Fluorescencia Biomembranas Fuerza Sonda: La cuantificación simultánea de Cinética-Receptor ligando y encuadernación inducida Señalización Intracelular en una sola célula

El objetivo general de este procedimiento es medir simultáneamente la similitud y la unión al receptor y observar la señalización de calcio inducida por la unión en una sola célula. Esto se logra aislando primero la biotina y ajustando la osmolaridad de los glóbulos rojos humanos o glóbulos rojos para usarlos como un transductor de fuerza ultrasensible. El segundo paso es funcionalizar las perlas de vidrio a microescala, lo que incluye la limpieza, la dilatación y el recubrimiento de ligandos.

A continuación, las células T se aíslan e incuban con el colorante de calcio a las 2:00 AM, lo que permite observar la concentración de iones de calcio intracelular. El paso final es preparar las micropipetas en la cámara experimental que se requieren especialmente para la configuración del experimento. En última instancia, la sonda de fuerza de biomembrana de fluorescencia o técnica BFP se utiliza para mostrar la adhesión de una célula a una perla recubierta de ligando, medir la cinética de unión del ligando del receptor y, mientras tanto, monitorear el nivel de calcio intracelular.

Esta técnica es útil para comprender cómo las células T detectan la fuerza mecánica a través del reconocimiento de andrógenos. Una gran ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que el FBIP puede medir simultáneamente la cinética de unión del ligando del receptor y la señalización intracelular. Las partes desafiantes de este protocolo incluyen la producción manual de micro rutas de pep de los diámetros correctos, la recogida de celdas y abejas con micro PEP y el ensamblaje de la sonda de fuerza, que puede fallar al principio, aunque no pudo estar aquí para la demostración de este video.

El coautor Arnold G, que ha completado recientemente su doctorado en mi laboratorio, ha contribuido significativamente a la validación inicial de la fabricación del protocolo FBAP. Obtener de ocho a 10 microlitros de sangre de un pinchazo en el dedo y añadir a un mililitro de bicarbonato de carbonato, tampón de chorro de salida de vórtice o pipetear la mezcla y centrifugar durante un minuto a 900 G. Desechar el sobrenadante antes de realizar el tampón de bicarbonato carbonatado. Lavar una vez más.

A continuación, mezcle 10 microlitros del paquete RBC resultante, 171 microlitros de tampón de carbonato y bicarbonato y 1049 microlitros de biotina. Solución enlazadora PEG NHS e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Utilizando los mismos procedimientos de lavado antes de lavar la mezcla de glóbulos rojos resultante, una vez con tampón de bicarbonato y luego dos veces con tampón N dos al 5%.

A continuación, diluya la nistatina en N dos 5% de tampón. Para obtener una concentración final de 40 microlitros por mililitro, mezcle cinco microlitros de glóbulos rojos biotinilados con 71,4 microlitros de solución de nistatina e incube durante una hora a cero grados centígrados. Por último, lave las muestras dos veces con tampón N dos al 5 % y almacene el RBC biotinilado con N dos tampón al 5 % más 0,5 % BSA en el frigorífico monte una pieza de micropipeta de tres pulgadas en el extractor de micropipetas.

Haga clic en el botón de extracción para que la máquina caliente el centro del capilar y el capilar se tire de los dos extremos para hacer dos capilares con puntas afiladas, que son las pipetas crudas. A continuación, monte una pipeta cruda en el soporte de pipeta de la micropipeta Forge heat para derretir la esfera de vidrio de la fragua. Inserte la punta de la pipeta cruda dentro de la esfera de vidrio.

Enfríe la esfera de vidrio y tire de la pipeta cruda para romperla desde el exterior, dejando su punta dentro de la esfera. Repita este procedimiento hasta obtener el orificio de punta deseado para construir la cámara de la celda, primero corte a 40 milímetros por 22 milímetros por 0,2 milímetros con un cortador de vidrio en dos piezas de 40 milímetros por 11 milímetros por 0,2 milímetros. La cámara de la celda está construida sobre la base de un soporte de cámara casero que consta de dos piezas de cuadrados de metal y un mango que las une.

Con pegamento de gracia, coloque un cubreobjetos en la parte inferior del soporte de la cámara de manera que haga un puente entre los dos cuadrados de metal. Del mismo modo, pegue el otro cubreobjetos a la parte superior, lo que formará una cámara de celda de cubreobjetos paralela. A continuación, utilice la pipeta para inyectar 200 microlitros de tampón experimental entre los dos cubreobjetos.

Asegúrese de que el tope se adhiera a ambos cubreobjetos. Gire y agite suavemente la cámara para permitir que el tampón toque ambos extremos de la cámara. A continuación, inyecte cuidadosamente aceite mineral en ambos lados de la cámara, flanqueando la zona de amortiguación experimental, sellando así el tampón del aire libre.

Las perlas son bcs y objetivos en las regiones superior, media e inferior de la zona de amortiguamiento, respectivamente. Para comenzar el experimento BFP, encienda el microscopio y la fuente de luz.

Coloque la cámara en la platina principal del microscopio. El siguiente paso es instalar las tres micropipetas de la BFP. La sonda de la izquierda es para agarrar un RBC.

El objetivo de la derecha es agarrar la célula y el ayudante de la parte inferior derecha sirve para agarrar una cuenta para instalar, use un microinyector para rellenar una micropipeta con tampón experimental. Retire la micropipeta del soporte de la pipeta y sujétela en un lugar más bajo para permitir que el líquido gotee de la punta. Inserte rápidamente la micropipeta en la punta del soporte, asegurándose de que no entre ninguna burbuja de aire en la micropipeta.

Durante la inserción, apriete el tornillo del soporte y, a continuación, monte cada soporte de pipeta en su micromanipulador correspondiente. Empuje la micropipeta hacia la cámara de modo que sus puntas entren en el área del tampón de la cámara. Ajuste la posición de la micropipeta y encuéntrelos bajo el campo de visión del microscopio.

Muévete por la etapa del soporte de la cámara para encontrar las colonias de los tres elementos. Uno por uno, ajuste la posición de la micropipeta correspondiente girando las perillas de los manipuladores para permitir que la punta de la micropipeta se acerque a una celda o cordón, aspire la celda o cordón. Al ajustar la presión dentro de la micropipeta correspondiente, las tres micropipetas capturarán sus elementos correspondientes.

Muévase alrededor de la etapa del soporte de la cámara para encontrar un espacio abierto lejos de las colonias de los elementos inyectados donde se realizará el experimento. Cambie el modo visual del microscopio para visualizar la imagen en el programa informático. Mueva los tres elementos de las puntas de pipeta al campo de visión del programa.

A continuación, alinee el cordón de la sonda y el RBC y maniobre con cuidado el cordón de la sonda hasta el ápice del RBC. Ahora golpee brevemente el cordón en el RBC y retírelo suavemente, ajuste la presión de la micropipeta auxiliar para soplar suavemente el cordón de modo que quede pegado al ápice del RBC. Aleje la pipeta auxiliar y alinee el objetivo y el cordón de sondeo en el programa.

En la ventana de campo de visión, utilice las herramientas del programa para medir los radios respectivos de la micropipeta de la sonda, el RBC y el área de contacto circular entre el RBC y el cordón de la sonda. Estos valores permiten la estimación de la constante de resorte del RBC mediante la ecuación enumerada en el protocolo de texto. Después de ingresar la constante de resorte RBC deseada en el programa, dibuje una línea horizontal a través del vértice RBC, lo que producirá una curva en la ventana adyacente que indica el brillo de cada píxel.

A lo largo de esta línea, arrastre la línea de umbral para que esté aproximadamente a la mitad de la profundidad de la curva. A continuación, seleccione el modo de experimento deseado, el ensayo de fluctuación térmica, el ensayo de frecuencia de adhesión o el ensayo de abrazadera de fuerza. Configure los parámetros como desee.

Haga clic en inicio, lo que permite que el programa mueva la pipeta objetivo y conduzca el objetivo dentro y fuera del contacto con la sonda, la recolección de datos se realizará en paralelo, lo que registra la posición del cordón profesional en tiempo real. Detenga el programa haciendo clic en el botón detener experimento en el que a la vez aparecerá una ventana. Para permitir el almacenamiento de los datos adquiridos para utilizar la función de fluorescencia del sistema BFP encendida la fuente de luz de excitación y la cámara de fluorescencia, que están controladas por un programa separado.

A continuación, seleccione los parámetros para las imágenes de fluorescencia, incluida la exposición a la ganancia y los canales de excitación. Siga todos los preparativos del protocolo del experimento BFP, incluida la alineación de la sonda y el objetivo para permitir la visualización de la imagen fluorescente viva de la célula objetivo que se excita con luz de excitación de 340 nanómetros o 380 nanómetros. Utilice la herramienta de sección para seccionar aproximadamente el área dentro de la cual permanecerá la celda durante todo el período de grabación.

A continuación, haga clic simultáneamente en grabar y comience a hacer clic. Record permite que una luz de 340 nanómetros y 380 nanómetros excite alternativamente la matriz de fluorescencia intracelular. Un par de imágenes de fluorescencia correspondientes se registrarán alternativamente aproximadamente una por segundo.

Al hacer clic en iniciar, comienza el experimento BFP para el análisis de la interacción molecular y el experimento de imágenes de fluorescencia para monitorear la señalización de calcio intracelular procede a analizar los datos como se describe en el protocolo de texto. En las curvas de datos brutos de fuerza de tiempo, la fuerza se deriva del seguimiento del cambio de posición del cordón profesional. En un evento de no adherencia, la fuerza volverá a cero en la señal de tiempo de inversión de fuerza después de que la celda objetivo se retraiga de la superficie del cordón.

Por el contrario, en un evento de fuerza de ruptura, la adherencia se manifestará mediante una rápida elevación de la fuerza a un nivel positivo durante la retracción, seguida de una rápida caída a cero. En un evento de vida, la fuerza positiva se sujetará para realizar una meseta. La longitud de la meseta es toda una vida.

Mediante la realización repetida de ciclos de experimentos VFP, se derivará una curva de fuerza frente al tiempo. Aquí se muestran las imágenes fluorescentes de unas pocas o dos células T cargadas tras la excitación por canales de luz de 340 nanómetros y 380 nanómetros. Ambas imágenes muestran contornos claros de la célula, lo que indica que la célula se tiñó bien Después de que los datos de cinética de unión y los datos de fluorescencia se derivaron de una célula T, tanto la curva de vida acumulativa como la curva de nivel de calcio se presentan en la misma figura para encontrar la correlación entre ellas.

Ahora debería tener una buena comprensión de cómo realizar el experimento A-F-B-I-P. Durante este procedimiento. Es importante recordar comprobar si hay algún defecto en la sonda de fuerza, como el diámetro de la micropipeta, la longitud de la proyección de la célula de goma y la posición del cordón.

Todo esto afectará la precisión de la medición de la fuerza. Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la biología mecánica estudien el mecanismo de transducción mecánica en todos los sistemas biológicos posibles.