Diseño personalizado basado en láser máquinas de calentamiento para lanzamiento disparada de cisplatino de termosensible liposomas con Resonancia Magnética Orientación Imagen

El objetivo general de este procedimiento es demostrar el funcionamiento de un aparato personalizado de calentamiento basado en láser, que puede utilizarse para calentar localmente tumores subcutáneos con el fin de administrar una formulación de liposomas activada por calor. Esto se logra primero preparando la formulación HTLC mediante la formación de una película lipídica, hidratación por extrusión y diálisis. En el segundo paso, se inocula un ratón donante con células de carcinoma cervical.

Después de cuatro a cinco semanas, el tumor se extirpa, se corta en fragmentos y se implanta individualmente en un ratón receptor. En el último paso, el tumor del ratón receptor se calienta localmente a 42 grados Celsius utilizando el sistema de calentamiento basado en láser. El aparato de calentamiento basado en láser es compatible con RM, lo que permite monitorear los cambios en la temperatura del tejido durante la administración de luz, y es pequeño y portátil, lo que permite un calentamiento sencillo y eficaz del tumor dentro del orificio del escáner de RM para animales pequeños.

En última instancia, la liberación activada por calor del HTLC termosensible se puede monitorear mediante imágenes por resonancia magnética en tiempo real. Las principales ventajas de esta técnica frente a los métodos existentes, como el uso de un baño de agua y un catéter de calentamiento, son que nuestro método proporciona un enfoque conformal para entregar calor al tumor en uno o dos minutos tras iniciar el tratamiento térmico y permite ajustar en tiempo real la potencia del láser, minimizando así las fluctuaciones de temperatura durante el procedimiento. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando comenzamos a realizar estudios in vivo con nuestra formulación de liposomas termosensibles HTLC.

Descubrimos que los métodos existentes no eran capaces de proporcionar de forma eficiente un calentamiento localizado de un tumor subcutáneo. El procedimiento de preparación de liposomas será demostrado por Myung, un estudiante de doctorado de mi laboratorio. Para preparar los liposomas, comience combinando la mezcla de lípidos recién preparada con la mezcla de fármaco-lípido recién preparada, seguido de una hidratación de una hora con vortex cada 15 a 20 minutos mientras la mezcla de lípidos se hidrata. Monte el extrusor de 10 mililitros con dos pilas de filtros de policarbonato de 200 nanómetros, coloque el cilindro térmico del extrusor en un baño de agua circulante ajustado a 70 grados Celsius y conecte el dispositivo a un tanque de nitrógeno comprimido.

Inmediatamente después de la hidratación, transfiera los lípidos a la cámara del extrusor y abra el flujo de nitrógeno. Luego, a una presión de 200 PSI, extruya los liposomas a través de las membranas, recolectando los liposomas en un tubo cónico de 50 mililitros colocado en un baño de agua a 70 grados Celsius. Después de extruir los liposomas cinco veces, desarme el dispositivo y vuélvalo a armar con dos pilas de filtros de policarbonato de 100 nanómetros.

Establezca la presión a 400 PSI y extruya los liposomas 10 veces tal como se acaba de demostrar. Recolectar los liposomas de la extrusión final en un tubo cónico de 15 mililitros permite que los liposomas se enfríen a temperatura ambiente, seguido por la precipitación del cisplatino insoluble mediante centrifugación, luego diализar los liposomas durante la noche frente a solución salina al 0,9 % en tubos de diálisis con un corte de peso molecular de 15 000 bajo condiciones estériles. Para implantar el xenoinjerto de tumor cervical, recolecte 180 células de una cultura confluente al 90 % y cuente el número de células viables de carcinoma cervical mediante hemo.

Citómetro, luego diluya las células a una concentración de 1 × 10⁶ células por 100 microlitros. Todos los experimentos con animales se realizaron en el Centro de Innovación Star; inocule ratones hembra skit mediante inyección intramuscular en el músculo gastrocnemio de la extremidad trasera utilizando un calibrador, y mida el tamaño del tumor resultante hasta que los tumores alcancen de 9 a 12 milímetros en su dimensión más larga. A continuación, extirpe el tumor del ratón donante y córtelo en fragmentos de dos a tres milímetros cúbicos.

Ahora afeite la extremidad trasera izquierda del animal receptor y haga una incisión en la piel desnuda. Introduzca un fragmento del tumor donante por vía subcutánea a través de la incisión y utilice de uno a dos clips quirúrgicos para cerrar la piel tres a cinco días después del implante. Retire los clips y permita que el tumor crezca durante dos o tres semanas antes de realizar el tratamiento térmico.

Primero, conecte un extremo de una fibra láser al dispositivo láser y el otro extremo al iluminador. A continuación, inserte un catéter de inyección de 27 gauge en la vena caudal lateral de un ratón receptor anestesiado, seguido por la inserción de un catéter de 22 gauge en el centro del tumor. Luego, coloque una sonda óptica de temperatura en el catéter hueco para monitorear cualquier cambio de temperatura y cubra todo el tumor con el iluminador. Final.

Establezca la potencia entre 0,8 y un vatio, luego encienda el láser y espere a que la temperatura aumente, ajustando manualmente la potencia del láser durante todo el tratamiento entre 0,1 y 0,8 vatios para mantener la temperatura del tumor a 42 grados Celsius, como se ilustra en esta imagen de una sección transversal de un tumor tratado térmicamente. Suponiendo una potencia total de un vatio, la tasa de fluencia máxima en cualquier punto del tumor es de 70 milivatios por centímetro cuadrado, con la tasa de fluencia en el tumor a la profundidad de la piel, midiendo el 50 % de la tasa de fluencia máxima, tal como se confirmó mediante el desplazamiento de la frecuencia de resonancia del protón en la termometría por resonancia magnética durante el calentamiento. El uso del sistema de calentamiento basado en láser genera un mapa de distribución de temperatura relativamente uniforme, mostrado en la imagen, que registra el cambio de temperatura relativo a partir de una medición absoluta de referencia adquirida antes del calentamiento mediante la fuente puntual. El tumor calentado muestra el mayor aumento de señal relativa en comparación con el músculo turt no calentado tras la administración de gad HTLC, según determinó el análisis de la señal de resonancia magnética, manteniéndose la señal hasta el final del período de calentamiento. Una vez dominada, esta técnica puede montarse en menos de 15 minutos si se realiza correctamente, proporcionando una herramienta valiosa para la evaluación preclínica de formulaciones de liposomas termosensibles.

No olvide que trabajar con un láser de Clase cuatro puede ser extremadamente peligroso, y que siempre se deben tomar precauciones, como el uso de gafas de seguridad, al realizar este procedimiento.