Name: Un accidente cerebrovascular trombótico Basado En transitoria cerebral por hipoxia-isquemia Modelo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: Aprende a establecer un modelo de accidente cerebrovascular trombótico en ratones mediante hipoxia-isquemia transitoria cerebral. Evalúa los efectos protectores del tratamiento con activador tisular del plasminógeno (tPA) en la recanalización vascular y la reducción del infarto.

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Este estudio fue apoyado por la subvención de los NIH NS074559 (a C. K.). Agradecemos a todos los colaboradores que contribuyeron a nuestros artículos de investigación en los que se basa el presente informe metodológico.

Este protocolo ha sido aprobado por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad de Emory y sigue los Institutos Nacionales de la Salud Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. 1. Configuración <ol><li> Preparar el lecho quirúrgico en el cojín de calentamiento conectada con bomba de calor a 37 ° C durante al menos 15 minutos antes de la cirugía. Coloque un rollo de cuello con el cañón de 3 ml jeringa en el lecho quirúrgico. Preparar el gas de la anestesia con isoflurano 2% en el aire médica. </li><li> Preparar fórceps tratado al autoclave, tijeras, tenedores micro agujas, pinzas hemostáticas, hisopos de algodón y suturas. Preparar adhesivo tisular y ungüento para los ojos. </li><li> Configurar el sistema de hipoxia y controladores de temperatura con lámpara de calefacción y la sonda rectal. Preparar gas hipoxia con 2% de isoflurano en 7,5% de O 2 equilibrada por el 92,5% de N 2. </li><li> Una hora antes de la cirugía, los ratones se analgesized por inyección subcutánea de una liberación lenta Meloxicam (4,0 mg / kg). </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. Transient cerebral hipoxia-isquemia (Figura 1B) <ol><li> Anestesiar C57BL macho 10-13 semanas de edad / 6 ratones con un peso de 22 a 30 g en la cámara de inducción de la anestesia con isoflurano 3% hasta que el animal no responde a la compresión de los pies, y luego quitar el pelo en el cuello derecha usando una máquina de afeitar electrónica. </li><li> Coloca los ratones en el lecho quirúrgico conectado con 2% de isoflurano en el aire médica a un caudal de 2 l / min. Extremidades anteriores Secure estiradas a lo largo rollo de cuello a los lados con cinta médica. </li><li> Limpie el sitio de la cirugía para la incisión con betadine seguido por el alcohol y luego hisopos de algodón. </li><li> Bajo el microscopio de disección, hacer una incisión de 0,5 cm derecha del cuello uterino usando un fórceps rectos y un micro tijeras aproximadamente 0,2 cm lateral de la piel en la línea media. </li><li> Use un par de pinzas dentadas finas de separar la fascia y el tejido para exponer la arteria carótida común derecha (RCCA). Separar cuidadosamente el RCCA desde el nervio vagal usando un par de pinzas lisas finas. </li><li> Vivo nudo dos precortadas 5-0 sutura de seda (desmontable) del RCCA, y luego coser la piel utilizando 4-0 Nylon sutura monofilamento (Figura 1C). </li><li> Aplicar pomada ocular en ambos ojos para evitar la sequedad. </li><li> Transferir rápidamente los ratones al sistema de hipoxia y poner la nariz y la boca en la cara-máscara con 2% de isoflurano en 7,5% O 2 a un caudal de 0,5-1 L / min durante 30 min. <ol><li> Durante la hipoxia, utilizar reguladores de temperatura con lámparas de calor para controlar la temperatura rectal a 37,5 ± 0,5 ° C. Monitorear la frecuencia respiratoria en 80 a 120 respiraciones / min. El mantenimiento de la temperatura corporal por encima de 37 ° C durante la hipoxia es importante crear infarto cerebral coherente. Frecuencia respiratoria baja por lo general ocurre después de 20 min de hipoxia. Retire la mascarilla y permitir el suministro de aire normal si la frecuencia respiratoria cae por debajo de 40. Esto se lleva a 1-2 minutos y no cuenta en la duración hipoxia 30 min. </li></ol></li><li> Después de la hipoxia, transferirlos ratones a una cama quirúrgica y suelte las dos suturas de RCCA. Cierre la herida con pegamento tisular y, a continuación, volver a la jaula de los ratones. Excluir a los animales si tanto de dos nudos vivos se liberan de forma inesperada después de la hipoxia. </li><li> Monitorear los ratones para 5-10 minutos para recuperarse de la hipoxia y la anestesia. Coloque la comida humedecida en la jaula y devolverlo al centro de cuidado de los animales. Nota: Los animales que presenten leves a comportamientos en circuito severa a las 24 horas después de THI se correlacionan con infracción cerebro. La mayoría de los animales con síntomas convulsivos mueren antes de que el punto de tiempo de 24 horas después de THI. </li></ol> 3. láser Speckle de contraste de imagen Nota: Aunque este no es un procedimiento esencial del modelo THI, un láser speckle sistema de imágenes de contraste de dos dimensiones 16 puede ser utilizado para caracterizar los cambios de flujo sanguíneo cerebral (CBF) durante o después de la hipoxia transitoria-isquemia. Para documentar las alteraciones de la CBF bajo THI, ficha inmediatamente después del step 2.6. Alternativamente, para comparar la recuperación CBF después THI insulto, estos procedimientos se pueden realizar después de la etapa 2.10. <ol><li> Publicar un ratón anestesiado en decúbito prono y realizar una incisión de 1 cm de largo en el cuero cabelludo con el cráneo impresionados pero sin abrir. </li><li> Monitorear CBF en ambos hemisferios cerebrales bajo un generador de imágenes del flujo sanguíneo de acuerdo con el protocolo del fabricante y empezar a grabar el flujo sanguíneo cerebral inmediatamente después de la cirugía CCAO (paso 2.6). Continuar durante 50 minutos. </li><li> Mostrar imagen CBF con unidades arbitrarias en una paleta de 16 colores y analizar en tiempo real las regiones seleccionadas utilizando el software MoorFLPI siguiendo las instrucciones del fabricante (Figura 2). </li><li> Después de grabar la imagen CBF, cierre el cuero cabelludo con adhesivo tisular y devolver el animal a la jaula. </li></ol> 4. Administración de tPA <ol><li> Inyectar animales en la vena de la cola con el disolvente o 10 mg / kg de tPA recombinante (220-300 y# 956; l de 1 mg / m tPA) a las 0,5, 1, o 4 horas después de tCCAo más hipoxia (Figura 4). </li></ol> Detección de Daño 5. cerebro con varios diferentes opciones Nota: Para recoger muestras de cerebro, la eutanasia a los ratones a los 1, 4 ó 24 horas después de THI. <ol><li> Realizar cuantificación del volumen de infarto por in vivo cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio método (TTC) a las 24 horas después de THI insulto como se describe anterior. 17 <ol><li> Intraperitoneal inyectar animales con solución 1,4 M manitol (~ 0,1 ml / g de peso corporal) 30 minutos antes de la perfusión transcardial. Ratones perfundir transcardial con PBS seguido por 10 ml de 2% TTC. </li><li> Retire el cerebro de los animales con los instrumentos quirúrgicos después de 10 minutos y colocar en paraformaldehído al 4% para la fijación durante la noche y en la sección 1 mm de espesor con un vibratome. </li><li> Toma una serie de cuatro diapositivas cerebro seccionado por microscopio digital y quantify el volumen del infarto como la relación de la zona infartada (área blanca en el lado derecho) a la zona de la intacto, hemisferio contralateral usando el software ImageJ. </li></ol></li><li> Alternativamente, lleve a cabo la formación de trombosis por inmunofluorescencia en 1 hora después de THI insulto. <ol><li> Congelar el cerebro fija en compuesto OCT y la sección de los cerebros de 12 micras de espesor utilizando un criostato. </li><li> Incubar el portaobjetos cerebro con anticuerpo de conejo anti-fibrinógeno (1: 100) siguiendo por cabra anti-conejo Alexa 488 Fluro colorante (1: 200) para observar la fluorescencia en un microscopio fluorescente. </li></ol></li><li> Alternativamente, realice la obstrucción buque por inyección en la vena de la cola de 100 l 2% colorante azul de Evans en 4 horas después de THI insulto. <ol><li> La eutanasia a los ratones y rápidamente cortar la cabeza para eliminar cerebros en paraformaldehído al 4% después de la inyección de azul de Evans. Nota: Se necesita 5-10 min para Evans circulación azul con el color azul de tanto delanteras y traseras extremidades. </li><li> SECTIen cerebros fijos a 100 micras de espesor usando un micrótomo de deslizamiento y observar la fluorescencia utilizando un filtro de emisión de 680 nm en un microscopio fluorescente. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Broderick, J. P., Hacke, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+acute+ischemic+stroke%3A+Part+I%3A+recanalization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Treatment of acute ischemic stroke: Part I: recanalization strategies.</a> Circulation. 106 (12), 1563-1569 (2002).</li>
<li>Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+basis+of+translational+stroke+research%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological basis of translational stroke research.</a> Folia Neuropathol. 47 (3), 213-227 (2009).</li>
<li>Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+pathophysiologies+of+focal+brain+ischemia%3A+implications+for+translational+stroke+research%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (7), 1310-1316 (2012).</li>
<li>Macrae, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+stroke+research--advantages+and+disadvantages+of+the+most+common+rodent+models+of+focal+ischaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Preclinical stroke research--advantages and disadvantages of the most common rodent models of focal ischaemia.</a> Br. J. Pharmacol. 164 (4), 1062-1078 (2011).</li>
<li>Niessen, F., Hilger, T., Hoehn, M., Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+clot+preparation+determine+outcome+of+recombinant+tissue+plasminogen+activator+treatment+in+experimental+thromboembolic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Differences in clot preparation determine outcome of recombinant tissue plasminogen activator treatment in experimental thromboembolic stroke.</a> Stroke. 34 (8), 2019-2024 (2003).</li>
<li>Orset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+in+situ+thromboembolic+stroke+and+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion.</a> Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).</li>
<li>Watson, B. D., Dietrich, W. D., Prado, R., Ginsberg, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argon+laser-induced+arterial+photothrombosis.+Characterization+and+possible+application+to+therapy+of+arteriovenous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Argon laser-induced arterial photothrombosis. Characterization and possible application to therapy of arteriovenous malformations.</a> J. Neurosurgery. 66 (5), 748-754 (1987).</li>
<li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy+of+combined+tPA-edaravone+therapy+in+experimental+thrombotic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Synergy of combined tPA-edaravone therapy in experimental thrombotic stroke.</a> PLoS One. 9, e98807(2014).</li>
<li>Levine, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoxic-ischemic+encephalopathy+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Anoxic-ischemic encephalopathy in rats.</a> Am. J. Pathol. 36, 1-17 (1960).</li>
<li>Rice, J. E. 3rd, Vannucci, R. C., Brierley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+immaturity+on+hypoxic-ischemic+brain+damage+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+Neurol%22%5BJournal%5D)">The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat.</a> Annals Neurol. 9 (2), 131-141 (1981).</li>
<li>Vannucci, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+stroke+in+the+female+diabetic%2C+db%2Fdb%2C+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Experimental stroke in the female diabetic, db/db, mouse.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 21 (2), 52-60 (2001).</li>
<li>Adhami, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+ischemia-hypoxia+induces+intravascular+coagulation+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cerebral ischemia-hypoxia induces intravascular coagulation and autophagy.</a> Am. J. Pathol. 169 (2), 566-583 (2006).</li>
<li>Shereen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+diffusion+tensor+imaging+and+neuropathological+correlation+in+a+murine+model+of+hypoxia-ischemia-induced+thrombotic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Ex vivo diffusion tensor imaging and neuropathological correlation in a murine model of hypoxia-ischemia-induced thrombotic stroke.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31 (4), 1155-1169 (2011).</li>
<li>Michaud, J. P., Pimentel-Coelho, P. M., Tremblay, Y., Rivest, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+Ly6C+low+monocytes+after+cerebral+hypoxia-ischemia+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">The impact of Ly6C low monocytes after cerebral hypoxia-ischemia in adult mice.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 34 (7), e1-e9 (2014).</li>
<li>Zoppo, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virchow%27s+triad%3A+the+vascular+basis+of+cerebral+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Neurol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Virchow's triad: the vascular basis of cerebral injury.</a> Rev. Neurol. Dis. 5, 12-21 (2008).</li>
<li>Dunn, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+speckle+contrast+imaging+of+cerebral+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Laser speckle contrast imaging of cerebral blood flow.</a> Annals Biomed. Eng. 40 (2), 367-377 (2012).</li>
<li>Sun, Y. Y., Yang, D., Kuan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mannitol-facilitated+perfusion+staining+with+2%2C3%2C5-triphenyltetrazolium+chloride+%28TTC%29+for+detection+of+experimental+cerebral+infarction+and+biochemical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Mannitol-facilitated perfusion staining with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) for detection of experimental cerebral infarction and biochemical analysis.</a> J. Neurosci. Methods. 203 (1), 122-129 (2012).</li>
<li>Lozano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+regional+mortality+from+235+causes+of+death+for+20+age+groups+in+1990+and+2010%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2010).</li>
<li>Murray, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disability-adjusted+life+years+%28DALYs%29+for+291+diseases+and+injuries+in+21+regions%2C+1990-2010%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> Lancet. 380 (9859), 2197-2223 (2012).</li>
<li>Dirnagl, U., Macleod, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroke+research+at+a+road+block%3A+the+streets+from+adversity+should+be+paved+with+meta-analysis+and+good+laboratory+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Stroke research at a road block: the streets from adversity should be paved with meta-analysis and good laboratory practice.</a> Br. J. Pharm. 157 (7), 1154-1156 (2009).</li>
<li>Dirnagl, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+concerted+appeal+for+international+cooperation+in+preclinical+stroke+research%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research.</a> Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).</li>
<li>Khatri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revascularization+end+points+in+stroke+interventional+trials%3A+recanalization+versus+reperfusion+in+IMS-I%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Revascularization end points in stroke interventional trials: recanalization versus reperfusion in IMS-I.</a> Stroke. 36 (11), 2400-2403 (2005).</li>
<li>Rosenberg, R. D., Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular-bed--specific+hemostasis+and+hypercoagulable+states%5BTitle%5D)+AND+%22New+Eng.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Vascular-bed--specific hemostasis and hypercoagulable states.</a> New Eng. J. Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).</li>
<li>Majid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+vulnerability+to+permanent+focal+cerebral+ischemia+among+3+common+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains.</a> Stroke. 31 (11), 2707-2714 (2000).</li>
</ol>

El ictus es un problema de salud importante de creciente importancia para cualquier sociedad con una población que envejece. A nivel mundial, el accidente cerebrovascular es la segunda causa principal de la muerte con un estimado de 5.9 millones de eventos fatales en 2010, lo que equivale al 11,1% de todas las muertes 18. El accidente cerebrovascular es también la tercera causa de discapacidad años de vida ajustados (AVAD) perdidos a nivel mundial en 2010, pasando de la quinta posición en 1990 19. ...

Trombolisis y recanalización es la terapia más eficaz de accidente cerebrovascular isquémico agudo en la práctica clínica 1. Sin embargo, la mayoría de la investigación preclínica neuroprotección se realizó en un modelo transitorio mecánico obstrucción (oclusión de la arteria cerebral media de sutura intraluminal) que produce la rápida recuperación del flujo sanguíneo cerebral después de la retirada de la oclusión vascular y muestra poco a ningún beneficio por tPA trombólisis. Se ha sugerido que la dudosa elección de los modelos de accidente cerebrovascular contribuyó, al menos en parte, a la dificultad en la traducción de la terapia neuroprotectora a los pacientes 2,3. Por lo tanto, hay una demanda creciente para el empleo de modelos de ictus tromboembólico tPA-respuesta en la investigación preclínica, pero estos modelos también tienen problemas técnicos (ver Discusión) 4-7. Aquí se describe un nuevo modelo basado en accidente cerebrovascular trombótico (THI) unilateral insulto hipóxico-isquémico transitorio y sus respuestas a la terapia intravenosa tPA 8. El modelo de carrera THI fue desarrollado sobre la base del procedimiento de Levine (ligadura permanente de la arteria carótida común unilateral seguido por la exposición a la hipoxia transitoria en una cámara) que se inventó para los experimentos con ratas adultas en 1960 9. El procedimiento original Levine desvaneció en la oscuridad, porque sólo produce daño cerebral variable, pero el mismo insulto causado neuropatología consistente en crías de roedores cuando fue reintroducido por Roberto Vannucci y sus colegas como un modelo de neonatal encefalopatía hipóxico-isquémica (EHI) en 1981 10. En los últimos años, algunos investigadores re-adaptar el modelo Levine-Vannucci a ratones adultos mediante el ajuste de la temperatura en la cámara hipóxica 11. Es plausible que las lesiones cerebrales inconsistentes en el procedimiento original Levine pueden surgir de la fluctuación de las temperaturas corporales de roedores adultos en la cámara hipóxica. Para probar esta hipótesis, hemos modificado el procedimiento Levine mediante la administración de gas hipóxicoa través de una mascarilla, mientras se mantiene la temperatura del núcleo de roedores a 37 ° C sobre la mesa quirúrgica 12. Como era de esperar, el control estricto de la temperatura corporal aumenta considerablemente la reproducibilidad de la patología cerebral inducida por HI. El insulto HI también provoca la coagulación, la autofagia y grises y lesiones 13 la sustancia blanca. Otros investigadores también han utilizado el modelo HI para investigar después del accidente cerebrovascular respuestas inflamatorias 14. Una característica única del modelo de accidente cerebrovascular HI es que sigue de cerca la tríada de la Virchow de la formación de trombos, incluida la estasis del flujo de sangre, lesión endotelial (por ejemplo, debido al estrés oxidativo inducido-HI), y la hipercoagulabilidad (activación de las plaquetas HI inducida) ( Figura 1 A) 15. Como tal, el modelo HI puede capturar algunos mecanismos fisiopatológicos relacionados con el accidente cerebrovascular isquémico en el mundo real. Con esta idea en mente, hemos perfeccionado aún más el modelo HI con ligadura reversible de la ONUarteria carótida común ilateral (por lo tanto, para crear un insulto HI transitorio), y se ensayó sus respuestas a tPA trombolisis con o sin edavarona. Edaravona es un eliminador de radicales libres ya aprobado en Japón para tratar el ictus isquémico dentro de las 24 horas de aparición 9. Nuestros experimentos mostraron que lo más breve 30 min transitoria HI desencadena el infarto trombótico, y que combinado tratamiento con tPA-edaravona confiere beneficios sinérgicos 8. Aquí se describen los procedimientos quirúrgicos detalladas y consideraciones metodológicas del modelo de THI, que pueden ser utilizados para optimizar los tratamientos de reperfusión de accidente cerebrovascular isquémico agudo.

<table><tbody><tr><td>ratones machos adultos</td><td>Charles River</td><td>C57BL/6&nbsp;</td><td>10-13 semanas de edad (22-30 g)</td></tr><tr><td>sistema móvil de anestesia para animales de laboratorio</td><td>VetEquip</td><td></td><td>901807 anestesia</td></tr><tr><td>Tanque de aire medicinal (comprimido)</td><td>Airgas</td><td>UN1002</td><td>anestesia</td></tr><tr><td>isoflurano</td><td>Piramal Healthcare</td><td>NDC 66794-013-25</td><td>anestesia</td></tr><tr><td>Multi-Station Lab Animal AnesthesiaSystem</td><td>Surgive</td><td>V703501</td> t <td>Sistema</td></tr> <tr><td>de hipoxia7,5% O2 equilibrado por un tanque de N2</td><td>Airgas</td><td>Sistema de hipoxia</td><td>UN1956</td></tr><tr><td>Controlador de temperatura con lámpara de calefacción&nbsp;</td><td>Cole Parmer&nbsp;</td><td>Controladores de temperatura EW-89000-10</td><td></td></tr><tr><td>Sonda rectal</td><td>Cole Parmer&nbsp;</td><td>NCI-00141PG Controladores de</td><td>temperatura</td></tr><tr><td>Microscopio de disección&nbsp;</td><td>Olimpo&nbsp;</td><td>Configuración quirúrgica</td> <td>SZ40</td></tr><tr><td>Bomba de calor con almohadilla térmica</td><td>Gaymar&nbsp;</td><td>Configuración quirúrgica TP700</td><td></td></tr><tr><td>Pinza curvada fina (dentada)</td><td>FST</td><td>11370-31</td><td>instrumental quirúrgico</td></tr><tr><td>Pinza curva fina (lisa)</td><td>FST</td><td>11373-12</td><td>instrumental quirúrgico</td></tr><tr><td>microtijeras</td><td>FST</td><td>15000-03</td><td>instrumental quirúrgico</td></tr><tr><td>microportaagujas</td><td>FST</td><td>12060-01</td><td>instrumental quirúrgico</td></tr><tr><td>Halsted-Mosquito hemostáticos</td><td>FST</td><td>13008-12</td><td>instrumental quirúrgico</td></tr><tr><td>5-0 sutura de seda&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus</td><td>624143</td><td>suministros quirúrgicos</td></tr><tr><td>4-0 Sutura de monofilamento de nailon</td><td>LOOK</td><td>766B</td> suministros <td>quirúrgicos</td></tr><tr><td>Pegamento para tejidos</td><td>Abbott Laboratories</td><td>NC9855218</td><td>suministros quirúrgicos</td></tr><tr><td>Puralube Vet ungüento</td><td>Fisher</td><td>NC0138063&nbsp;</td><td>prevención de la sequedad ocular&nbsp;</td></tr><tr><td>Generador de imágenes de flujo sanguíneo MoorFLPI-2</td><td>Fuente láser Moor</td><td>780-nm Laser</td><td>Speckle Contrast Imaging</td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td>in vivo TTC</td></tr><tr><td>Cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T8877</td><td>in vivo TTC</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Stoelting</td><td>51425</td><td>sección de cerebro para in vivo TTC&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscopio digital</td><td>Dino-Lite</td><td>AM2111</td><td>de imágenes de todo el cerebro</td></tr><tr><td>compuesto O.C.T</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>cabra anti-conejo Alexa Fluro 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>Inmunohistoquímica</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Vibratome</td><td>ultrapro 5000</td><td>sección cerebral para IHC</td></tr><tr><td>Evans azul</td><td>Sigma</td><td>E2129</td><td>Detección vascular </td></tr><tr><td>micrótomo</td> de perfusión <td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>5000</td><td>sección del cerebro para histología</td></tr><tr><td>Avertin (2, 2, 2-tribromoetanol)</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td>eutanasia</td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente</td><td>Olympus</td><td>DP73</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam SR</td><td>ZooPharm</td><td></td><td>Analgesia AINE</td></tr></tbody></table>

un accidente cerebrovascular trombótico basado en transitoria cerebral por hipoxia-isquemia modelo

A Thrombotic Stroke Model Based On Transient Cerebral Hypoxia-ischemia

Investigación Stroke ha sufrido muchos reveses en la traducción de las terapias neuroprotectoras en la práctica clínica. En contraste, la terapia del mundo real (tPA trombolisis) rara vez produce beneficios en modelos experimentales basados ​​en la oclusión mecánica, que dominan la investigación preclínica derrame cerebral. Esta división entre el banco y la cabecera sugiere la necesidad de emplear modelos tPA-sensibles en la investigación preclínica derrame cerebral. Para este fin, un modelo de accidente cerebrovascular trombótico simple y tPA-reactiva se inventó y se describe aquí. Este modelo consiste en la oclusión transitoria de la arteria carótida común unilateral y la entrega de 7,5% de oxígeno a través de una máscara facial en ratones adultos durante 30 min, manteniendo la temperatura rectal de los animales a 37,5 ± 0,5 ° C. Aunque la ligadura reversible de la arteria carótida unilateral o hipoxia cada suprime el flujo sanguíneo cerebral sólo transitoriamente, la combinación de ambos insultos causada duradera déficit de reperfusión, la fibrina y la deposición de plaquetas, y gran INFARct en el territorio de la arteria cerebral media suministrado. Es importante destacar que la cola de la vena inyección de tPA recombinante en 0,5, 1, o 4 horas después de la THI (10 mg / kg) proporcionó una reducción dependiente del tiempo de la tasa de mortalidad y el tamaño del infarto. Este nuevo modelo de accidente cerebrovascular es simple y puede ser estandarizado a través de laboratorios para comparar los resultados experimentales. Además, se induce la trombosis sin craniectomía o introducir émbolos preformadas. Teniendo en cuenta estas ventajas únicas, el modelo THI es una adición útil al repertorio de la investigación preclínica derrame cerebral.

Bidimensional de imágenes de contraste de moteado de láser (LSCI) 16 se utilizó para comparar las alteraciones del flujo sanguíneo cerebral (CBF) por la oclusión transitoria de la carótida 30 min unilateral (tCCAO), la exposición 30 min a la hipoxia (7,5% de oxígeno), y 30 min unilateral carotídea ligadura en condiciones de hipoxia (THI). Este experimento reveló que tCCAO bajo normoxia suprimió la CBF en el hemisferio carótida se ligó a ~ 50% del valor de línea de base, que se recuperó rápidamente a por encim...

Los modelos de ictus tromboembólicos son herramientas vitales para optimizar la terapia de recanalización. Presentamos un modelo murino de ictus trombótico basado en el insulto hipóxico-isquémico cerebral transitorio (tHI), que desencadena trombosis e infarto, y responde favorablemente a la fibrinólisis mediada por el activador tisular del plasminógeno (tPA) en una ventana terapéutica similar a la de los pacientes con ictus.

Un accidente cerebrovascular trombótico Basado En transitoria cerebral por hipoxia-isquemia Modelo

Stroke research has endured many setbacks in translating neuroprotective therapies into clinical practice. In contrast, the real-world therapy (tPA ...

El objetivo general de este procedimiento es establecer un modelo sencillo de accidente cerebrovascular trombótico con una infusión cerebral estable y evaluar los efectos protectores de la terapia con activador tisular del plasminógeno, o TPA. Primero, se demuestra la inducción de hipoxia-isquemia cerebral transitoria o THI mediante la doble ligadura de la arteria carótida común derecha o RCCA y la exposición del animal ligado a condiciones hipóxicas para inducir la trombosis. Después de 30 minutos de condición hipóxica, se sueltan los dos nudos en la arteria carótida.En el paso final, se muestra la administración y evaluación de los efectos de la terapia con TPA. Alternativamente, se puede investigar el registro en tiempo real del flujo sanguíneo cerebral, la formación del trombo y el grado de obstrucción del vaso. Este modelo puede inducir un accidente cerebrovascular trombót游戏副本 y recuperarse utilizando su propio sistema de coagulación en ratones adultos.Deseamos utilizar este modelo para estudiar cómo el cerebro regula su propio flujo sanguíneo bajo condiciones de isquemia hipóxica. También lo utilizamos para investigar cómo podemos mejorar la terapia trombolítica. La demostración visual de este método es fundamental, ya que puede ser difícil mantener la temperatura corporal adecuada y una respiración estable durante la infección cerebral.Pasos de inducción Al menos 15 minutos antes de comenzar el procedimiento. Coloque la camilla quirúrgica sobre una almohadilla térmica, ajústela a 37 grados Celsius y coloque un rodillo cervical hecho con el cilindro de una jeringa de tres mililitros sobre la camilla. Configure el sistema de hipoxia para suministrar 2% de isoflurano en 7,5% de oxígeno equilibrado con 92,5% de nitrógeno, y ajuste los controladores de temperatura.Coloque un ratón macho C57 black six de 10 a 13 semanas de edad y de 22 a 30 gramos sobre la camilla quirúrgica. Tras confirmar la anestesia mediante el pellizco en la pata, aplique pomada en los ojos del animal. Extienda las cuatro extremidades a lo largo del cuello, enróllelas y sujételas con cinta médica.Luego, utilizando una crema depilatoria, elimine el vello del cuello del animal y limpie el sitio quirúrgico. A continuación, coloque la camilla quirúrgica bajo un microscopio de disección y realice una incisión cervical derecha de 0,5 centímetros en la piel a lo largo de la línea media. Con un par de pinzas finas, separe la tráquea y el músculo para exponer la arteria carótida común derecha y coloque dos suturas de seda número 5 previamente cortadas debajo de la arteria.Tenga cuidado de separar la arteria carótida del nervio vago en vivo, no dos ligaduras de seda 5-0 previamente cortadas y sueltas en la ACCD. Luego use suturas de nylon monofilamento 4-0 para cerrar la piel y transfiera rápidamente al ratón al sistema de hipoxia. Coloque la mascarilla facial sobre la nariz y la boca del animal y una sonda rectal para mantener una temperatura corporal de 37,5 grados Celsius durante toda la administración de hipoxia.Ajuste las lámparas de calor después de 30 minutos. Devuelva el ratón a la camilla quirúrgica y suelte los dos puntos de sutura. A continuación, cierre la herida con adhesivo tisular y devuelva el ratón a su jaula, vigilando al animal hasta que se recupere completamente.Alternativamente, la imagen de contraste de moteado láser puede utilizarse para examinar el flujo sanguíneo cerebral durante y después de la hipoxia isquémica. Coloque al animal en posición prona. A continuación, abra el cuero cabelludo con una incisión media de un centímetro de longitud para exponer, pero no abrir, el cráneo.Luego, transfiera inmediatamente el animal al dispositivo de imagen de flujo sanguíneo e inicie el registro del flujo sanguíneo cerebral. Visualice las imágenes del flujo sanguíneo cerebral según las instrucciones del fabricante utilizando el software FLPI para analizar las regiones seleccionadas en tiempo real. Para evaluar los efectos de la terapia con TPA, inyecte a los animales por vía intravenosa en la vena de la cola en el momento adecuado, tras la oclusión carotídea unilateral transitoria y la hipoxia.Luego, cuantifique el volumen del infarto mediante TTC in vivo 24 horas después de la isquemia hipóxica cerebral transitoria. Al día siguiente, utilice un vibromicrotomo para obtener secciones de un milímetro de grosor. Finalmente, obtenga una serie de cuatro imágenes cerebrales seccionadas mediante microscopía digital y use el software de imagen adecuado para cuantificar el volumen del infarto como la relación entre el área blanca infartada y el área del hemisferio contralateral no dañado.Lejos de este procedimiento, otros métodos de trombólisis pueden utilizarse para evaluar sus efectos y potencial clínico. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del accidente cerebrovascular isquémico exploraran la terapia trombolítica en el cerebro.

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El modelo de rata postnatal para la lesión cerebral hipóxico-isquémica es un modelo bien establecido de los derechos humanos neonatal encefalopatía hipóxica isquémica (EHI). En este artículo se describe el modelo de HIE en crías de ratas post-natal.

El modelo de encefalopatía isquémica hipóxica de la isquemia perinatal

Este video muestra el procedimiento de replicar un accidente cerebrovascular trombótico en un modelo de ratón mediante el bloqueo de la arteria carótida común derecha y la exposición del ratón a un entorno con poco oxígeno. Este proceso reduce el flujo de sangre y oxígeno al cerebro, lo que provoca la formación de coágulos sanguíneos y daño cerebral.

Inducción de accidente cerebrovascular trombótico a través de hipoxia e isquemia en un modelo de ratón

Photothrombosis es una técnica rápida, mínimamente invasivo para la inducción de infarto pequeño y bien delimitado en áreas de interés de una manera altamente reproducible. Es especialmente adecuado para el estudio de las respuestas celulares y moleculares que subyacen a la plasticidad cerebral en ratones transgénicos.

Isquemia photothrombotic: Un modelo de lesión cortical fotoquímico mínimamente invasiva y reproducible de Estudios Carrera Ratón

Varios modelos murinos de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) son ampliamente utilizados en la investigación experimental cerebro. Aquí, nos demuestran el modelo de transcraneal permanente MCAO distal que produce infarto cortical consistente de un tamaño correspondiente a los daños impuesta por la mayoría de los accidentes cerebrovasculares isquémicos humanos.

Carrera Modelado en ratones: Coagulación permanente de la arteria cerebral media Distal

El accidente cerebrovascular neonatal es una causa significativa de lesión cerebral temprana que requiere un modelo traslacional con patrones de lesión focal consistentes y alta reproducibilidad para permitir el estudio. Este estudio describe el procedimiento quirúrgico detallado para crear una lesión focal no hemorrágica, unilateral por isquemia-reperfusión en roedores equivalentes a término.

Transitoria de la arteria cerebral media oclusión Modelo de accidente cerebrovascular neonatal en ratas P10

Aquí se describe el modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico, donde se produce un accidente cerebrovascular a través del cráneo intacto mediante la inducción de la oclusión microvascular permanente utilizando iluminación láser después de la administración de un tinte fotosensible.

Modelado de accidente cerebrovascular en ratones: lesiones corticales focales por fototrombosis

Diferentes modelos de oclusión de la arteria cerebral media (MCAo) se utilizan en la investigación experimental del accidente cerebrovascular. Aquí, se describe un modelo experimental de accidente cerebrovascular de MCAo transitorio a través de la arteria carótida externa (ECA), que tiene como objetivo imitar el accidente cerebrovascular humano, en el que el trombo cerebrovascular se elimina debido a la lisis o terapia espontánea del coágulo.

Modelado del accidente cerebrovascular en ratones: oclusión transitoria de la arteria cerebral media a través de la arteria carótida externa

Este protocolo describe el modelo de isquemia cerebral focal transitoria en ratones a través de la oclusión intraluminal de la arteria cerebral media. Además, se muestran ejemplos de evaluación de resultados mediante resonancia magnética y pruebas de comportamiento.

Modelo de oclusión transitoria de la arteria cerebral media de accidente cerebrovascular

En este trabajo, presentamos un protocolo para establecer un modelo de oclusión distal de la arteria cerebral media (dMCAO) mediante electrocoagulación transcraneal en ratones C57BL/6J y evaluamos el comportamiento neurológico y las características histopatológicas posteriores.

Inducción de ictus isquémico agudo en ratones mediante la técnica de oclusión de la arteria media distal

Este estudio presenta un protocolo para establecer un modelo animal altamente reproducible de transformación hemorrágica (HTA) utilizando la oclusión/reperfusión de la arteria cerebral media (MCAO/R) en ratones C57BL/6 con hiperglucemia aguda.

Un modelo murino de transformación hemorrágica inducida por hiperglucemia aguda combinada con isquemia focal transitoria

Aprende a establecer un modelo de accidente cerebrovascular trombótico en ratones mediante hipoxia-isquemia transitoria cerebral. Evalúa los efectos protectores del tratamiento con activador tisular del plasminógeno (tPA) en la recanalización vascular y la reducción del infarto.

Un accidente cerebrovascular trombótico Basado En transitoria cerebral por hipoxia-isquemia Modelo

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