Name: Preparación de Mica y Silicon Sustratos para el Análisis de Origami ADN y Experimentación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Aprende a preparar sustratos de mica y óxido de silicio para experimentos de origami de ADN mediante limpieza RCA y funcionalización con iones magnesio. Estos protocolos reproducibles mejoran la calidad de las estructuras nanométricas.

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Los autores agradecen al Dr. Gary Bernstein por el uso del AFM.

Planificación 1. Experimentar y Preparación de materiales <ol><li> Determinar el diseño, la concentración, y la funcionalidad del origami de ADN que será usado en los experimentos. 14-16 Aquí, nosotros usamos un diseño ADN origami rectángulo preparado en 1x TAE / solución de Mg 2+ (40 mM Tris-base, 20 mM ácido acético, EDTA 2 mM y 12 mM acetato de magnesio, pH 8,0). 17 </li><li> Autoclave todos los consejos, tubos y envases usados ​​para ser utilizado. Estos materiales deben ser todos autoclave compatible. </li><li> Preparar un suministro de agua estéril para enjuagar. Llenar un frasco estéril con aproximadamente 500 ml de 18 mO x cm de agua, el lugar en una zona de cocción, hervir durante 5 minutos con la tapa, y toma el frasco fuera de la zona de cocción y dejar enfriar con la tapa colocada en el contenedor pero no apretado . Guarde en el refrigerador y preparar una nueva oferta cada mes o cuando sea necesario. </li></ol> 2. Preparación de la Mica Sustrato <ol><li> Corte los sustratos al tamaño adecuado (1 cm x 1 cm) cuadrados con unas tijeras. Mica es delgado y quebradizo. Por otra parte, la compra de la mica en forma de disco que no requiere cortar. </li><li> Escindir la mica con cinta de doble cara. Mica se compone de capas de minerales separadas por iones de intercalación, cada capa se puede despegar cuando se adhiere a la cinta de doble cara. 18 <ol><li> Coloque los cuadrados de mica en la cinta de doble cara todavía en el dispensador de cinta, asegurándose de que se adhiere firmemente a la cinta. Deslice cuidadosamente las pinzas entre la mica y la cinta, la más capa superior se eliminará y se mantienen en la cinta. Inmediatamente después de la eliminación, la plaza mica tendrá frente a su lado limpio hacia abajo. Asegúrese de voltear la mica sobre antes de guardarlo en un recipiente. </li><li> Repita esto tres o cuatro veces para asegurar la eliminación completa de la capa superior más y una limpieza adecuados. </li></ol></li><li> Alternativamente, adherir la mica a un contenedor o de sobremesa con un trozo de cinta de doble cara y utilizar una segunda pieza para stick hacia y retire la capa superior más mica. La mica se limpiará correctamente en ambos casos, aunque el método alternativo hace depositar ADN y enjuagar y secar la muestra difícil debido a la segunda adherencia al soporte. </li></ol> 3. Depósito ADN Origami en Mica <ol><li> Brevemente, mezclar el vial de origami de ADN usando un mezclador de vórtice para asegurar una dispersión uniforme de nanoestructuras en solución. </li><li> Pipeta 4 l de solución sobre la mica, asegurando que la punta de la pipeta no toca el sustrato. Deje el origami de ADN en la mica por aproximadamente 10 minutos para asegurar una cobertura adecuada. El tiempo de deposición puede variar dependiendo de la concentración de origami de ADN utilizado, así como la cobertura deseada (Figuras 2 y 3). <ol><li> Enjuague la solución de origami de ADN fuera del substrato de mica usando 100 l de agua estéril sobre un fregadero u otro recipiente de líquido. Recoge la mica con unas pinzas. Pipetear el agua en elsustrato, con el flujo de la gota hacia la punta de las pinzas. Agite la mica con la baja de movimiento afilados para quitar el exceso de agua. Mantenga las pinzas en posición vertical para que el agua fluirá hacia las pinzas para evitar la contaminación de la muestra. </li></ol></li><li> Se seca el sustrato con una corriente constante de nitrógeno (N 2) durante 1 min. Asegúrese de que se elimina el exceso de agua. Repita el enjuague con un adicional de 100 l de agua estéril. Se seca el sustrato con N 2 durante otros 3 minutos. Un sustrato completamente seco es necesaria para el análisis exitoso microscopía de fuerza atómica (AFM) (Figura 4). </li><li> Analizar el sustrato utilizando AFM o almacenar en un recipiente cerrado. </li></ol> 4. CMOS / Silicon Limpieza Set-up <ol><li> PRECAUCIÓN: Cuando se utiliza el CMOS set-up, utilizar equipo de protección personal en todo momento. Los reactivos incluyen ácidos fuertes, bases fuertes, ácido fluorhídrico (HF), y fuertes agentes oxidantes que can reaccionar con disolventes residuales si los reactivos no se desechan convenientemente. Tener en cuenta las siguientes medidas de seguridad: <ol><li> Casa el CMOS banco en una campana química con ningún otro proceso o set-ups. </li><li> Use guantes de nitrilo, bata de laboratorio, gafas de seguridad, guantes de nitrilo grandes industriales, un delantal derrame, y una careta en todo momento al utilizar el banco de CMOS. </li><li> Utilice tubos de plástico como de contención secundaria cuando se preparan soluciones. </li><li> Use un vaso de precipitados de medición fluorado polímero inerte para el manejo de la HF concentrado. </li><li> Hacer ungüento gluconato de calcio disponible como primeros auxilios para cualquier exposición de la piel. </li><li> Sólo por personal debidamente capacitado para llevar a cabo el proceso. </li><li> Asegúrese siempre de otro miembro del laboratorio está presente en caso de emergencia. </li><li> Mantenga la información MSDS para todos los productos químicos cerca de la campana. </li><li> Estar familiarizado con la institución de políticas o de derrames químicos y de exposición de la empresa. Nota: HF penetra fácilmente la piely es un eliminador de calcio, que afecta a los huesos y nervios dañinos si se produce la exposición. La exposición dérmica a unos pocos mililitros de ácido fluorhídrico concentrado puede ser peligroso e incluso mortal. Establecer las precauciones necesarias para garantizar la exposición no se produce. </li></ol></li><li> Realizar RCA1 y RCA2 en unos vasos separados 250 ml de vidrio en placas separadas. Cada vaso de precipitados debe contener una barra de agitación. Controlar la temperatura de la solución utilizando termómetros sujetadas por lo que la barra de agitación no golpear en el bulbo. Cubrir los vasos de precipitados utilizando un vidrio de reloj para disminuir los efectos de la evaporación. </li><li> Preparación RCA1 <ol><li> Colocar 50 ml de 18 mO x cm de agua en el vaso RCA1 designado usando un vaso de precipitados de medición. </li><li> Añadir 15 ml de hidróxido de amonio concentrado (NH 4 OH) al vaso de precipitados. Enjuague el vaso de precipitados de medición con 25 ml de agua y añadir el agua de enjuague en el vaso RCA1. </li><li> Encienda el calor y agitador en la placa caliente y llevar el baño RCA1 a 70 ° C. </li&gt; <li> Añadir 15 ml de peróxido de hidrógeno al 30% (H 2 O 2) al vaso de precipitados RCA1. Utilice la solución RCA1 dentro de 1 hora después de que el H 2 O 2 se ha añadido. El baño puede ser utilizado varias veces en el lapso de tres días si se añaden 15 ml de peróxido para el baño cada vez. </li><li> Enjuague el vaso de precipitados de medición a fondo con agua y deseche el enjuague en una botella de residuos RCA1 apropiado. </li></ol></li><li> Preparación RCA2 <ol><li> Añadir 70 ml de 18 mO x cm de agua al vaso de precipitados RCA2 designado utilizando el vaso de medición minuciosamente enjuagado. </li><li> Añadir 15 ml de ácido clorhídrico concentrado (HCl). Enjuague el vaso de precipitados de medición con 20 ml de agua y añadirlo al vaso de precipitados RCA2. </li><li> Suba el fuego y revuelva velocidad de la placa de cocción hasta que la solución alcanza 70 ° C. </li><li> Añadir 15 ml de 30% de H 2 O 2. Al igual que el baño de RCA1, utilice esta solución dentro de 1 hora de cuando se añade el H 2 O 2; Además, el bañopuede ser reutilizado varias veces en el lapso de tres días si se añade 15 ml de H 2 O 2 antes de cada uso. </li></ol></li><li> Preparación de la solución HF <ol><li> Colocar 50 ml de agua en un vaso de precipitados de polímero fluorado inerte. </li><li> Medida 4 ml de ácido fluorhídrico concentrado (49%) en el vaso medidor de plástico y añadir al vaso de precipitados de polímero fluorado inerte. </li><li> Enjuague el vaso con plástico que mide un total de 50 ml de agua, añadir el agua de enjuague en el vaso HF. Lavar el vaso de precipitados de medición a fondo con agua y deseche los lavados en un contenedor de residuos HF designado. </li></ol></li></ol> 5. Preparación y Limpieza del Silicio sustrato <ol><li> Cortar las obleas de silicio en chips <ol><li> Identificar las direcciones de celosía perpendiculares y paralelas en la superficie pulida plana de la oblea de silicio. Estas direcciones se utilizan para ayudar a que las plazas de escisión más fácil. Las siguientes instrucciones se refieren a cleavción de silicio &lt;110&gt; y puede no ser adecuado para otras orientaciones cristalinas. </li><li> Coloque la oblea de silicio pulido de lado sobre una superficie blanda, como una servilleta. Uso de la pluma escriba con punta de diamante, suavemente nick la parte inferior de la oblea a lo largo del borde plano primaria. Coloque un pequeño alambre, tal como un clip, por debajo del nick y aplicar una suave presión a la oblea mediante la colocación de los dedos o unas pinzas en cada lado de la nick y empujando hacia abajo. Hacer esto separar la oblea en dos mitades a lo largo de la línea de red cristalina en la dirección escinden natural. </li><li> En otra servilleta, con un lápiz y una regla, mida la anchura deseada de las plazas marcando puntos en la parte superior y la parte inferior de la servilleta. Conecte estos puntos con líneas rectas. Esto servirá como una guía para las formas, incluso cuadrados. </li><li> Coloque una de las mitades de la oblea de canto primero entre las líneas medidas en la servilleta tiraba contra la línea y repita el paso en 5.1.2 El recién roto perpendicular pieces ahora deben ser la anchura de los cuadrados escindidos. Gire la oblea horizontalmente en la servilleta. Colóquelo entre líneas perpendiculares y repita el proceso en el paso 5.1.2. </li><li> Guarde las virutas de la oblea recién escindidas en un frasco limpio lleno de agua DI para evitar que se raye. Los chips de silicio se pueden almacenar de forma indefinida, pero se deben limpiar antes de comenzar los experimentos. </li></ol></li><li> CMOS de limpieza de Silicon <ol><li> Cuando la solución RCA1 ha alcanzado la temperatura apropiada, sumergir ocho a diez 1 cm x 1 cm chips de silicio en la solución utilizando una cesta de polímero fluorado inerte con un &quot;diámetro 2. Burbujas de oxígeno se formará en los chips y las paredes del vaso de precipitados. Si no hay burbujeo ocurre, el H 2 O 2 es degradada. Deje las fichas en la solución durante 10 a 20 min, agitando la canasta de arriba a abajo cada pocos minutos para mantener las fichas se peguen entre sí. </li><li> Levante la cesta que contiene los chips de silicio y escurrir bien. Mueva la cesta sobre to el vaso de residuos y enjuague bien con 18 mO x cm de agua. Sumerja en el vaso de lavado y agitan arriba y abajo durante 20 segundos. Escurrir la cesta y enjuagar bien con agua sobre el vaso de residuos. Vacíe el recipiente de residuos en una botella de residuos RCA1 designada y vuelva a llenar con agua. </li><li> Después de la limpieza RCA1 es completa, colocar la cesta en el vaso de precipitados 1:50 HF para 10 a 20 seg. Use un suave movimiento ascendente y descendente para mezclar los chips y HF. Levante el cubo volcada para permitir que el HF se drene por completo. Nota: Las superficies de viruta deben ser hidrófobo; agua no mojar el chip, pero en lugar formar gotitas con altos ángulos de contacto. Esto indica que el óxido de silicio ha sido grabado al agua fuerte de distancia y el chip está ahora terminado por enlaces Si-H. </li><li> Poner el vaso de lavado y enjuague vaso en un recipiente de plástico, mover la cesta sobre el vaso de enjuague y enjuague con 18 mO x cm de agua. Sumerja la canasta en el vaso de lavado y agite durante 20 segundos. </li><li> Completar un segundo drenaje y Rinsciclo e con 18 mO x cm de agua. Volcar el agua de lavado en el vaso de enjuague y vuelva a llenar el vaso de lavado con agua. Vierta todos los residuos en una botella de plástico de residuos HF designado. </li><li> Cuando la solución RCA2 ha alcanzado la temperatura apropiada, sumergir los chips de silicio en las soluciones utilizando la cesta. Deja en la solución durante 10 a 20 min. El chip será ahora hidrófila debido al crecimiento de un (1-2 nm) óxido de película delgada. </li><li> Eliminar después de la cantidad adecuada de tiempo y seguir los mismos procedimientos de lavado como para RCA1. Deshágase de los residuos en el contenedor de residuos RCA2 apropiado. Retire cada chip de la cesta con pinzas de plástico, enjuagar con agua y secar con nitrógeno. </li><li> Chips de las tiendas en una caja de obleas de plástico o en un frasco de 18 cm x mO agua. El silicio se mantendrá limpia cuando se almacena en agua durante aproximadamente tres días después de la limpieza. Asegúrese de que el área de trabajo se limpia adecuadamente y el exterior de los guantes CMOS haber sido lavado. Deje la CMGuantes de OS en el capó se sequen. </li></ol></li></ol> 6. Depósito ADN Origami sobre silicio funcionalizado APTES <ol><li> Autoensamblada monocapa Formación sobre silicio <ol><li> APTES calentar a temperatura ambiente antes de abrir. Si la botella es demasiado frío, se puede producir condensación, provocando la hidrólisis de los APTES durante el almacenamiento. Añadir 1.980 l de 18 mO x cm de agua y 20 l de APTES a un vial de centelleo limpia y agitar para mezclar. Utilice esta solución inmediatamente. </li><li> Coloque un chip de silicio limpiado reflexivo de lado en el vial de centelleo, colmo, y deje reposar durante 20 minutos. Retire el chip usando pinzas y enjuague con 200 l de agua y en seco durante 1 minuto con una corriente de N2. </li></ol></li><li> Depositar origami de ADN en APTES funcionalizado Silicio Nota: Los pasos para depositar origami de ADN en el silicio funcionalizado son análogos a aquellos para depositar sobre mica. <ol><li> Mezclar brevemente el vial de origami de ADN y pipeta de 4 l de soluciónsobre el sustrato de silicio. Si es necesario, aumentar el volumen de la solución de origami de ADN utilizado para cubrir todo el sustrato como el silicio funcionalizado es más hidrófobo que el sustrato de mica. Utilice una hoja de cubierta de vidrio para presionar la solución de deposición hacia abajo y evitar la evaporación durante largos deposiciones. </li><li> Dejar reposar la solución por la cantidad de tiempo necesario para que la concentración utilizada y la cobertura deseada (véanse las Figuras 2 y 3 para el efecto del tiempo y la concentración en cobertura de la superficie). Enjuagar el sustrato con 100 l de 18 mO x cm de agua estéril y seca con N 2 durante 1 min. </li><li> Repetir el enjuague con un adicional de 100 l de agua estéril y secar el sustrato con N2 durante 3 min. </li><li> Conservar la muestra en un recipiente limpio hasta que otros experimentos o de imágenes se pueden realizar. Las muestras comienzan a mostrar acumulación de partículas después de aproximadamente una a dos semanas de almacenamiento en función de cómo much se manejan. </li></ol></li></ol> 7. Imaging AFM y Análisis de Imágenes de las muestras de ADN de Origami <ol><li> Utilice AFM en modo Tapping en el aire con fines de imagen. El modo de tocar asegura que una fuerza mínima será aplicado a las nanoestructuras frágiles, en comparación con el modo de contacto. Nota: Los parámetros de imagen serán dependientes en el instrumento. Todas las imágenes presentadas fueron capturados utilizando un MultiMode Nanoscope IIIa. </li><li> Seleccione sondas de AFM de no contacto / modo en el aire de tapping, con revestimiento reflectante de oro, una frecuencia de resonancia (nominal) de ~ 300 kHz, fuerza constante de 40 N / m, y punta de radio &lt;10 nm. </li><li> Procesar y analizar las imágenes de AFM utilizando NanoScope Software de Análisis. Realizar cálculos de cobertura usando ImageJ. 19 </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hay varios pasos que hay que hacer hincapié para lograr resultados consistentes y ideales. Para las muestras de mica, siguiendo un estricto y enjuague a fondo y secado régimen, como en los pasos 3.3 y 3.4, se asegurará de que las imágenes de alta calidad de origami de ADN individuales pueden alcanzarse mediante AFM sin los diversos problemas descritos en la sección de Resultados Representante. De importancia primaria para muestras de silicio es la limpieza del sustrato. Siguiendo los procedimientos de limpieza descritos...

Presentado por primera vez en 2006, el origami de ADN utiliza la naturaleza auto-ensamblaje de oligonucleótidos de ADN para producir nanoestructuras designable y altamente ordenados. 1 Una miríada de estructuras se han reportado, que van desde caras sonrientes a enganchada cajas de 3 dimensiones. 2 ADN origami se puede funcionalizar con diferentes biomoléculas y nanoestructuras, dando lugar a aplicaciones de investigación en nanoelectrónica, la medicina y la computación cuántica. 3 Sin embargo, el análisis y muchas aplicaciones futuras no dependen sólo de diseño estructural, sino también de la adhesión de las nanoestructuras de origami de ADN a las superficies. Los métodos descritos en este manuscrito se refieren a la preparación de muestras de origami de ADN en dos tipos de sustratos: mica y óxido de silicio funcionalizado. Mica es el sustrato de elección para estudios de origami de ADN porque es atómicamente plana, con una altura de capa de 0,37 ± 0,02 nm nm. 4 También es EASily limpiado, por lo que la preparación de muestras y la microscopía de fuerza atómica (AFM) Estudios sencillo. Mica moscovita contiene una alta densidad de potasio en cada plano de escisión, pero estos iones se difunden fuera de la superficie de mica cuando en el agua. Para mediar en la unión de origami de ADN al sustrato mica, Mg 2+ se utiliza para invertir la carga negativa de la mica y se unen electrostáticamente el esqueleto de fosfato del ADN al sustrato (Figura 1A). 5 Las mezclas de ADN recocido en presencia de gran excesos de hilos básicos dan una alta cobertura y buenas imágenes en la mica, porque la adhesión de origami de ADN a la superficie 2+ -terminated Mg es mucho más fuerte que la adhesión de oligonucleótidos de cadena sencilla (hebras de primera necesidad). Otros iones cargados positivamente, incluyendo Ni y Co 2+ 2+ se pueden utilizar para controlar la adherencia de ADN en mica. 6,7 Cambio de la concentración de cationes monovalentes y divalentes en solución puede mediar adhetasas de origami de ADN sión y difusión superficial. 8 Sin embargo, el protocolo para la preparación de sustratos de mica y depositar y enjuagar el origami a menudo no se describe explícitamente en los manuscritos publicados. 9 Sin un protocolo claro, resultados reproducibles pueden ser difíciles de obtener. La mica es un aislante, por lo que no es adecuado como sustrato para algunas aplicaciones en nanoelectrónica. Silicio pasivado con un óxido nativo delgada tiene propiedades electrónicas deseables, incluida la compatibilidad con el procesamiento antes de semiconductor de óxido de metal de cortesía (CMOS) para crear estructuras de entrada / salida y las características topográficas. Las obleas de silicio almacenados en el aire se pasivan ya sea con un óxido térmico de espesor o película delgada de óxido nativo que es relativamente sucio, con un alto número de partículas. El óxido de silicio tiene una densidad de carga superficial mucho más baja que la mica, y la densidad de carga es altamente dependiente de la preparación de óxido y la historia. En las concentraciones de iones de magnesio above 150 mM, buenas coberturas (hasta 4 / m 2) de origami de ADN rectangular se puede lograr sobre sustratos de silicio de plasma tratado de oxígeno; sin embargo, esta concentración y la cobertura pueden cambiar dependiendo del tamaño y el diseño de las nanoestructuras que se utiliza. 10 Un protocolo alternativo para el ajuste de la carga superficial es adjuntar un auto-ensamblado monocapa catiónica de 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) (Figura 1B) a el óxido. La amina primaria en APTES puede estar protonado a valores de pH por debajo de 9, la modificación de la carga y la hidrofobicidad del sustrato. 11 Para una monocapa completa de APTES para ser depositado con éxito, el silicio debe ser limpiado apropiadamente utilizando protocolos (RCA) Radio Corporation of America . Estos protocolos incluyen tratamientos en hidróxido de amonio y soluciones de peróxido de hidrógeno (RCA1) para eliminar los residuos orgánicos y los contaminantes de partículas. Un corto grabado en solución acuosa de ácido fluorhídrico elimina la capa de óxido nativo junto concualesquiera contaminantes iónicos que se adhieren al óxido. Finalmente, las muestras se exponen a una solución de ácido clorhídrico y peróxido de hidrógeno (RCA2) para eliminar el metal y contaminantes iónicos y formar una capa de óxido delgada, uniforme. 12 La mayoría de salas blancas han designado capuchas para protocolos de limpieza CMOS, con reglas estrictas sobre lo que se puede utilizar en estas áreas. Un problema común viene en la forma de iones tales como sodio, que pueden alterar las propiedades electrónicas de estructuras CMOS mediante la creación de trampas midbandgap. 13 Los iones comúnmente utilizado en origami de ADN de preparación y deposición tampones podría contaminar los baños CMOS y causar problemas para otros investigadores utilizando la habitación limpia. Por esta razón, nuestro grupo utiliza un CMOS &#39;sucias&#39; banco de limpieza dispuestos específicamente para las pequeñas muestras utilizadas para la investigación de origami de ADN. Este proceso es una buena alternativa a la sala blanca tradicional puesta a punto y puede ser adecuado para laboratorios que no tienen acceso a un banco de CMOS de sala limpia.

<table><tbody><tr><td>Eppendorf epT.I.P.S. Recargas, capacidad 2-200&nbsp; &mu; l</td><td>VWR International, LLC</td><td>22491733</td><td>10 bandeja de recarga de 96 puntas</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga, polipropileno</td><td>VWR International, LLC</td><td>87003-290</td><td>0,65 ml, natural</td></tr><tr><td>Research Plus Pippete - Un canal - 20-200&nbsp; &mu; l</td><td>A. Daigger & Compañía, Inc.</td><td>EF8960F-3120000054 EACH</td><td>Volumen ajustable</td></tr><tr><td>Research Plus Pippete - Un solo canal - 2-20&nbsp; &mu; l</td><td>A. Daigger & Compañía, Inc.</td><td>EF8960D-3120000038 CADA</td><td>Volumen Ajustable</td></tr><tr><td>Scotch 237 Cinta Permanente de Doble Cara Office Depot</td><td>, Inc.</td><td>602710</td><td>3/4" x 300", Paquete de 2</td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice</td><td>Thermo Scientific</td><td>M37610-33Q</td><td></td></tr><tr><td>Contenedor de obleas individual, 2" (50 mm), 60 mm x 11&nbsp; mm</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>64917-2</td><td>6 por paquete</td></tr><tr><td>Oblea de 6", tipo P, < Orientación 100>, con plano primario</td><td>Nova Electronic Materials, Ltd.</td><td></td><td></td>GC49266</tr><tr><td>Guantes de examen de nitrilo sin polvo</td><td>VWR International, LLC</td><td>82062-428</td><td>El número de catálogo es para</td></tr><tr><td>sondas sin contacto de alta precisión de tamaño grande con recubrimiento reflectante de Au</td><td>K-Tek Nanotechnology, Inc.</td><td>HA_NC/15</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave Pan</td><td>A. Daigger & Compañía, Inc.</td><td>NAL692-5000 EF25341C</td><td></td></tr><tr><td>Guantes Agresivos Sol-Vex II, Tamaño: 9-9.5; 15 mil, 13 pulgadas - 1 dz</td><td>Spectrum Chemical Mfg. Corp.</td><td>106-15055</td><td>Antes de usar, enjuague con agua y frote hasta que no se formen burbujas en los guantes.</td></tr><tr><td>Pinzas PTFE 200 mm Square</td><td>Dynalon Corp.</td><td>316504-0002</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de mica moscovita V-5</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica de</td> calidad <td>71850-01</td><td>10 por paquete</td></tr><tr><td>Disco de mica, 10 mm</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>50</td><td>discos de mica son opcionales</td></tr><tr><td>Bolígrafo Scriber Diamon para cristalería</td><td>VWR International, LLC</td><td>52865-005</td><td></td></tr><tr><td>Viales de centelleo, vidrio de borosilicato, con tapón de rosca - 20 ml</td><td>VWR International, LLC</td><td>66022-060</td><td>Caja de 500, con tapa de polipropileno adjunta y revestimiento de papel de celulosa</td></tr><tr><td>4 x 5 pulgadas Placa caliente PC-200 superior de 5 pulgadas, 120 V/60 Hz</td><td>Dot Scientific, Inc.</td><td>6759-200</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de vidrio de lados rectos, boca ancha</td><td>VWR International, LLC</td><td>89043-554</td><td>Caja de 254, tapones con revestimiento de pulpa/vinilo adjunto</td></tr><tr><td>Vaso de precipitados de vidrio estándar, capacidad de 250 ml</td><td>VWR International, LLC</td><td>173506</td><td></td></tr><tr><td>vasos de precipitados, PTFE</td><td>VWR International, LLC</td><td>89026-022</td><td>Para usar con vidrio de</td></tr><tr><td>reloj HF Shallow Form, 3"</td> <td>VWR International, LLC</td><td>66112-107</td><td>Caja de 12 contenedores de almacenamiento de</td></tr><tr><td>plástico</td><td>VWR International, LLC</td><td>470195-354</td><td>Para contenedor secundario</td></tr><tr><td>Termómetros de líquido en vidrio de uso general</td><td>VWR International, LLC</td><td>89095-564</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas ultrafinas y de alta precisión</td><td>Microscopy Sciences</td><td>78310-0</td><td></td></tr><tr><td>Pantalla facial de policarbonato</td><td>Fisher ScientificInc.</td><td>18-999-4542</td><td></td></tr><tr><td>Delantal de neopreno</td><td>Fisher Scientific, Inc.</td><td>19-810-609</td><td></td></tr><tr><td>Gluconato de calcio, Calgonato</td><td>W.W Grainger, Inc.</td><td>13W861</td><td>Tubo, 25 g</td></tr><tr><td>Peróxido de Hidrógeno 30% CR ACS 500 ml</td><td>Fisher Scientific, Inc.</td><td>H325 500</td><td>DAÑINO, TÓXICO</td></tr><tr><td>3-Aminopropiltrietoxisilano</td><td>Gelest Inc.</td><td>SIA0610.0-25GM</td><td>Deje calentar a temperatura ambiente antes de usar.</td></tr><tr><td>Hidróxido de amonio, 2,5 L</td><td>Fisher Scientific, Inc.</td><td>A669-212</td><td>NOCIVO, TÓXICO</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Fisher Scientific, Inc.</td><td>A144-212</td><td>NOCIVO, TÓXICO</td></tr><tr><td>Ácido fluorhídrico</td><td>Fisher Scientific, Inc.</td><td>A147-1LB</td> DAÑINO<td>, TÓXICO</td></tr><tr><td>Nanoscopio MultiMode IIIa</td><td>Veeco Instruments, Inc.</td><td></td><td>Cualquier AFM capaz de utilizar el modo de roscado es adecuado para el análisis</td></tr><tr><td>Cesta de inmersión</td><td>Hecho en laboratorio</td><td>Hecho en laboratorio</td><td>La cesta de inmersión se fabricó utilizando el fondo de una botella de PTFE con agujeros perforados, mango de PTFE y todos los tornillos de PTFE.</td></tr></tbody></table>

preparación de mica y silicon sustratos para el análisis de origami adn y experimentación

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

La naturaleza diseñada y la síntesis controlada de origami de ADN en un solo recipiente ofrece oportunidades emocionantes en muchos campos, particularmente en la nanoelectrónica. Muchas de estas aplicaciones requieren la interacción y la adhesión de nanoestructuras de ADN a un sustrato. Debido a su naturaleza atómicamente plana y fácil de limpiar, la mica ha sido el sustrato elegido para los experimentos de origami de ADN. Sin embargo, las aplicaciones prácticas de la mica son relativamente limitadas en comparación con las de los sustratos semiconductores. Por esta razón, aquí se presenta un proceso sencillo, estable y repetible para la adhesión del origami del ADN sobre el óxido de silicio derivatizado. Para promover la adhesión de las nanoestructuras de ADN a la superficie de óxido de silicio, se deposita una monocapa autoensamblada de 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) a partir de una solución acuosa que es compatible con muchos fotorresistentes. El sustrato debe limpiarse de todos los contaminantes orgánicos y metálicos mediante procesos de limpieza de Radio Corporation of America (RCA) y la capa de óxido nativo debe grabarse para garantizar una superficie plana y funcionalizable. Las salas limpias están equipadas con instalaciones para la limpieza de silicona, sin embargo, muchos componentes de los tampones y soluciones de origami de ADN a menudo no se permiten en ellos debido a problemas de contaminación. Este manuscrito describe la configuración y el protocolo para la limpieza de silicona a pequeña escala en el laboratorio para los investigadores que no tienen acceso a una sala limpia o que desean incorporar procesos que podrían causar la contaminación de un banco limpio CMOS de sala limpia. Además, se discuten las variables para regular la cobertura y se describe cómo reconocer y evitar problemas comunes de preparación de muestras.

Dos variables determinan la cobertura de origami de ADN en el sustrato: concentración de la solución y tiempo de exposición. Las características de adsorción de origami de ADN en mica y APTES óxido de silicio funcionalizado se ha informado anteriormente. 13 La relación entre la concentración de origami de ADN en la solución de deposición y las coberturas finales sobre mica se resumen en la Tabla 1 y la Figura 2, que muestra el aumento de los resultados de concentración en una...

Se describen los procesos de limpieza reproducibles para sustratos utilizados en la investigación de origami de ADN, incluida la limpieza RCA de sobremesa y la derivatización de óxido de silicio. Se ilustran los protocolos para la preparación de la superficie, la deposición de origami de ADN, los parámetros de secado y las configuraciones experimentales simples.

Preparación de Mica y Silicon Sustratos para el Análisis de Origami ADN y Experimentación

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

El objetivo general del siguiente experimento es preparar dos tipos de sustratos para experimentos de NANOESTRUCTURAS DE ADN: mica y óxido de silicio funcionalizado. Esto se logra de dos maneras diferentes según el sustrato. La capa superior de la mica se elimina utilizando cinta adhesiva de doble cara en un proceso rápido y sencillo.Por el contrario, los sustratos de silicio deben limpiarse utilizando la limpieza RCA, que implica la eliminación de la capa de óxido y la remoción de contaminantes metálicos y orgánicos. Esto produce una capa de óxido de silicio limpia y lisa que puede funcionalizarse adicionalmente. A continuación, la MICA se inunda con iones de magnesio para crear una superficie con carga positiva.Se crea una superficie análoga sobre el sustrato de óxido de silicio mediante la formación de una bicapa autoensamblada con carga positiva, como el trietil aminopropilo. A continuación, el sustrato se expone a la solución de origami de ADN para favorecer la adhesión del ADN con carga negativa a los sustratos con carga positiva. La cobertura depende del tipo de sustrato, la concentración de la solución y el tiempo de deposición, factores que pueden variarse según el experimento realizado.La principal ventaja de esta técnica es que el APT forma una monocapa y está unido covalentemente a la superficie de silicio. Puede depositarse en un patrón específico mediante litografía de haz de electrones y una técnica denominada desprendimiento molecular. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades con las técnicas de manipulación únicas necesarias para los sustratos pequeños, así como para perfeccionar el protocolo adecuado para el manejo del depósito y el trazado.La demostración visual de este método es fundamental, ya que las manipulaciones del sustrato y los pasos del protocolo de limpieza y seguridad de RCA son difíciles de describir por escrito. La representación visual de estos pasos necesarios de seguridad es importante para promover prácticas seguras en el laboratorio. Primero, prepare el sustrato cortando cuadrados de un centímetro por un centímetro del sustrato de MICA con tijeras.Corte la MICA utilizando cinta adhesiva de doble cara. Coloque el rectángulo de MICA sobre la cinta adhesiva aún dentro del dispensador de cinta. Deslice cuidadosamente las pinzas entre la MICA y la cinta y retire la mica.Se eliminará la capa superior, que permanecerá en la cinta. Luego, pipetee cuatro microlitros de solución de ADN origami adecuadamente vortexeada sobre la mica, asegurándose de que la punta de la pipeta no toque el sustrato. Deje el ADN origami sobre la MICA durante aproximadamente 10 minutos.Para garantizar una cobertura adecuada, enjuague la solución de origami de ADN de la superficie del sustrato de mica utilizando 100 microlitros de agua estéril sobre un fregadero u otro recipiente para líquidos. Para ello, tome la mica con pinzas. Pipetee el agua sobre el sustrato con el flujo de la gota dirigido hacia la punta de las pinzas.Seque el sustrato con un flujo constante de nitrógeno durante un minuto. Repita los RINs con 100 microlitros adicionales de agua estéril antes de secar el sustrato con nitrógeno durante tres minutos adicionales. Para la preparación de la solución uno de la Radio Corporation of America (RCA), vierta 50 mililitros de agua de 18 megaohmios por centímetro en el vaso de precipitados designado para la solución uno RCA utilizando un vaso graduado, luego agregue 15 mililitros de hidróxido de amonio concentrado al vaso.Lave el vaso de precipitados con 25 mililitros de agua y añada el agua de lavado al vaso del RCA uno. Encienda el calor y agite en la placa calefactora hasta llevar el baño del RCA uno a 70 grados Celsius. A continuación, añada 15 mililitros de peróxido de hidrógeno al 30% al vaso del RCA uno.Asegúrese de utilizar la solución RCA uno dentro de una hora después de haber agregado el peróxido de hidrógeno. Enjuague el vaso de medición cuidadosamente con agua y deseche el enjuague en un recipiente adecuado para residuos de la solución RCA uno de la Radio Corporation of America. Preparación de la solución RCA dos.Agregue 70 mililitros de agua de 18 megaohmios por centímetro al vaso de precipitados designado para RCA dos utilizando el vaso medidor debidamente etiquetado. A continuación, agregue 15 mililitros de ácido clorhídrico concentrado. Enjuague el vaso medidor con 20 mililitros de agua y añádalo al vaso de precipitados de RCA dos.Aumente el calor y la velocidad de agitación de la placa calefactora hasta que la solución alcance 70 grados Celsius. Luego agregue 15 mililitros de peróxido de hidrógeno al 30%. Como en el baño único de RCA.Utilice una solución dentro de una hora a partir del momento en que se añade el peróxido de hidrógeno. Para preparar la solución de fluoruro de hidrógeno, coloque 50 mililitros de agua en un vaso de precipitados de polímero fluorado inerte. Mida cuatro mililitros de ácido fluorhídrico concentrado en el vaso de precipitados plástico y añádalos al vaso de precipitados de polímero fluorado inerte.Lave el vaso graduado de plástico con un total de 50 mililitros de agua, añadiendo el agua de enjuague al vaso que contiene el ácido fluorhídrico. Finalmente, lave cuidadosamente el vaso graduado con agua y deseche los lavados en un recipiente designado para residuos de ácido fluorhídrico. Corte la oblea de silicio en trocitos colocando la oblea con la cara pulida hacia arriba sobre una superficie blanda, como una servilleta.Utilizando el bolígrafo con punta de diamante, haga una pequeña muesca en la parte inferior de la oblea a lo largo del borde plano principal. Coloque un alambre pequeño, como un clip de papel, debajo de la muesca y aplique suavemente presión sobre la oblea colocando los dedos o pinzas a ambos lados de la muesca y presionando hacia abajo sobre una servilleta con un lápiz y una regla. Mida el ancho deseado de los cuadrados marcando puntos en la parte superior e inferior de la servilleta.Coloque una de las mitades del oblea con el borde primero entre las líneas medidas en la servilleta, alineada con la línea y repita el procedimiento de corte. Los trozos recién quebrados perpendicularmente ahora deben tener el ancho de los cuadrados de las estrías. Gire el oblea horizontalmente sobre la servilleta y colóquelo entre las líneas perpendiculares antes de repetir nuevamente el procedimiento de corte.Cuando la solución de RCA alcance la temperatura adecuada, sumerja de ocho a diez obleas de silicio de un centímetro por un centímetro en la solución durante 10 a 20 minutos. Utilice una canasta invertida de polímero fluorado; con un diámetro de dos pulgadas, levante la canasta que contiene las obleas de silicio y drene. Luego traslade la canasta al vaso de desecho y enjuague abundantemente con agua de 18 megacm. Sumerja la canasta de lavado y agite hacia arriba y hacia abajo durante 20 segundos.Desagüe el cesto y enjuáguelo completamente con agua sobre el vaso de desecho. Una vez completada la limpieza tras la RCA, coloque el cesto en el vaso que contiene la solución de ácido fluorhídrico durante 10 a 20 segundos. Utilice un movimiento suave hacia arriba y hacia abajo para mezclar los chips y el ácido fluorhídrico.Luego levante el cubo de inmersión para permitir que el fluoruro de hidrógeno drene completamente. Coloque el vaso de lavado y enjuague el vaso en un recipiente de plástico. Mueva la canasta sobre el vaso de enjuague y enjuague con agua de 18 megohmios por centímetro.Sumerja la cesta en el lavado, el vaso de precipitados, y agite durante 20 segundos. A continuación, realice un segundo ciclo de drenado y enjuague con agua de 18 megohmios por centímetro. Vacíe el agua de lavado en el vaso de enjuague y rellene el vaso de lavado con agua.Cuando la solución RCA dos haya alcanzado la temperatura adecuada, sumerja los chips de silicio en las soluciones utilizando la canasta. Deje los chips en la solución durante 10 a 20 minutos. Retire los chips después del tiempo apropiado y siga los mismos procedimientos de enjuague.En cuanto a RCA, guarde los chips limpios bajo agua de alta pureza en un vial limpio durante hasta tres días para la formación de una monocapa autoensamblada sobre silicio; agregue 1.980 microlitros de agua de 18 megaohmios por centímetro y 20 microlitros de apte a un vial de simulación limpio y agite suavemente para mezclar. Utilice la solución inmediatamente. Coloque un chip de silicio limpio con la cara reflectante hacia arriba en el vial de centelleo, tápelo y déjelo reposar durante 20 minutos.Retire el chip usando pinzas y enjuáguelo con 200 microlitros de agua antes de secarlo durante un minuto con un chorro de gas nitrógeno. Para depositar el origami de ADN sobre el silicio funcionalizado con la prueba APT, mezcle brevemente el vial del origami de ADN y pipetee cuatro microlitros de solución sobre el sustrato de silicio. Deje la solución en reposo durante el tiempo necesario según la concentración utilizada y la cobertura deseada.Luego, enjuague un sustrato con 100 microlitros de agua estéril de 18 megaohmios por centímetro y séquelo con flujo de nitrógeno. Durante un minuto, repita el enjuague con otros 100 microlitros de agua estéril y seque el sustrato con nitrógeno durante tres minutos. A continuación se muestran resultados representativos de la variación en la concentración de origami de ADN respecto a la cobertura del sustrato.Una mayor concentración proporciona una mayor cobertura en sustratos de mica; la cobertura de origami de ADN en mica y silicio muestra una absorción inicial alta, con saturación después de aproximadamente una hora. El porcentaje de cobertura en mica también es consistentemente más alto que el obtenido con la misma concentración y tiempo en muestras de silicio funcionalizado. El protocolo de enjuague y secado es fundamental para la preparación exitosa de muestras de origami de ADN.Un enjuague y secado inadecuados pueden provocar la presencia de islas de agregación de disolvente del ADN origami o la formación de puentes entre nanoestructuras en muestras con alta cobertura. Una vez dominadas, las técnicas de preparación del sustrato Micah pueden completarse en 20 minutos o menos. Las muestras de silicio pueden prepararse en menos de dos horas si se realizan correctamente.La litografía por haz de electrones y el levantamiento molecular pueden integrarse con este proceso para crear patrones y dispositivos novedosos para experimentos posteriores. No olvide que trabajar con ácido fluorhídrico puede ser extremadamente peligroso; tome precauciones adecuadas, como usar equipo de protección personal y tener disponibles suministros de emergencia de gluconato de calcio mientras realiza este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

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