualmente hasta que se despiertan y comportarse normalmente sin ninguna indicación de discomfort. </li></ol> 2. Fijación de pulmón NOTA: una vez que todos los procedimientos experimentales se realizaron en un ratón, los pulmones pueden ser preparado para el procesamiento histológico por fijación con formaldehído (o cualquier otro fijador se desea). <ol><li> Sacrificar el ratón con un procedimiento IACUC aceptable. Para el ratón representativo se muestra en el video, se utiliza dislocación cervical de un ratón anestesiado. </li><li> Realice una traqueotomía (si no lo ha hecho) mediante la exposición quirúrgica de la parte ventral de la tráquea, lo que hace un pequeño corte, y la inserción de una punta de la aguja talón de 18 G en la tráquea, y atar con hilo. </li><li> Abra cuidadosamente el tórax con una incisión en la línea media, cortar el diafragma, y ​​quitar las paredes laterales de tórax para exponer los pulmones. </li><li> Conectar el extremo luer de la aguja a un depósito en un soporte de anillo que contiene formaldehído. Vea la Figura 3. </li><li> Establezca la superficie superior del formaldehído 25 cm por encima del nivel del mouse. Vea la Figura 3. A continuación asegúrese de que no hay aire en el tubo de fijación mediante la ejecución de fluido fuera el final de una llave de paso. Conectar el extremo luer de la cánula traqueal a la tubería de depósito. Abra la llave de paso para inflar los pulmones con el formaldehído. Deja los pulmones bajo presión durante al menos 20 min. </li><li> Abra la llave de paso para inflar los pulmones con el formaldehído. Deja los pulmones bajo presión durante al menos 20 min. </li><li> A continuación, atar la tráquea más allá del extremo de la aguja trozo. Puede ayudar a retroceder lentamente en la aguja para exponer más de la tráquea uncannulated. Cuando atada con seguridad, retire la llave de paso. </li><li> Diseccionar cuidadosamente los pulmones. </li><li> Coloca los pulmones en formaldehído durante la noche. Tiempos más largos están muy bien, y algunas manchas o procedimientos pueden especificar tiempos específicos. También cualquier otros fijadores líquidos, tales como z-fix se pueden utilizar para la instilación y la inmersión. </li><li> Antes de su posterior procesamiento histológico, midael volumen pulmonar fija como se describe a continuación. </li></ol> 3. Medición del volumen pulmonar fijo <ol><li> Medir el volumen de pulmón utilizando el principio de Arquímedes, como se ilustra en la Figura 4. Retire el pulmón fija desde el formaldehído y diseccionar el corazón y cualquier otro tejido no pulmonar. </li><li> Utilice un dispositivo de fabricación casera sencilla previamente construido soporte de alambre que se utiliza para mantener los pulmones completamente bajo el agua. NOTA: Este dispositivo debe ser compatible con lo que el equilibrio se está utilizando. Un dispositivo típico se muestra en la Figura 5 está hecho de pipetas de plástico y fina (20 G) de alambre. Este sistema funciona bien con el saldo utilizado en el vídeo, pero podría ser fácilmente adaptado a la mayoría de balanzas de laboratorio. </li><li> Coloque un vaso con ≈200 ml de agua en el equilibrio y la tara con la jaula de soporte en su lugar en el agua. Ver Figura 6 Retire la jaula de metal.; colocar el pulmón en la superficie del agua y presione bajo el aguacon la jaula. </li><li> Anotar el peso en la balanza. Este número refleja el volumen de agua desplazada y es así una medida directa del volumen pulmonar. Tenga cuidado para asegurarse de que el pulmón o de sutura o cualquier parte de la jaula de alambre no toque los lados o fondo del vaso. </li><li> Para mayor precisión, repetir la medición. Retire el pulmón del agua y seca en un pañuelo de papel. Tarar el vaso con jaula en lugar de nuevo y repetir la medición del volumen pulmonar. Las dos mediciones de volumen deben entonces ser promediados. NOTA: Si los pulmones se dejan en el formalina durante más de aproximadamente una semana, el aire en los pulmones se disolverá en el líquido. Cuando esto sucede, el pulmón se hundirá, por lo que ya no es necesario el uso de cualquier dispositivo como en la Figura 5 para mantener el pulmón sumergido. En tal caso, el volumen se puede medir por simplemente manteniendo el pulmón por uno de los hilos de sutura hasta que esté completamente sumergida como se ilustra en la Figura 4. </li></ol>

<ol><li>Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+endotracheal+intubation+and+pulmonary+functional+assessment+for+repeated+studies+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice.</a> J Appl Physiol. 87, 2362-2365 (1999).</li>
<li>Walters, D. M., Wills-Karp, M., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+cellular+profile+and+lung+function+with+repeated+bronchoalveolar+lavage+in+individual+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Assessment of cellular profile and lung function with repeated bronchoalveolar lavage in individual mice.</a> Physiol Genomics. 2, 29-36 (2000).</li>
<li>Hamacher, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+wire+guide-based+orotracheal+mouse+intubation%3A+description%2C+evaluation+and+comparison+with+transillumination%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+animals%22%5BJournal%5D)">Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination.</a> Laboratory animals. 42, 222-230 (2008).</li>
<li>Spoelstra, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+and+simple+method+for+endotracheal+intubation+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory%22%5BJournal%5D)">A novel and simple method for endotracheal intubation of mice.</a> Laboratory. 41, 128-135 (2007).</li>
<li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+retrograde+intubation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+animal%22%5BJournal%5D)">A technique for retrograde intubation in mice.</a> Lab animal. 35, 39-42 (2006).</li>
<li>Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+endotracheal+intubation+of+mice+and+rats+used+in+imaging+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Contemporary+topics+in+laboratory+animal+science+%2F+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies.</a> Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 44, 52-55 (2005).</li>
<li>Vergari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+of+orotracheal+intubation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22European+review+for+medical+and+pharmacological+sciences%22%5BJournal%5D)">A new method of orotracheal intubation in mice.</a> European review for medical and pharmacological sciences. 8, 103-106 (2004).</li>
<li>Vergari, A., Polito, A., Musumeci, M., Palazzesi, S., Marano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-assisted+orotracheal+intubation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+animals%22%5BJournal%5D)">Video-assisted orotracheal intubation in mice.</a> Laboratory animals. 37, 204-206 (2003).</li>
<li>Hastings, R. H., Summers-Torres, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Laryngoscopy+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Contemporary+topics+in+laboratory+animal+science+%2F+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Direct Laryngoscopy in Mice.</a> Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 38, 33-35 (1999).</li>
<li>Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+official+research+policy+statement+of+the+American+Thoracic+Society%2FEuropean+Respiratory+Society%3A+standards+for+quantitative+assessment+of+lung+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure.</a> Am J Respir Crit Care Med. 181, 394-418 (2010).</li>
<li>Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+for+the+measurement+of+mucociliary+function+in+the+mouse+by+scintigraphy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy.</a> J Appl Physiol. 90, 1111-1117 (2001).</li>
<li>Cai, Y., Kimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+intratracheal+intubation+to+study+the+pathology+and+physiology+of+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e50601(2013).</li>
<li>Das, S., Macdonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+mouse+lung+intubation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A simple method of mouse lung intubation.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).</li>
<li>MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+simple+method+of+mouse+lung+intubation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">An improved simple method of mouse lung intubation.</a> J Appl Physiol. 106, 984-987 (2009).</li>
<li>Lum, H., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+10%25+formalin+fixation+on+fixed+lung+volume+and+lung+tissue+shrinkage%5BTitle%5D)+AND+%22American+Reveiw+of+Respiratory+Diseases%22%5BJournal%5D)">Effects of 10% formalin fixation on fixed lung volume and lung tissue shrinkage.</a> American Reveiw of Respiratory Diseases. 132, 1078-1083 (1985).</li>
<li>Bishai, J., Fields, M. J., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Mouse+Lung+Volumes+Inflated+with+Air+and+Instilled+Fixatives%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Am+Thorac+Soc%22%5BJournal%5D)">Comparison of Mouse Lung Volumes Inflated with Air and Instilled Fixatives.</a> Proc Am Thorac Soc. 3, A549(2006).</li>
<li>Mitzner, W., Brown, R., Lee, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+lung+volumes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of lung volumes in mice.</a> Physiol Genomics. 4, 215-221 (2001).</li>
</ol>

Los procedimientos descritos aquí tienen varias ventajas. En primer lugar el equipo requerido es sencillo y barato. En segundo lugar, la intubación puede hacerse rápidamente con pocos errores. En tercer lugar, la capacidad de fijar los pulmones a una presión constante, y luego medir el volumen pulmonar fijo permite la cuantificación adecuada de estructuras o células en el pulmón 10. Una desventaja posible a la intubación es la cirugía menor. Esto puede limitar la capacidad de repe...

Por una serie de razones, cáncer de pulmón no ha sido ampliamente estudiado en el ratón. Una razón para esto es que el acceso a los pulmones es muy difícil in vivo, y el análisis cuantitativo de los pulmones fijos no se hace comúnmente. Los métodos descritos en este documento están diseñadas para remediar esta situación. Los objetivos de este documento son para describir métodos sencillos que ayudarán en gran medida en la configuración y el análisis de los pulmones de ratones con cáncer de pulmón u otras patologías. Aunque ninguno de estos enfoques son totalmente nuevo, que no se han presentado juntos como métodos independientes de la forma simplificada como se describe aquí. Ha habido un número de manuscritos que han descrito métodos para la intubación del pulmón de ratón principalmente con el propósito de hacer la función pulmonar de repetición o lavado broncoalveolar en ratones individuales en estudios longitudinales. Dado que el papel original, ha habido varios otros papeles que han descrito diferentes enfoques para mouse intubación 1 -9. Si bien todos estos métodos se pueden utilizar con éxito, por lo general requieren un entrenamiento considerable y no son a menudo sin una tasa de fracaso no trivial. Además, con el fin de llevar a cabo mediciones de la función pulmonar, la cánula tiene que encajar herméticamente la tráquea lo suficiente para que no haya fugas de aire. Sin embargo, otro uso práctico para la intubación es para administrar agentes específicos (células de cáncer u otros insultos) o fármacos terapéuticos directamente al pulmón. Tal procedimiento no requiere una cánula de ajuste apretado ni ningún equipo sofisticado de la función pulmonar. La novela característica de este método se muestra aquí implica un procedimiento quirúrgico menor que permite que la intubación sin ninguna posibilidad de la cánula de entrar en el esófago. Este enfoque simple permite la intubación exitosa con relativamente poca formación o experiencia. Nada menos que 30 ratones / hr pueden ser tratados con este enfoque con una tasa de fracaso cercanos a cero. Una vez tque los ratones están listos para ser sacrificados, los pulmones lesionados o cancerosas luego se puede quitar para histológico y análisis patológico. Sin embargo, con el fin de cuantificar correctamente las variables histológicas para la comparación con otros pulmones, es esencial para estandarizar los procedimientos de fijación y cuantificar adecuadamente el volumen pulmonar fijo 10. En este trabajo se describe en detalle los procedimientos simples que permiten a los procedimientos de fijación estandarizados, así como una manera de medir el volumen pulmonar fijo. El volumen es una métrica esencial en la cuantificación de la histología, ya que sin dicha determinación de volumen, sólo densidades relativas se pueden medir 10. Una vez que se conoce el volumen de pulmón, sin embargo, las mediciones absolutas de células y otras mediciones estructurales en el pulmón pueden ser cuantificados.

<table><tbody><tr><td>Balanza de laboratorio</td><td>Ohaus</td><td>Adventurer Pro modelo AV 313&nbsp;</td><td>Se pueden utilizar otras balanzas si tienen un rango de 1 a 300 g</td></tr><tr><td>Catéter intravenoso Luer de 20 g</td><td>Insylte</td><td></td><td>Varios otros posibles proveedores, p. ej., Jelco Optiva</td></tr><tr><td>Frasco de laboratorio de 500 ml</td><td>Varios</td><td></td><td>Varios otros posibles proveedores</td></tr></tbody></table>

instilación y fijación métodos Útiles en pulmón de ratón cancer research

Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research

La capacidad de infundir agentes vivos, células o productos químicos directamente en el pulmón sin herir o matar a los ratones es una herramienta importante en la investigación del cáncer de pulmón. Aunque hay un número de métodos que se han publicado que muestra cómo intubar ratones para las mediciones de función pulmonar, ninguno es sin problemas potenciales para la instilación traqueal rápida en grandes cohortes de ratones. En el presente trabajo, un método sencillo y rápido se describe que permite a un investigador para llevar a cabo tales instilaciones de una manera eficiente. El método no requiere de herramientas especiales o iluminación y se puede aprender con muy poco práctica. Se trata de anestesiar un ratón, haciendo una pequeña incisión en el cuello para visualizar la tráquea, y después la inserción de un catéter intravenoso directamente. La pequeña incisión se cierra rápidamente con adhesivo tisular, y los ratones se les permite recuperarse. Un estudiante calificado o técnico pueden hacer instilaciones a una tasa promedio de 2 min / ratón. Una vez tque esté establecido el cáncer, hay con frecuencia una necesidad de un análisis histológico cuantitativo de los pulmones. Tradicionalmente patólogos generalmente no se molestan en estandarizar la inflación pulmonar durante la fijación, y los análisis a menudo se basan en un sistema de puntuación que puede ser muy subjetiva. Si bien esto puede en algún momento ser lo suficientemente adecuada para las estimaciones brutas del tamaño de un tumor de pulmón, cualquier cuantificación estereológicos adecuada de la estructura de pulmón o células requiere un procedimiento de fijación reproducible y la medición del volumen pulmonar subsiguiente. Aquí se describen los procedimientos fiables simples, tanto para la fijación de los pulmones bajo presión y luego medir con precisión el volumen pulmonar fijo. El único requisito es una balanza de laboratorio que es precisa en un rango de 1 mg-300 g. Los procedimientos que aquí se presentan de este modo podrían mejorar en gran medida la capacidad de crear, tratar y analizar los cánceres de pulmón en ratones.

El procedimiento se describe en el primer protocolo no por sí mismo conducir a ningún resultado generalizadas. Sólo se describe un medio muy fiable para inculcar sustancias directamente en la tráquea. La figura 7 muestra un ejemplo de un pulmón en el que se instiló azul de tripano con el método descrito aquí. Hay una amplia distribución del colorante, similar a lo que se ha visto con otros colorantes o trazadores dadas directamente en la tráquea o los ratones 11,12. También hemos utilizado es...

El objetivo de este trabajo es describir métodos sencillos que ayudarán en gran medida en la configuración y el análisis de los pulmones de ratones con cáncer de pulmón u otras patologías. Presentamos 3 protocolos para llevar a cabo simple y fiable instilaciones de pulmón, fijación, y mediciones de volumen pulmonar.

Instilación y Fijación Métodos Útiles en pulmón de ratón Cancer Research

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer ...

El objetivo general del procedimiento mostrado aquí es demostrar métodos sencillos que ayudarán considerablemente en la preparación y el análisis de ratones con cáncer de pulmón u otras patologías pulmonares. El primero es un método para instilar directamente células cancerosas o tratamientos químicos en los pulmones. A continuación, se describen la fijación post mortem y las mediciones del volumen pulmonar.Esto se logra primero intubando al ratón con una cánula intravenosa ligeramente modificada. A continuación, el líquido de interés se instila a través de la cánula hacia el pulmón. Luego, después de que se han realizado todos los experimentos in vivo y el ratón ha muerto.Los pulmones están conectados a un reservorio para la fijación. En el paso final, se diseccionan los pulmones y se mide el volumen pulmonar. En última instancia, la morfología cuantitativa del tejido pulmonar fijado puede compararse entre muestras pulmonares experimentales.La principal ventaja de esta nueva técnica de instalación frente a los métodos existentes es que, con nuestro método, existe casi nula posibilidad de colocar incorrectamente la cánula en la tráquea. El procedimiento para fijar los pulmones bajo presión constante es sencillo y conduce a una fijación uniforme en diferentes pulmones. Por último, el método para medir el volumen del pulmón fijado en ratón permite una normalización adecuada para cuantificar células pulmonares y elementos estructurales.Utilice este método. Asegúrese tanto de una administración directa del fármaco u otro agente de interés al pulmón, como de una medición exacta y precisa del pulmón. Antes de comenzar el procedimiento, doble manualmente la punta de una cánula intravenosa comercial de una pulgada de largo y calibre 20 en una curva ligera.Luego, tras confirmar la anestesia mediante la ausencia de respuesta al pellizco en los dedos del pie, aplique ungüento en los ojos de un ratón adulto y sujete al ratón en posición supina sobre una plataforma inclinada con una carpeta de oficina grande y lazos de sutura. Afeite la parte ventral del cuello y desinfecte la piel con alcohol al 70 %. A continuación, utilizando tijeras afiladas, realice una incisión quirúrgica pequeña en el cuello aproximadamente a 12 milímetros por debajo del incisivo inferior.A continuación, use pinzas para tirar suavemente de la piel del cuello hasta que pueda verse la pared ventral de la tráquea. Luego, retraja suavemente la lengua e inserte la cánula con una punta doblada inclinada hacia la superficie ventral del ratón. Vuelva a tirar suavemente de la piel del cuello, tal como se acaba de demostrar.Introduzca la cánula en la tráquea cuando se observe el catéter dentro de la tráquea; avance el catéter unos cinco milímetros para sobrepasar las cuerdas vocales. Ahora, coloque la punta de una pipeta para carga de geles cargada con 50 microlitros del inoculado en el cono del catéter. Confirme el movimiento del líquido en la punta sincronizado con la respiración del ratón.Luego, inyecte el sobrenadante utilizando una jeringa de un mililitro. Inmediatamente, infle los pulmones con 0,6 mililitros de aire a través del catéter para ayudar a distribuir el líquido y expandir los pulmones. A continuación, retire la cánula.Cierre la herida quirúrgica con una pequeña cantidad de adhesivo de cianoacrilato y coloque el ratón en una jaula individual con vigilancia hasta que se recupere completamente. Después del último punto temporal experimental, realice un pequeño corte en el cuello del animal para exponer la cara ventral de la tráquea. A continuación, inserte la punta de una aguja corta de calibre 18 en la tráquea.Con hilo, ate la aguja a la tráquea y abra cuidadosamente el tórax mediante una incisión en la línea media. Luego, corte y retire el diafragma y las paredes laterales del tórax para exponer los pulmones. A continuación, asegúrese de que no haya aire en el tubo de fijación haciendo salir formaldehído por el extremo del grifo de cierre.Luego conecte el frasco de formol y el tubo lleno directamente al extremo del embudo de la aguja de traqueostomía. Coloque la superficie superior del formaldehído a 25 centímetros por encima del nivel de la boca y abra la llave de paso para insuflar los pulmones con el fijador. Después de mantener los pulmones bajo presión durante al menos 20 minutos, retire lentamente la aguja para exponer más parte de la traquea no canulada, mientras liga la traquea más allá del extremo de la aguja corta.Cuando la tráquea esté firmemente atada, retire la llave de paso y diseque cuidadosamente los pulmones. Luego coloque los pulmones en formaldehído durante la noche. Aquí se muestra un dispositivo típico para mantener los pulmones en su lugar durante la medición del volumen pulmonar fijo, fabricado con pipetas de plástico y alambre delgado de calibre 20, para medir primero el volumen pulmonar fijo, y después diseccionar el corazón y cualquier otro tejido no pulmonar de los pulmones.A continuación, coloque un vaso que contenga aproximadamente 200 mililitros de agua, equipado con el dispositivo de soporte de alambre, sobre una balanza y tare el equipo. Luego retire el dispositivo. Coloque el pulmón sobre la superficie del agua y utilice el dispositivo para sumergir el tejido bajo el agua.Asegurándose de que la sutura pulmonar o cualquier parte del dispositivo no toque los lados ni el fondo del vaso de precipitados, registre el peso en la balanza. Este número refleja el volumen de agua desplazada y, por lo tanto, es una medida directa del volumen pulmonar. Luego seque el pulmón con una toalla, rompa nuevamente el vaso de precipitados con el dispositivo y repita la medición del volumen pulmonar.A continuación, deben promediarse las dos mediciones de volumen. Se muestra un ejemplo de un pulmón al que se le instiló azul de tripano como acaba de demostrarse. Obsérvese la distribución amplia del colorante, similar a lo observado con otros trazadores coloreados administrados directamente en la tráquea del ratón. Al realizar este procedimiento, es importante recordar tener cuidado al insertar la cánula y mantener la punta con el lado ventral hacia arriba.Las técnicas que hemos descrito aquí son útiles en estudios de cáncer de pulmón, pero también son aplicables a la mayoría de los demás modelos de enfermedades pulmonares en el ratón.

instillation-and-fixation-methods-useful-in-mouse-lung-cancer-research

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Intratraqueal instilaciones solutos entregar directamente a los pulmones. Este procedimiento objetivos de la entrega de los instilado en las regiones distales de los pulmones, y por lo tanto incorpora a menudo en los estudios dirigidos a estudiar los alvéolos. Ofrecemos un protocolo detallado para la supervivencia de realizar instilaciones intratraqueal en ratones.

La instilación directa traqueal de solutos en pulmón de ratón

El nuevo protocolo reportados en el presente estudio permite la detección selectiva de metástasis pulmonares en la celda de resolución única en ratones por...

Visualización mejorada de metástasis pulmonares en la Resolución sola célula en ratones por Combinada<em&gt; In-situ</em&gt; La perfusión del tejido pulmonar y X-Gal tinción de<em&gt; LacZ</em&gt;-Etiquetados células tumorales

Este video describe un método para injertar células de adenocarcinoma de pulmón en pulmones murinos mediante el preacondicionamiento de las vías respiratorias con un agente inductor de fibrosis: bleomicina. Este método mejora significativamente el injerto ortotópico de células de cáncer de pulmón en pulmones...

Injerto de adenocarcinoma: un método para implantar células cancerosas en los pulmones murinos

Este video describe un método simple y confiable de introducir líquido en la tráquea para la instilación pulmonar, la fijación y la medición del volumen pulmonar.

Instilación y fijación pulmonar: introducción de líquido en la tráquea y fijación de los pulmones para medir el volumen pulmonar fijado

Este artículo describe un método striaghforward y eficiente de intubación de ratones para las mediciones de la función pulmonar o la instilación pulmonar, que permite a los ratones para recuperar y se estudió en tiempos posteriores. El procedimiento consiste en una fuente de luz de fibra óptica de bajo costo que ilumina directamente la tráquea.

Un sencillo método de intubación ratón de pulmón

Se describe un método para mejorar considerablemente orthotopic engraftment de células de cáncer de pulmón en los pulmones murinos por acondicionamiento previo de las vías respiratorias con lesiones. Este enfoque también puede aplicarse para estudiar las interacciones estromales dentro del microambiente de la pulmonar, diseminación metastásica, comorbilidades de cáncer de pulmón, y generar más eficientemente paciente derivados de xenoinjertos.

Acondicionamiento previo de las vías respiratorias de los ratones con bleomicina aumenta la eficacia del pulmón Orthotopic Engraftment de la célula de cáncer

Aquí se presenta un protocolo útil para la fijación pulmonar que crea una condición estable para la evaluación histológica de muestras pulmonares a partir de un modelo de ratón de enfisema. La principal ventaja de este modelo es que puede fijar muchos pulmones con la misma presión constante sin colapso pulmonar o deflación.

Fijación pulmonar bajo presión constante para la evaluación del enfisema en ratones

La administración intratraal (IT) de agentes experimentales en ratones a menudo resulta en un parto asimétrico a los pulmones distales.  En este informe, describimos un enfoque intrabronquial directo (IB) para canalizar cada pulmón en ratones vivos de forma no operativa.  Este enfoque se puede utilizar para administrar selectivamente agentes a un pulmón o puede adaptarse para mejorar el suministro de agentes simétricos a ambos pulmones.

Administración intrabronquial directa para mejorar la deposición selectiva del agente dentro del pulmón del ratón

El propósito de este método es presentar un método simple y eficiente para la perfusión, inflación y fijación de los pulmones del ratón para el examen de la patología pulmonar y la evaluación de metástasis en el pulmón.

Perfusión e inflación del pulmón del ratón para la histología tumoral

Presentamos un método para un modelo de patogénesis fúngica que preserva la posición natural de las esporas de hongos en las vías respiratorias pulmonares para su análisis mediante microscopía fluorescente.

Método eficiente para obtener imágenes de pulmones murinos que preserva la dinámica espacial de las esporas de hongos en las vías respiratorias

Un desafío importante del desarrollo de nuevas terapias para el cáncer de pulmón incluye el modelado del microambiente tumoral a medida que la enfermedad regional progresa a la enfermedad metastásica. Aquí, describimos un método simple para establecer un modelo singénico ortotópico de cáncer de pulmón que permite el seguimiento in vivo de la enfermedad a lo largo del tiempo.

Un método mínimamente invasivo para generar un modelo de ratón ortotópico singénico de cáncer de pulmón

Aprende métodos de instilación y fijación pulmonar en ratones para investigación oncológica. Estas técnicas permiten administrar células cancerígenas directamente y medir volúmenes pulmonares con precisión.

Instilación y Fijación Métodos Útiles en pulmón de ratón Cancer Research

Explorar más videos