Diseño personalizado basado en láser máquinas de calentamiento para lanzamiento disparada de cisplatino de termosensible liposomas con Resonancia Magnética Orientación Imagen

El objetivo general de este procedimiento es demostrar el funcionamiento de un aparato de calentamiento basado en láser hecho a medida que se puede utilizar para calentar tumores subcutáneos localmente para la administración de una formulación de liposomas activados por calor. Esto se logra preparando primero la formulación de HTLC a través de la formación de una película lipídica, la extrusión de hidratación y la diálisis. En el segundo paso, se inocula células de carcinoma cervical a un ratón donante.

Después de cuatro o cinco semanas, el tumor se extirpa, se corta en fragmentos y se implanta individualmente en un ratón receptor. En el paso final, el tumor de ratón receptor se calienta localmente a 42 grados Celsius utilizando el sistema de calentamiento basado en láser. El aparato de calentamiento basado en láser es compatible con MR, lo que permite el monitoreo de los cambios en la temperatura del tejido durante la administración de luz, y un pequeño y portátil que permite un calentamiento simple y efectivo del tumor en el orificio del animal pequeño MR.

En última instancia, la liberación activada por calor del HTLC termosensible se puede monitorear mediante imágenes de resonancia magnética en tiempo real. Las principales ventajas de esta técnica sobre el método existente, como el uso de un baño de agua y un catéter de calentamiento, es que nuestra técnica proporciona un método conforme para administrar calor al tumor dentro de uno o dos minutos después de iniciar el tratamiento térmico y permite el ajuste en tiempo real de la potencia del láser minimizando las fluctuaciones de temperatura durante el procedimiento. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando comenzamos a realizar estudios in vivo con nuestra formulación de liposomas termosensibles HTLC.

Descubrimos que los métodos existentes no eran capaces de proporcionar de manera eficiente el calentamiento local de un tumor subcutáneo. Los procedimientos de preparación de liposomas serán demostrados por myung, un estudiante de doctorado de mi laboratorio. Para preparar los liposomas, comience combinando una mezcla de lípidos recién preparada con una mezcla de fármacos lipídicos recién preparada, seguida de una hidratación de una hora con vórtice cada 15 a 20 minutos mientras la mezcla de lípidos se hidrata. Ensamble la extrusora de 10 mililitros con dos pilas de filtros de policarbonato de 200 nanómetros del barril térmico de la extrusora a un baño de agua circulante configurado a 70 grados Celsius, y conecte el dispositivo a un tanque de nitrógeno comprimido.

Inmediatamente después de la hidratación, transfiera los lípidos a la cámara de extrusión y abra el flujo de nitrógeno. Luego, a una presión de 200 PSI, extruya los liposomas a través de las membranas, recogiendo los liposomas en un tubo cónico de 50 mililitros colocado en el baño de agua a 70 grados Celsius. Después de extruir los liposomas cinco veces, desmonte el dispositivo y vuelva a montarlo con dos pilas de filtros de policarbonato de 100 nanómetros.

Ajuste la presión a 400 PSI y extruya los liposomas 10 veces como se acaba de demostrar. La recolección de los liposomas de la extrusión final en un tubo cónico de 15 mililitros permite que los liposomas se enfríen a temperatura ambiente, seguido de la precipitación del cisplatino insoluble por centrifugación, luego dialice los liposomas durante la noche contra solución salina al 0,9% en un tubo de diálisis con un corte de 15.000 pesos moleculares en condiciones estériles. Para implantar el tumor de cuello uterino, se recolectaron 180 células de un cultivo confluente al 90% y se contó el número de células viables de carcinoma de cuello uterino por hemo.

A continuación, el citómetro diluye las células a una por 10 a las seis por 180 células por 100 microlitros. Todo el trabajo con animales se realizó en el Centro de Innovación Star, inocular ratones hembra mediante inyección intramuscular en el músculo gástrico de la extremidad posterior utilizando calibradores, midió el tamaño del tumor resultante hasta que los tumores alcanzaron de nueve a 12 milímetros en su dimensión más larga. A continuación, extirpar el tumor del ratón donante y picarlo en fragmentos de dos o tres milímetros cúbicos.

Ahora afeite la extremidad trasera izquierda del animal receptor y haga una incisión en la piel desnuda. Inserte una pieza del tumor donante por vía subcutánea a través de la incisión y use uno o dos clips para heridas para cerrar la piel de tres a cinco días después de la implantación. Retire las pinzas y deje que el tumor crezca durante dos o tres semanas para realizar el tratamiento térmico.

Primero, conecte un extremo de una fibra láser al dispositivo láser y el otro extremo al iluminador. A continuación, se inserta un catéter de inyección de calibre 27 en la vena lateral de la cola de un ratón receptor anestesiado, seguido de la inserción de un catéter de calibre 22 en el centro del tumor. Luego, coloque una sonda de temperatura de fibra óptica en el catéter hueco para monitorear cualquier cambio de temperatura y cubrir todo el tumor con el iluminador. Final.

Ajuste la potencia a 0,8 a un vatio, luego encienda el láser y espere a que la temperatura aumente ajustando manualmente la potencia del láser durante todo el tratamiento entre 0,1 y 0,8 vatios para mantener la temperatura del tumor a 42 grados Celsius como se ilustra en esta imagen de una sección transversal a través de un tumor tratado térmicamente. Suponiendo una potencia total de un vatio, la tasa de fluencia máxima en cualquier punto del tumor es de 70 milivatios por centímetro cuadrado con la tasa de fluencia en el tumor a la profundidad de la piel, midiendo el 50% de la tasa de fluencia máxima, según lo confirmado por el cambio de frecuencia de resonancia de protones al calentamiento por termometría de resonancia magnética. El uso de la configuración de calefacción basada en láser genera un mapa de distribución de temperatura relativamente uniforme que se muestra en la imagen que rastrea el cambio de temperatura relativa a partir de una medición de referencia absoluta adquirida antes del calentamiento por la fuente puntual. El tumor calentado muestra el mayor aumento relativo de la señal en comparación con el músculo turt no calentado después de la administración de gad HTLC según lo determinado por el análisis de señal de resonancia magnética, manteniendo la señal hasta el final del período de calentamiento Una vez dominada, esta técnica se puede configurar en menos de 15 minutos si se realiza correctamente, proporcionando una herramienta valiosa para la evaluación preclínica de formulaciones de liposomas termosensibles.

No olvide que trabajar con un láser de clase cuatro puede ser extremadamente peligroso, y que siempre se deben tomar precauciones como el uso de gafas de seguridad al realizar este procedimiento.