Name: Aislamiento y cultivo primario de células endoteliales aórticas de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Aprende a aislar y cultivar células endoteliales de la aorta de ratón sin equipo especializado. Este protocolo sencillo ofrece alto rendimiento y viabilidad celular para investigar la fisiopatología endotelial en modelos de enfermedad cardiovascular.

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Este estudio cuenta con el apoyo de la Subvención para el Desarrollo Científico 13SDG16930098 de la Asociación Americana del Corazón y el Premio Juvenil de la Fundación Nacional de Ciencias de China 81300240 (PI: Wang). Agradecemos a Roberto Méndez de la Universidad Estatal de Wayne por ayudar en la preparación del manuscrito.

1. Aislamiento de la aorta de los ratones Todos los procedimientos descritos aquí fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad Estatal de Wayne. <ol><li> Poner el ratón en la cámara de inducción de la máquina de anestesia. Ajuste el flujo de isoflurano al 4% en relación con el 25% de aire fresco y 75% de O 2. Anestesiar al ratón por inhalación de isoflurano (4% para la inducción, ± 1,0% para el mantenimiento) en combinación con 25% de aire fresco y 75% de O 2 a través de la cámara de inducción seguida de un cono de nariz dedicado. NOTA: La anestesia con isoflurano se puede entregar en 75% de aire de oxígeno / 25% o en el 100% de oxígeno. </li><li> Verifique el ratón cada 5 minutos hasta que el nivel adecuado de anestesia se alcanza (falta de retirada de pizca dedo del pie). </li><li> Tome el ratón fuera de la cámara de inducción y continuar la inhalación de isoflurano pesar de que el cono de la nariz dedicado que está conectado a la máquina de anestesia. conmutar elisoflurano fluya a 1% para mantener la anestesia. </li><li> Si bien es bajo anestesia, poner el ratón sobre un bloque de la cirugía, situado en su parte posterior. Use cinta de laboratorio para asegurar las extremidades. </li><li> Utilice una lámpara de calentamiento para mantener caliente el ratón. Mantenga la lámpara en una distancia apropiada del ratón de manera que el ratón no se sobre-calor. </li><li> Pulverizar el pecho con un 70% de etanol. </li><li> Use las tijeras de disección para abrir el abdomen de la línea media, y exponer la aorta abdominal. Abrir la cavidad torácica y exponer el corazón y los pulmones. </li><li> Cortar la aorta abdominal en el medio con tijeras de disección para liberar la sangre. </li><li> Llene una jeringa de 1 ml (con 25 aguja G) con 1 ml de PBS que contenía 1000 U / ml de heparina. Inyectar PBS que contenía 1000 U / ml de heparina para el ventrículo izquierdo y la aorta perfundir. Empuje el corazón y el pulmón con pinzas en las grandes arterias hasta el lado derecho de los ratones para exponer la aorta torácica. </li><li> eliminar rápidamente la aorta torácica mediante micro-difórceps ssection y ponerlo en 1x PBS helado (estéril), y luego transportar el contenedor en una campana de flujo laminar. </li><li> Inserte una jeringa de 1 ml equipado con 25 aguja G en un extremo de la aorta, y lavar suavemente la aorta con PBS enfriado en hielo para eliminar la sangre. </li><li> El uso de fórceps micro-disección para eliminar la mayor cantidad de tejido adiposo adjunto y pequeños vasos laterales como sea posible. </li><li> transferir inmediatamente la aorta endoteliales medio de crecimiento. </li><li> Cortar la aorta en 1 anillos mm utilizando una hoja de bisturí estéril. Cosecha cerca de 8 - 10 anillos por aorta. </li><li> Abrir cada anillo aórtico con un par de tijeras de microdisección. </li></ol> 2. Las semillas de los segmentos aórticos en Matrix <ol><li> Cuando no esté en uso, mantenga la matriz reducida del factor de crecimiento de los -20 ° C para evitar la solidificación. Ponga la matriz reducida del factor de crecimiento de 4 ° C al menos durante la noche para permitir que un deshielo completa. </li><li> Pre-enfriar unos 6 pocillos de placas y consejos de pipeta a -20 ° C durante al menos10 minutos. Poner la placa de 6 pocillos en hielo y capa de un pocillo de la placa con 1 ml de matriz sin introducir burbujas de aire. Colocar la placa en una incubadora a 37ºC durante 20 min para permitir que la matriz se solidifique. </li><li> Implantar las piezas de la aorta en la matriz solidificada con unas pinzas de disección micro-estériles. Colocar las piezas lumen del lado de abajo en la matriz sin tocar el endotelio. Coloque 3 - 4 segmentos aórticos cerca uno del otro en la matriz. </li><li> Añadir la cantidad necesaria medio de crecimiento de células endoteliales para mantener húmeda segmentos (~ 200 l). </li><li> Incubar la placa a 37 ° C en 5% de CO2 durante 4 a 6 h. Al final del día, añadir suficiente medio para cubrir los segmentos aórticos. </li><li> Observe el segmento aórtico brotación periódicamente bajo un microscopio de contraste de fase. Comprobar el nivel de mediano y crecimiento de las células cada día. Se añade medio si es necesario para mantener los segmentos aórticos cubiertos. </li><li> En el 4º día, retire suavemente el medio y eliminar los segmentos de aorta fesde la matriz usando una aguja estéril sin interrumpir las células endoteliales en crecimiento. </li><li> Añadir 2 ml de nuevo medio de crecimiento de células endoteliales y permitir que las células endoteliales siguen proliferando en la matriz durante 2 - 3 días. </li></ol> 3. pases inicial de las células endoteliales aórticas de ratón <ol><li> Escudo un nuevo matraz T12.5 con gelatina (0,1%), se incuba a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Lavar las placas de matriz estéril cuidadosamente con 37 ° C de PBS. </li><li> Añadir 2 ml de proteinasa neutra (50 U / ml) a las placas de matriz y se incuba a temperatura ambiente en eje de balancín plataforma con agitación ocasional. Compruebe las células bajo un microscopio de contraste de fase para asegurarse de que la mayoría de las células se separan. </li><li> Añadir 2 ml de D-Val para inactivar la proteinasa neutra. </li><li> Recoger el sobrenadante cuidadosamente en un tubo de centrífuga de 15 mL. Lavar la placa con 2 ml de D-Val y recoger el sobrenadante. </li><li> Centrifugar la suspensión celular a 900 xg durante 5 min a Roola temperatura m. </li><li> Vuelva a suspender el sedimento de células en 4 ml de medio de crecimiento de células endoteliales y la placa en el matraz T12.5 recubierto con gelatina. Se incuban las células a 37 ° C, 5% de CO2 durante 2 h. </li><li> Reemplazar el medio. Se incuban las células a 37 ° C, 5% de CO 2 hasta que son 85% - 90% de confluencia. </li></ol> 4. pases de las células endoteliales aórticas de ratón <ol><li> Coat dos nuevos matraces T12.5 con gelatina (0,1%), se incuba a 37 ° C durante 30 min. Pre-calor tripsina-EDTA (0,25% de tripsina, EDTA 0,02 en PBS) y PBS estéril a 37 ° C durante aproximadamente 15 min. </li><li> Lavar las células cuidadosamente con estéril PBS 37 ° C. </li><li> Añadir 0,5 ml de tripsina-EDTA (0,25% de tripsina, EDTA 0,02 en PBS) y se incuba a 37 ° C durante ~ 1 min o hasta que la mayoría de las células darse la vuelta. </li><li> Añadir 2 ml de medio de crecimiento de células endoteliales para detener la digestión. Pipetear la suspensión de células arriba y hacia abajo dentro de los tiempos matraz varios. Si es necesario, utilice una célularaspador para recoger las células. </li><li> Recoger la suspensión celular en un tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar la suspensión celular a 900 xg durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Vuelva a suspender el sedimento de células en 4 ml de medio de crecimiento de células endoteliales y la placa en 2 frascos T12.5 recubiertas con gelatina. Se incuban las células a 37 ° C, 5% de CO2 durante 2 h. </li><li> Reemplazar el medio. Se incuban las células a 37 ° C, 5% de CO 2 hasta que son 85% - 90% de confluencia. </li><li> Use las células endoteliales de aorta de ratón después de 2 - 3 pasajes. </li></ol> 5. Caracterización de las células endoteliales de aorta de ratón <ol><li> Re-placa de las células. <ol><li> Escudo una placa de 6 pocillos con gelatina (0,1%), se incuba a 37 ° C durante 30 min. Aclarar la placa con PBS. </li><li> Pre-calentar la tripsina-EDTA y PBS estéril a 37 ° C durante aproximadamente 15 min. </li><li> Se lavan las células con PBS estéril 3 veces. Añadir 0,5 ml de tripsina / EDTA a las células, se incuba durante ~ 1 min a 37 ° C or hasta que la mayoría de las células de darse la vuelta. </li><li> Añadir 2 ml de medio de crecimiento de células endoteliales para detener la digestión. Pipetear la suspensión de células arriba y hacia abajo dentro de los tiempos matraz varios. Si es necesario, utilizar un rascador de células para recoger las células. </li><li> Recoger la suspensión celular en un tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar la suspensión celular a 900 xg durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Descartar el sobrenadante, volver a suspender las células en medio de crecimiento de las células endoteliales. Sembrar las células en placas de 6 pocillos recubiertas con gelatina a la densidad de 3 x 10 5 / pocillo. </li><li> Se incuban las células durante la noche a 37 ° C, 5% de CO 2 para permitir que las células se unan a la superficie de cultivo. </li></ol></li><li> Dil-ac-LDL y especialmente captado Ulex -lectin vinculante. <ol><li> Almacenar el 1,1&#39;-dioctadecil-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindo carbocyanine perclorato marcado LDL acetilada (Dil-ac-LDL) a -20 ° C. Antes de la tinción, descongelar Dil-ac-LDL en hielo. La solu Stock Dil-ac-LDLción es 1 mg / mL. Almacenar la aglutinina marcada con FITC Ulex europaeus (Ulex -Lectin, 1 mg / ml) a 4 ° C. La solución madre Ulex -Lectin es 1 mg / mL. Tienda Hoechst 33342 a 4 ° C. La solución madre Hoechst 33342 es 100 mg / ml. </li><li> Añadir 10 l de Dil-ac-LDL solución madre a 1 ml de medio de cultivo para hacer una concentración final de 10 mg / ml. </li><li> Antes de la tinción, se elimina el medio viejo y se lavan las células en cada pocillo con medio nuevo. </li><li> Retire el nuevo medio y se añade el medio de tinción Dil-ac-LDL. </li><li> Se incuban las células a 37 ° C, 5% de CO2 durante 1 h. </li><li> Se lavan las células con PBS 1x estéril 3 veces. </li><li> Añadir 1 ml de formalina al 10% para fijar las células. Poner la placa en la temperatura ambiente durante aproximadamente 30 min. </li><li> Se lavan las células con PBS 1x estéril 3 veces. Evitar la luz. </li><li> Añadir 1 ml de PBS 1x estéril que contiene 10 l de Ulex -Lectin. </li><li> Se incuban las células a temperatu de la habitaciónvolver en la oscuridad durante 1 h. </li><li> Retire el Ulex-lectina por lavado de las células con PBS 1x estéril 3 veces. </li><li> Añadir Hoechst 33342 a concentración final de 1 mg / ml, se incuban 10 min en la oscuridad. </li><li> Ver la fluorescencia de Dil-ac-LDL (rojo, longitud de onda de excitación de 576 nm), Ulex -Lectin (verde, la excitación de longitud de onda de 519 nm) y Hoechst (azul, longitud de onda de excitación de 361 nm) con un microscopio de fluorescencia invertida. </li></ol></li><li> La tinción fluorescente para CD31, VEGFR2, eNOS, VE-cadherina y calponin. <ol><li> Tienda FITC-conjugado anticuerpo anti-ratón CD31, anticuerpo eNOS, VE-cadherina anticuerpo, conjugado con FITC IgG anti-conejo a 4 ° C en la oscuridad. Tienda de anticuerpos VEGFR2 en -20 ° C. </li><li> Se lavan las células con PBS 1x estéril 3 veces. </li><li> Añadir 1 ml de formalina al 10% para fijar las células. Poner la placa en la temperatura ambiente durante aproximadamente 30 min. </li><li> Se lavan las células con PBS 1x estéril 3 veces. </li><li> Para la tinción de CD31, añadir 1 ml de 1x estérilPBS que contiene 10 l de anticuerpo CD31-FITC. Para teñir ya sea VEGFR2, eNOS, VE-cadherina o calponin, agregar 1 ml de PBS 1x estéril que contiene 4 l de VEGFR2, eNOS, VE-cadherina o calponin anticuerpo primario, respectivamente. </li><li> Se incuban las células en hielo durante 1 h en la oscuridad. </li><li> Eliminar los anticuerpos por lavado de las células con PBS estéril 3 veces. </li><li> Para la tinción de VEGFR2, eNOS, VE-cadherina o calponin, añadir 1 ml de PBS 1x estéril que contiene 10 l de IgG anti-conejo conjugado con FITC. Se incuban las células en hielo durante 1 h en la oscuridad. Eliminar la IgG por lavado de las células con PBS estéril 3 veces. </li><li> Añadir Hoechst 33342 a concentración final de 1 mg / ml, se incuban 10 min en la oscuridad. </li><li> Ver la fluorescencia de CD31, VEGFR2, eNOS, VE-cadherina, calponin (verde, longitud de onda de excitación de 518 a 535 nm) y Hoechst (azul, longitud de onda de excitación de 361 nm) con un microscopio de fluorescencia invertida. </li></ol></li></ol>

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<li>Shimamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+and+foods+on+contraction+of+endothelial+cells+as+a+key+mechanism+in+atherogenesis+and+treatment+of+atherosclerosis+with+endothelial-cell+relaxants+%28cyclic+AMP+phosphodiesterase+inhibitors%29%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+experimental+medicine+and+biology%22%5BJournal%5D)">Drugs and foods on contraction of endothelial cells as a key mechanism in atherogenesis and treatment of atherosclerosis with endothelial-cell relaxants (cyclic AMP phosphodiesterase inhibitors).</a> Advances in experimental medicine and biology. 60, 77-105 (1975).</li>
<li>Chiu, J. J., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+disturbed+flow+on+vascular+endothelium%3A+pathophysiological+basis+and+clinical+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reviews%22%5BJournal%5D)">Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives.</a> Physiological reviews. 91, 327-387 (2011).</li>
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<li>Rostgaard, J., Qvortrup, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+demonstrations+of+filamentous+molecular+sieve+plugs+in+capillary+fenestrae%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+research%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic demonstrations of filamentous molecular sieve plugs in capillary fenestrae.</a> Microvascular research. 53, 1-13 (1997).</li>
<li>Brutsaert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+endothelial-myocardial+signaling%3A+its+role+in+cardiac+growth%2C+contractile+performance%2C+and+rhythmicity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reviews%22%5BJournal%5D)">Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity.</a> Physiological reviews. 83, 59-115 (2003).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este estudio demuestra un método simple para aislar y endotelial cultura células de una aorta de ratón sin ningún equipo especial. La tinción de inmunofluorescencia indicó que la mayoría de las células eran células endoteliales después de la segunda pasaje. Se sugiere que las células en segundo-tercio paso son apropiados para in vitro e in vivo para estudiar la biología endotelial. Las Notas clave de la presente Protocolo Hay ci...

El endotelio vascular es no sólo una capa de barrera que separa la sangre y el tejido, se considera una amplia glándula endocrina que se extiende sobre todo el árbol vascular con una superficie de 400 metros cuadrados 1. El bienestar del endotelio es esencial para la homeostasis vascular. El endotelio disfuncional participa en diversos trastornos cardiovasculares, incluyendo la aterosclerosis, vasculitis y las lesiones por isquemia / reperfusión, etc. 2-4. Hasta la fecha, los mecanismos celulares y moleculares específicos implicados en estos ajustes de la enfermedad no se comprenden bien debido a la naturaleza anatómica difusa de endotelio. El ratón es un modelo importante para la investigación porque las técnicas de manipulación genética están más desarrollados en ratones que en cualquier otra especie de mamífero. Sin embargo, el aislamiento de células endoteliales aórticas primaria murino se considera particularmente difícil debido a que el pequeño tamaño de la aorta hace enzymatdigestión ic de endotelio poco práctico. Algunos informaron procedimientos para aislar y purificar las CE exijan 5-7. El objetivo de este protocolo es el uso de un método simple para aislar y expandir las células endoteliales de la aorta de ratón sin utilizar ningún equipo especial. En este protocolo, la aorta recién aisladas se corta en pequeños segmentos y se sembró sobre una matriz con el endotelio hacia abajo para permitir la germinación endotelial. Después de segmentos se eliminan, las células endoteliales se expandieron en medio del endotelio favorecida y están listas para experimentos después de dos o tres pasajes. Las ventajas del método descrito son que: 1) considerablemente alto número de células endoteliales se obtienen de una sola aorta; 2) la viabilidad celular está bien conservada; y 3) no se necesita ningún equipo o técnica especial. Se proporciona un medio eficaz para la identificación de los mecanismos celulares y moleculares específicos en la fisiopatología de las células endoteliales. Para aquellos que estén interesados ​​en el estudio de prLas células endoteliales cultivadas imary de cualquiera de los genes de ratones knock-out, genes knock-en ratones, o un modelo murino de la enfermedad, este protocolo es muy útil y fácil de practicar.

<table><tbody><tr><td>Ratones de 4 o 6 semanas de edad</td><td>Jackson Laboratory</td><td>#000664</td><td></td></tr><tr><td>Estéril 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>#10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Estéril 1x PBS que contiene 1.000 U/mL de heparina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Medio de crecimiento de células endoteliales (Dulbeccos' Águila modificada' s Medio [DMEM] con 25&nbsp; mM HEPES [Gibco, #12320-032], complementado con 100&nbsp; &mu; g/mL de suplemento de crecimiento de células endoteliales de tejido neural bovino [ECGS, Sigma, #2759], 10% de suero fetal bovino [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000&nbsp; U/mL de heparina [Sigma Aldrich, H3149], 10,000&nbsp; U/mL de penicilina y 10&nbsp; mg/mL de estreptomicina [Gibco, #15140-122])Matriz</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>reducida en factor de crecimiento</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa neutra (Dispasa, 1&nbsp; U/mL, Fisher Scientific, #CB-40235) y medio D-Val (D-Valina, 0.034&nbsp; g/L, Sigma, #1255), en Dulbeccos' Águila modificada' s Glucosa media, baja (Gibco, #12320-032)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'- tetrametililindo-carbocianina perclorato acetilada acetilada (Dil-ac-LDL)</td><td>Life Technologies</td><td>L3484</td><td></td></tr><tr><td>marcado con FITC Ulex europaeus aglutinina (Ulex-Lectin)</td><td>Sigma</td><td>L9006</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo conjugado CD31-FITC antiratón</td><td>BD Biosciences</td><td>553372</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anticuerpo del receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular de ratón</td><td>Cell Signaling</td><td>9698</td><td></td></tr><tr><td>Anti-óxido nítrico endotelial de ratón sintasa</td><td>Abcam</td><td>ab5589</td><td></td></tr><tr><td>Endotelio-cadherina vascular anti-ratón</td><td>Abcam</td><td>33168</td><td></td></tr><tr><td>Calponina anti-ratón</td><td>Abcam</td><td>700</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa anti-conejo conjugada FITC Sigma</td><td></td><td>F6005</td><td></td></tr> 1 <tr><td>mL equipada con aguja de 25 G</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-900-04222</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Placas Peri</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-202-516</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular de seis pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de cultivo T12.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-202-076</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras, fórceps, tijeras de microdisección y pinzas, hoja de bisturí Fine</td><td>Science Tools, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Máquina de anestesia con isoflurano</td><td>Webster Veterianary Supply</td><td>07-806-3204</td><td></td></tr><tr><td>lámpara</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>calentamiento Máquina</td><td></td><td></td><td></td>centrífuga</tr><tr><td>Microscopio de contraste de fase invertida Microscopio</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>de fluorescencia invertida</td></tr></tbody></table>

aislamiento y cultivo primario de células endoteliales aórticas de ratón

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

El endotelio vascular es esencial para la homeostasis vascular normal. Su disfunción participa en diversos trastornos cardiovasculares. El ratón es un modelo importante para la investigación de enfermedades cardiovasculares. Este estudio demuestra un método simple para aislar y cultivar células endoteliales de la aorta del ratón sin ningún equipo especial. Para aislar las células endoteliales, la aorta torácica se extirpa rápidamente del cuerpo del ratón, y el tejido adiposo y el tejido conectivo adjuntos se extraen de la aorta. La aorta se corta en anillos de 1 mm. Cada anillo aórtico se abre y se siembra en una matriz reducida con factor de crecimiento con el endotelio hacia abajo. Los segmentos se cultivan en un medio de crecimiento de células endoteliales durante unos 4 días. La brotación endotelial comienza ya el día 2. A continuación, se extraen los segmentos y las células se cultivan continuamente hasta que alcanzan la confluencia. Las células endoteliales se recolectan utilizando proteinasa neutra y se cultivan en un medio de crecimiento de células endoteliales durante otros dos pasos antes de ser utilizadas para experimentos. La tinción con inmunofluorescencia indicó que, después del segundo paso, la mayoría de las células eran doblemente positivas para la captación de Dil-ac-LDL, la unión a la lectina y la tinción con CD31, las características típicas de las células endoteliales. Se sugiere que las células en el segundo al tercer pasaje son adecuadas para experimentos in vitro e in vivo para estudiar la biología endotelial. Nuestro protocolo proporciona un medio eficaz para identificar mecanismos celulares y moleculares específicos en la fisiopatología de las células endoteliales.

Brote de la célula endotelial espontánea de las células endoteliales brotación comenzó a partir de un segmento de la aorta del ratón. El segmento de aorta de ratón se dejó crecer en una matriz reducida del factor de crecimiento a continuación en medio de crecimiento de células endoteliales durante 4 días. El surgimiento de las células endoteliales por lo general aparece en 2 - 4 días. Las microfotografías se tomaron el día 4 (Figura 1). Como se muestra en la...

Las células endoteliales vasculares desempeñan un papel importante en muchos trastornos cardiovasculares importantes. Este artículo describe un método simple para aislar y expandir las células endoteliales de la aorta del ratón sin usar ningún equipo especial. Nuestro protocolo proporciona un medio eficaz para identificar mecanismos en la fisiopatología de las células endoteliales.

Aislamiento y cultivo primario de células endoteliales aórticas de ratón

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar un método sencillo para aislar y expandir células endoteliales de la aorta de ratón sin emplear ningún equipo especial. Otros métodos utilizados para aislar células endoteliales se aplican principalmente al corazón o al pulmón, no a la aorta. Esta técnica para la aorta proporciona un rendimiento considerablemente mayor, alta viabilidad celular y no requiere equipo ni técnicas especiales.Aunque esos aspectos se aplican al estudio de células endoteliales primarias, ya sea mediante eliminación genética o a partir de ratones murinos, que provienen de la mayoría de los modelos de enfermedad. Este protocolo es muy útil y fácil de realizar. Comience este protocolo al inicio del día.Después de anestesiar un ratón y confirmar la ausencia de reflejos, coloque al ratón en posición supina sobre una almohadilla quirúrgica y coloque una lámpara de calor sobre él para mantener su temperatura corporal. A continuación, sane la zona abdominal rociándola con etanol al 70 %. Luego, con tijeras de disección, abra el abdomen a lo largo de la línea media para exponer la aorta abdominal.Luego, abra la cavidad torácica para exponer el corazón y los pulm

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Aquí se describe un protocolo para el aislamiento y cultivo de las células endoteliales murinas pulmonar. Este método consiste en la disociación mecánica y enzimática del tejido pulmonar, así como un proceso de purificación de 2 pasos con anti-PECAM-1 y anti-ICAM-2 anticuerpos conjugados a perlas magnéticas, lo que produce una población pura de células endoteliales microvasculares su mayoría de origen.

Aislamiento y cultivo de células endoteliales pulmonares de ratones recién nacidos

Las células endoteliales microvasculares cerebrales (BMEC) están interconectadas por proteínas de unión específicas que forman una barrera altamente regulada que separa la sangre y el sistema nervioso central (SNC), la llamada barrera hematoencefálica (BBB). El aislamiento de las células endoteliales microvasculares primarias del cerebro murino, como se discute en este protocolo, permite estudios detallados in vitro de la BHE.

Aislamiento de células primaria murino cerebro endoteliales microvasculares

El objetivo de este protocolo es demostrar las técnicas de aislamiento y cultivo de las células del músculo liso vascular primaria murino (CMLV) de la circulación coronaria. Una vez que se han aislado CMLV, que se pueden utilizar para muchas técnicas de cultivo estándar.

Aislamiento de murino coronaria células musculares lisas vasculares

Este protocolo está preparado para compartir nuestro método de aislamiento de células endoteliales coronarias de ratón con fines de obtención de imágenes o para realizar experimentos de biología molecular.

Aislamiento de células endoteliales de ratón coronaria

Las células endoteliales microvasculares de los músculos esqueléticos (MMEC) forma la pared interna de los capilares musculares y regulan ambos, intercambio de moléculas de líquidos y migración de las células (inmunes) entre sangre y tejido muscular. Aislamiento de MMEC murino primario, como se describe aquí, permite completa investigaciones in vitro de la "unidad myovascular".

Aislamiento de las células endoteliales microvasculares primaria murinas músculo esquelético

Se describe un método enzimático eficaz para el aislamiento de las células endoteliales aórticas porcinas primarias (pAEC) de los cerdos en miniatura. Los pAEC primarios aislados se pueden utilizar para investigar la respuesta inmunitaria y de la coagulación en el xenotrasplante.

Aislamiento y cultivo de células endoteliales aórticas primarias de cerdos en miniatura

Aquí describimos y demostramos un protocolo para el aislamiento primario de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas (LSEC) del ratón. El protocolo se basa en la perfusión de colagenasa hepática, la purificación de células no parentales por centrifugación de baja velocidad y la selección de perlas magnéticas CD146. También fenotipo y caracterizamos estos LSEC aislados mediante citometría de flujo y microscopía electrónica de barrido.

Aislamiento y caracterización de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas primarias de ratón

Presentamos un método para aislar células endoteliales y núcleos de la luz de arterias carótidas de ratón expuestas a condiciones de flujo estables o alteradas para realizar experimentos ómicos unicelulares.

Aislamiento de células endoteliales de la luz de arterias carótidas de ratón para experimentos multiómicos unicelulares

En este artículo, las células endoteliales pulmonares primarias se aislaron y cultivaron de ratones neonatos.

Aislamiento de células endoteliales pulmonares primarias de ratón

Se presenta un protocolo para el aislamiento y cultivo primario de células endoteliales microvasculares cerebrales (BMECs) a partir de tejido cerebral murino neonatal, con el fin de generar un modelo in vitro robusto para estudiar la función de la barrera hematoencefálica bajo condiciones fisiológicas y patológicas.

Aislamiento y cultivo de células endoteliales microvasculares del cerebro de ratón

Aprende a aislar y cultivar células endoteliales de la aorta de ratón sin equipo especializado. Este protocolo sencillo ofrece alto rendimiento y viabilidad celular para investigar la fisiopatología endotelial en modelos de enfermedad cardiovascular.

Aislamiento y cultivo primario de células endoteliales aórticas de ratón

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