Name: Un In Vitro Modelo para medir la respuesta inmune a la malaria en el contexto del VIH Co-infección (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Aprende a medir la respuesta inmune innata a Plasmodium falciparum en pacientes con infección crónica por VIH mediante co-cultivo de células mononucleares y análisis de citocinas por citometría de flujo.

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C.A.M.F. y L.S. participaron en el diseño del protocolo, la adquisición y el análisis de datos, y en la redacción del artículo. 
Los autores desean agradecer al Dr. Kain, al Dr. Loutfy, al Dr. Wasmuth y al Dr. Ayi por sus contribuciones.
C.F. fue apoyada por una beca postdoctoral de CTN/Ontario HIV Treatment Network (OHTN). L.S. cuenta con el apoyo de un Premio de Desarrollo de Investigadores Junior de OHTN. El presente trabajo fue apoyado por una subvención operativa de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) (MOP-13721 y 115160), y una subvención del CIHR New Investigator Catalyst.

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<li>Venkataraman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cryopreservation+on+immune+responses.+X.+Decrease+in+interleukin-12+production+by+frozen+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+is+mediated+by+the+endogenously+hypersecreted+interleukin-10%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Effects of cryopreservation on immune responses. X. Decrease in interleukin-12 production by frozen human peripheral blood mononuclear cells is mediated by the endogenously hypersecreted interleukin-10.</a> Cryobiology. 33 (5), 581-588 (1996).</li>
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Los autores no tienen nada que revelar.

Nuestro protocolo se ha optimizado con el fin de estudiar más realista co-infección por el VIH in vitro de la malaria. En primer lugar, se requiere que los eritrocitos humanos frescos y suero para la cultura parásito de la malaria. Esto es vital para obtener una población saludable de parásitos de la malaria. Lisados ​​de parásitos no pueden ser sustituidos por parásitos vivos como la producción de citoquinas es mucho más rápida e intensa al utilizar P. en vivo falciparum infecta RBC (PfRBC) <...

Co-infección, la infección con múltiples infecciones concurrentes, es la norma en los ambientes naturales. Co-infección puede tener un impacto importante en la patología de la enfermedad y en el manejo clínico de cada infección. En el contexto de la co-infección, la vacuna y la eficacia del medicamento, así como las pruebas de diagnóstico, puede ser afectado negativamente (revisado en 1). Sin embargo, a pesar de su importancia, la mayoría de las investigaciones de patógenos considera infecciones solamente individuales. La malaria y el VIH-1 (VIH) son las principales causas de morbilidad y mortalidad a nivel mundial. Áreas de la malaria y el VIH endemicidad comparten una amplia superposición geográfica, poniendo a millones de personas en riesgo de coinfección y consecuentemente en riesgo de enfermedad clínica más grave 2-10. Las dos enfermedades interactúan negativamente. En las personas infectadas por el VIH, las cargas virales más altas de VIH y disminuciones temporales en los recuentos de células T CD4 + se puede ver durante una infección de la malaria, mientras quecargas de parásitos de la malaria y el riesgo de malaria clínica y grave son más altos en los individuos coinfectados 2,3,5,7,8,10. Los mecanismos por los que el VIH aumenta la gravedad de la malaria no se entienden completamente y garantiza una mayor investigación. Aquí se describe un método por el cual la malaria y la co-infección con el VIH puede ser estudiado in vitro. En concreto, este método permite el examen de las respuestas inmunitarias donde la malaria es específica en el contexto de la infección por el VIH. Nuestro protocolo describe un sistema versátil co-cultivo utilizando recién aisladas células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) aisladas de donantes crónicamente infectados por el VIH in vitro y se cultivaron P. falciparum parasitada eritrocitos (PfRBC). El impacto de la terapia antirretroviral contra el VIH en estas respuestas también puede ser examinada utilizando PBMCs recogidos prospectivamente del VIH (+) donantes antes y después de la terapia. Hemos utilizado este sistema para investigar el impacto de la infección por VIHen la respuesta inmune innata la malaria específico 11,12, y fueron capaces de determinar que IFN y TNF respuestas donde la malaria es específica se deterioran en las células NK, células NKT, delta gamma células T de VIH (+) donantes pre y post tratamiento antirretroviral del VIH . Además, hemos sido capaces de utilizar este sistema para determinar que las funciones de monocitos también se vean afectados en donantes VIH (+), pero se recuperan después de VIH el tratamiento antirretroviral.

<table><tbody><tr><td>Anticuerpos contra alanina</td><td>Sigma</td><td>A7377</td><td></td></tr><tr><td>(ver otra tabla)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm con BD GolgiPlug</td><td>BD</td><td>555028</td><td>incluye brefeldina A, tampón cytofix/cytoperm y tampón permanente/wash</td></tr><tr><td>BD Vacutainer ACD Solution A</td><td>BD</td><td>364506</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Heparina sódica</td><td>BD</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (sin calcio, sin magnesio)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Sigma</td><td>F1051</td><td>inactivar el calor antes</td></tr><tr><td>de usar Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>gentamicina (10 mg/ml)</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Hema3 Set de tinción</td><td>Fisher</td><td>122-911</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>hipoxantina</td><td>Sigma</td><td>H9636</td><td></td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>Sigma</td><td>I3909</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminoácidos no esenciales (10 mM)</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 polvo</td><td>Life-Technologies</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 con L-glutamina y HEPES</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30255.01</td><td></td></tr><tr><td>bicarbonato de sodio (polvo, cultivo celular)</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>Tris (base de Trizma)</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Ambion</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Azul Trypan (0.4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>BD CompBead</td><td>BD</td><td>552843, 552845</td><td>depende de los anticuerpos utilizados</td></tr><tr><td>Mezcla de gases parásitos</td><td>Por pedido</td><td></td> especial <td>3% CO2, 1% O2, equilibrio N2</td></tr><tr><td><fuerte>Equipo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 &#956; unidad</td><td></td><td></td><td></td>de filtrado m</tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio Matraces</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T25 Matraces</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>T75</td></tr><tr><td>Tubos de 50 ml 24</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>placas de cultivo de pocillos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>desenchufadas Pipetas</td><td></td><td></td><td></td>Pasteur</tr><tr><td>taponadas Pipetas</td><td></td> <td>Pasteur</td><td></td></tr> pipetas de <tr><td>transferencia estériles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hemocitómetro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>citómetro de flujo (3 láseres)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuertes>anticuerpos utilizados para citometría de flujo</fuertes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-TNF</td><td>eBiosciences</td><td>551487</td><td>FITC (fluoróforo)
2 &#956; l</td></tr><tr><td>Anti-IFN&#947;</td><td>Biolegend</td><td>506507</td><td>PE (fluoróforo) 
20 &#956; l</td></tr><tr><td>Anti-CD8</td><td>Biolegend</td><td>300914</td><td>PE-Cy7 (fluoróforo) 
1 &#956; l</td></tr><tr><td>Biolegend anti-CD14</td><td>; BD Biosciences</td><td>325624; 551487</td><td>Biotina (fluoróforo) 
0,5 &#956; l
Estreptavina PE-TR (fluoróforo) 
0.1 &#956; l</td></tr><tr><td>Anti-CD56</td><td>Biolegend</td><td>318322</td><td>PerCP/Cy5.5 (fluoróforo) 
5 &#956; l</td></tr><tr><td>Anti-&#947; &#948;</td><td>Biolegend</td><td>331212</td><td>APC (fluoróforo)
5 &#956; l</td></tr><tr><td>Anti-CD3</td><td>Biolegend</td><td>300426</td><td>APC-Cy7 (fluoróforo) 
5 &#956; l</td></tr><tr><td>Anti-CD4</td><td>Biolegend</td><td>317424</td><td>Azul del Pacífico (fluoróforo)
1 &#956; l</td></tr></tbody></table>

un<em&gt; in vitro</em&gt; modelo para medir la respuesta inmune a la malaria en el contexto del vih co-infección

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

La coinfección por malaria y VIH es una prioridad sanitaria creciente. Sin embargo, la mayoría de las investigaciones sobre la malaria o el VIH se centran actualmente en cada infección individualmente. Aunque es vital comprender la dinámica de la enfermedad para cada uno de estos patógenos de forma independiente, también es importante que se investiguen y comprendan las interacciones entre estos patógenos. 
Hemos desarrollado un modelo in vitro versátil de coinfección VIH-malaria para estudiar las respuestas inmunitarias del huésped a la malaria en el contexto de la infección por VIH. Nuestro modelo permite el estudio de los factores secretados en sobrenadantes celulares, superficie celular y marcadores de proteínas intracelulares, así como los niveles de expresión de ARN. El diseño experimental y los métodos utilizados limitan la variabilidad y promueven la fiabilidad y reproducibilidad de los datos. 
Todos los patógenos utilizados en este modelo son patógenos humanos naturales (Plasmodium falciparum y HIV-1), y todas las células infectadas se infectan de forma natural y se utilizan frescas. Utilizamos eritrocitos humanos parasitados con P. falciparum y mantenidos en cultivo continuo in vitro. Obtenemos células mononucleares de sangre periférica recién aisladas de voluntarios infectados crónicamente por el VIH. Cada condición utilizada tiene un control apropiado (P. falciparum parasitado vs. eritrocitos normales), y cada donante infectado por VIH tiene un control no infectado por VIH, del cual se recolectan células el mismo día. Este modelo proporciona un entorno realista para estudiar las interacciones entre los parásitos del paludismo y las células inmunitarias humanas en el contexto de la infección por el VIH.

Los gráficos representan los niveles de producción de IFN a partir de células NKT (Figura 2), utilizando CD56 + CD3 + γδ- puertas para obtener la población las células NKT (datos no mostrados). Las células se cultivaron durante 72 horas antes de la tinción. Una vez teñidos, 100.000 células CD3 + fueron adquiridas en el citómetro de flujo para obtener grandes poblaciones suficientes de NK, NKT y las células delta gamma (células de interés). Un mínimo de 5.600 células NKT se muestran en cada gráfica. Se o...

La coinfección humana es difícil de replicar in vitro. Sin embargo, los parásitos de la malaria humana pueden cultivarse fácilmente in vitro, al igual que las células mononucleares de sangre periférica humana recién aisladas infectadas naturalmente con el VIH. Esto proporciona un modelo excelente para estudiar las respuestas inmunitarias tempranas a los parásitos de la malaria en el contexto de la coinfección por el VIH.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para medir la respuesta inmune a la malaria en el contexto del VIH Co-infección

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

El objetivo general del siguiente experimento es observar la respuesta inmunitaria innata contra la malaria en un contexto de infección crónica por VIH. Esto se logra primero cultivando parásitos vivos de P falsiparum en glóbulos rojos humanos y, en un segundo paso, obteniendo células mononucleares de sangre periférica de donantes positivos para VIH y no infectados. Los donantes se cultivan conjuntamente con glóbulos rojos infectados por el parásito de la malaria.Finalmente, se utiliza el análisis citométrico de flujo para evaluar la actividad de citoquinas en células inmunitarias innatas de personas que viven con VIH en comparación con controles no infectados. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las coinfecciones. Por ejemplo, ¿cómo afecta la presencia de una infección como el VIH a la respuesta inmunitaria frente a una segunda infección como la malaria? Para sincronizar los parásitos, centrifugue la cultura de parásitos y lice los parásitos en estadio de trofozoítos en el sedimento con 19 volúmenes de solución de alanina a 37 grados Celsius, a temperatura ambiente. Después de 15 minutos, centrifugue las células en RPMI cero dos veces.Ajuste el hema

an-vitro-model-for-measuring-immune-responses-to-malaria-context-hiv

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infección modelo para estudiar<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-VIH-1 en las interacciones humano primario de monocitos derivados de las células inmunitarias

Este video muestra la infección ex vivo del tejido de la mucosa uterina humana con el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1, VIH-1, y su mantenimiento en la parte superior de esponjas de gelatina en la interfaz aire-líquido. Este método permite monitorear la replicación y patogénesis del VIH-1 dentro de los tejidos humanos.

Un modelo de infección de la mucosa cervical humana para estudiar la patogénesis del VIH en condiciones ex vivo

Este video muestra la generación de un modelo de cultivo celular in vitro de coinfección malaria-VIH. Las células mononucleares de sangre periférica infectadas por el VIH cocultivadas con eritrocitos parasitados por Plasmodium falciparum pueden apoyar el crecimiento mutuo y proporcionar información sobre las respuestas inmunitarias y la progresión de la enfermedad en las coinfecciones por el VIH y la malaria.

Generación de un modelo de cultivo celular in vitro de coinfección malaria-VIH

Hemos desarrollado un ensayo in vitro para investigar el papel de las vías inmunorreguladoras en la regulación de la secreción de citoquinas por las células-T CD4 específicas del VIH.

Ensayo in vitro para evaluar el impacto de inmunoreguladoras Caminos de CD4 T función específica para el VIH efector celular

La tuberculosis y la malaria son dos de las infecciones más prevalentes en los humanos y las principales causas de morbilidad y mortalidad en las poblaciones pobres de las zonas tropicales. Hemos establecido un sistema de modelo experimental para estudiar los resultados de la coinfección tuberculosis-la malaria en ratones tras la exposición a ambos patógenos a través de su vía natural de infección.

Un modelo experimental para estudiar la tuberculosis-Malaria Coinfección sobre Transmisión Natural de Mycobacterium tuberculosis Y Plasmodium berghei</i

A diferencia del VIH-1 partículas libres de células, las células T CD4 + infectados son detectados con eficacia por las células dendríticas plasmocitoides (PDC). Este manuscrito describe un método donde las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) o PDC aisladas son co-cultivadas con VIH-1 en las células T infectadas para evaluar detección innata por PDC según la evaluación de liberación de IFN de tipo I.

La evaluación de la innata de detección de VIH-1 CD4 infectados<sup&gt; +</sup&gt; Células T por las células dendríticas plasmocitoides Usando un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura del sistema.

Los invade parásito de la malaria y se replica dentro de las células rojas de la sangre. La evaluación precisa de la invasión merozoite y parasitemia es por lo tanto crucial para evaluar el curso de la infección por malaria. Aquí se describe un protocolo basado en citometría de flujo para la medición de estos parámetros en un modelo de ratón de la malaria.

En la Evaluación in vivo de roedores Plasmodium parasitemia y Merozoite Invasión por Citometría de Flujo

Este protocolo describe los métodos para construir un modelo de ratón humanizado de médula ósea/hígado/timo con inmunidad modificada basada en células madre contra la infección por VIH.

-Base de células madre Inmunidad Diseñado frente a la infección por VIH en el modelo de ratón humanizado

Describimos un modelo de ratón de malaria cerebral experimental y mostramos cómo se puede rastrear la patología inflamatoria y microvascular in vivo utilizando imágenes de resonancia magnética.

Seguimiento In Vivo del Desarrollo del Edema y Patología Microvascular en un Modelo de Malaria Cerebral Experimental usando Imágenes de Resonancia Magnética

El objetivo general de este protocolo es proporcionar instrucciones sobre cómo medir la capacidad de los anticuerpos presentes en los sueros o plasma de individuos, expuestos naturalmente a la infección por Plasmodium falciparum, para opsonizar e inducir la fagocitosis de los eritrocitos infectados por parásitos (IE).

Medición de anticuerpos que inducen la fagocitosis adquirida naturalmente a los parásitos plasmodium falciparum mediante un ensayo basado en citometría de flujo

Aquí describimos un nuevo método para ayudar a dilucidar los mecanismos de inmunidad celular a Plasmodium durante la etapa sanguínea de la infección. Este es un ensayo in vitro que mide la destrucción de glóbulos rojos infectados por linfocitos citotóxicos.

In vitro Ensayo de destrucción de glóbulos rojos infectados con plasmodio por linfocitos citotóxicos

Aprende a medir la respuesta inmune innata a Plasmodium falciparum en pacientes con infección crónica por VIH mediante co-cultivo de células mononucleares y análisis de citocinas por citometría de flujo.

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