Name: El uso de biosensores para cuantificar enzimática endógena ATP o H 2 O 2 En el riñón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Aprende a medir ATP y peróxido de hidrógeno endógenos en riñón mediante biosensores enzimáticos de microelectrodos. Este protocolo permite cuantificación en tiempo real para estudios ex vivo e in vivo.

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Apreciamos Sarissa Biomédica por su trabajo en el desarrollo de los sensores usados ​​en el presente manuscrito. Esta investigación fue apoyada por el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre otorga HL108880 (A. Staruschenko), HL 116 264 (A. Cowley) y HL 122 662 (A. Staruschenko y A. Cowley), un proyecto financiado por el Colegio Médico de Comité de Asuntos de Investigación Wisconsin # 9306830 (O. Palygin) y al desarrollo de un Programa de Investigación y Educación Saludable Wisconsin # 9520217, y el joven investigador de subvención de la Fundación Nacional del Riñón (O. Palygin).

Los siguientes procedimientos con animales adheridos a la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. La aprobación previa se obtuvo de el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC). NOTA: Revisión de las instrucciones del fabricante del sensor se debe hacer durante el diseño de experimento y antes de su uso. Siguiendo estas instrucciones producirá resultados óptimos al utilizar los sensores. 1. Calibración del sensor <ol><li> Prepare nuevas soluciones madre antes del inicio del experimento. </li><li> Crear Tampón A que contiene 10 mM de tampón NaPi, NaCl 100 mM, 1 mM de MgCl 2, y glicerol 2 mM. Ajustar el pH a 7,4 utilizando NaOH. Almacenar a 2-8 ° C. </li><li> Utilizando una concentración de solución madre de ATP (100 mM) se almacena a -20 ° C, crear una solución de calibración fresca 10 mM ATP mediante la adición de 10 l de stock a 90 l de tampón A. </li><li> Rehidratar el sensor de ATP mediante la colocación de la punta (Figura 2) en tél cámara de rehidratación que contiene tampón A por lo menos durante 10 minutos a 2-8 ° C. NOTA: Después de la rehidratación, los sensores no debe ser expuesto al aire durante más de 20 segundos o la sensibilidad del sensor puede ser reducida. Si se anticipan largas exposiciones al aire, sumergir el sensor brevemente en una solución de glicerol. Los sensores pueden ser utilizados para múltiples experimentos pero estos deben ocurrir en el mismo día como la rehidratación sensor. Los sensores pueden ser almacenados en la cámara de rehidratación con Tampón A para un máximo de 24 hr. </li><li> Encienda el potenciostato de doble canal (Figura 3) e iniciar el software del sistema de grabación. </li><li> Preparar una cámara de calibración con 3 ml de tampón A. colocar el electrodo de referencia en la cámara de calibración. Tome cada sensor de la cámara de rehidratación, a continuación, colóquelo en el manipulador y la inserta en la solución de cámara de calibración. NOTA: Utilice una silicona recubierto plato de petri estándar como una cámara de calibración. Llevar a cabo todas las calibraciones y studies en una jaula de Faraday en una mesa de aire de laboratorio de alto rendimiento para reducir el ruido de la señal durante las grabaciones amperometría (Figura 4). Las calibraciones se hacen mejor lo más cerca del inicio de la recolección de datos posible. Para aplicaciones en vivo el momento óptimo para la calibración es durante el período de recuperación después de la cirugía animal. </li><li> Ex vivo de calibración <ol><li> Realizar voltametría cíclica en la cámara de calibración en bicicleta a los sensores de -500 mV a 500 mV a una velocidad de 100 mV / s durante 10 ciclos. Esto mejora en gran medida la sensibilidad de los sensores. Consulte la Figura 5 para las huellas observadas a partir de los 10 ciclos. </li><li> Polarizar los sensores a 600 mV después del último ciclo. La corriente del sensor decaerá a una asíntota. Una lectura constante se logra después de un mínimo de 5 min. Registre la lectura de cero. </li></ol></li><li> En la calibración del sensor vivo <ol><li> No realice la voltametría cíclica en el in vivo sensors. En su lugar, polarizar el sensor en la cámara de calibración para 30 seg a 500 mV. A continuación, establezca el potenciostato a 0 mV y deje que el sensor de corriente a la altura de una asíntota. La corriente del sensor tomará por lo menos 2 minutos para asíntota. Registre la lectura de cero. </li></ol></li><li> Añadir consecutivamente cantidades fijas de solución de ATP en la cámara para producir una línea de calibración que abarca un rango de detección deseada. La solución ATP produce un pico agudo en la señal del sensor inicialmente, seguido por un decaimiento como difumina la ATP de manera uniforme en toda la cámara. Valores de la señal de registro una vez que el nivel de la señal se ha estabilizado después de cada adición de ATP. Figuras 6A y 7 muestran rastros y sugirió concentraciones de ATP, tanto ex vivo y los estudios in vivo, respectivamente. NOTA: Es importante para confirmar la selectividad de los electrodos mediante el uso de eliminadores de los analitos. El presente protocolo utilizado apirasa para poner a prueba la especificidad del sensor de ATP y catalasa para la H &lt;sub&gt; 2 O 2 de la señal (Figuras 6B). Si los medicamentos se administran, las mediciones de su reactividad con los sensores se deben determinar antes del estudio. </li><li> Añadir 3 l de apirasa de un stock de 2 mg / ml (89 UN / mg) para poner a prueba la especificidad del sensor de ATP (la corriente producida por la aplicación de ATP debe reducir hasta el nivel cero (Figura 7). </li><li> Añadir 3 l de catalasa de un stock de 2 mg / ml (100 UN / mg) para poner a prueba la especificidad del sensor nula (la corriente producida por H 2 O 2 aplicación debería reducir a la lectura de cero). </li></ol> 2. Cirugía Animal de Estudios de sensores <ol><li> Cirugía para la ex vivo <ol><li> Anestesiar el animal experimental con isoflurano (5% de inducción, de 1,5 a 2,5% de mantenimiento) / grado O médica 2 u otro método aprobado. 15 &#39;12 Los animales deben ser monitoreados continuamente para garantizar un nivel adecuado de anestesia. Sttasa de reacción y de los pies pizca respiratoria capaz se utilizan para confirmar la anestesia adecuada. Nota: La eutanasia del animal de acuerdo con los protocolos del IACUC aprobados. A la finalización de todos los procedimientos no-supervivencia eutanasia a animales profundamente anestesiados por toracotomía inducir neumotórax para asegurar la desaparición humanitario de los animales 12. </li><li> Coloque la rata en una mesa quirúrgica con control de temperatura en una posición supina. Mientras se mantiene una profundidad anestésica adecuada, hacer una incisión en la línea media de aproximadamente 5 cm en línea con el riñón izquierdo y exponer la aorta abdominal distal. </li><li> Envuelva una ligadura alrededor del celíaco y las arterias mesentérica superior y la aorta abdominal por encima de estas arterias pero no ligar. Envolver dos ligaduras alrededor de la aorta abdominal por debajo de las arterias renales. </li><li> Sujete la aorta abdominal por encima de las ligaduras. Ate la ligadura inferior. Cateterizar la aorta abdominal con tubo de polietileno (PE50). Asegure el catéter con la segunda ligadura aorta. </li><li> Retire la abrazadera y ligar las arterias mesentéricas y celíacos. Perfundir el riñón a 6 ml / min con Hanks Balanced Salt Solution a TA durante 2-3 min hasta que el riñón está completamente palideció. </li><li> Extirpar el riñón y el catéter, conectado porción de la aorta. Coloque el riñón en una placa de Petri de 3 ml lleno de solución del baño. Nota: protocolo de experimento se puede realizar a temperatura ambiente. La solución del baño contiene en mM: 145 NaCl, 4,5 KCl, 2 MgCl 2, 1 CaCl 2, 10 HEPES, pH ajustado con NaOH 7,35. </li></ol></li><li> Cirugía en in vivo <ol><li> Anestesiar la rata utilizando protocolos IACUC aprobados. Para el análisis in vivo anestesiar las ratas con ketamina (20 mg / kg IM) y inactina (50 mg / kg ip). Los animales deben ser controlados continuamente para garantizar un nivel adecuado de anestesia. Una reacción tasa y puntera pizca respiratoria estable se utiliza para confirmar la anestesia adecuada. </li><li> Después de la profundidad de anestesia adecuada es obtenered, coloque la rata en una posición supina sobre una superficie a tierra de temperatura controlada situado en la mesa de aire. La superficie debe ser precalentado y se mantiene a 36 ° C. </li><li> Mientras se mantiene la profundidad anestésica adecuada, hacer una incisión en la línea media de aproximadamente 5 cm en línea con el riñón. </li><li> Utilice una sutura para desviar y anclar el tejido cutáneo y subcutáneo de manera que todo el riñón es visible. Coloque el riñón en una taza de riñón para minimizar los artefactos de movimiento. </li><li> Utilice una infusión IV de 2% BSA: 0,9% de NaCl a 1 ml / 100 g / hr a través de la vena yugular para mantener el volumen de sangre. Canular ambos uréteres para la recolección de orina. Coloque los lazos alrededor de las arterias mesentéricas celíacas y superiores y la aorta distal para la manipulación de la presión de perfusión renal (Figuras 10A). </li><li> Si se requiere la aplicación de agentes farmacológicos durante los experimentos in vivo, la inserción de un catéter intersticial se recomienda (Figuras 10B </strong&gt;). </li></ol></li></ol> Configuración 3. Adquisición de Datos <ol><li> Abra el programa de adquisición de datos y establecer su polaridad tanto ex vivo e in vivo a anódica positiva. Ajuste el programa para guardar datos como código ASCII. </li><li> Coloque los micromanipuladores para la inserción rápida de los sensores en los riñones. NOTA: También puede utilizar una sonda ficticio unido al micromanipulador para ayudar a lograr la colocación deseada de sensores. </li><li> Adquisición de datos Ex vivo <ol><li> Perfundir el riñón con solución de baño (de 2.1.6) a través de la aorta canulado a una velocidad constante de 650 l / min. Con unas tijeras quirúrgicas, retire con cuidado la cápsula renal, la cual es necesaria para la inserción del sensor. </li><li> Asegurar el riñón con bandas de goma atadas sobre el riñón y unidos al plato recubierto de silicona con alfileres. </li><li> Coloque el electrodo de referencia cerca del riñón en la placa de Petri con su punta sumergida enla solución tampón. </li></ol></li><li> En la adquisición de datos in vivo <ol><li> Coloque el riñón en una taza de riñón. Dependiendo de la cepa y edad del animal utilizar un tamaño de copa que sostiene el riñón sin apretar. La Figura 8 muestra dos tamaños de copas de riñón. Tazas similares se utilizan para diferentes enfoques fisiológicos se centraron en el análisis de la función renal como micropunción etc 16. Nota: La posición de la copa renal es fundamental para eliminar el ruido mecánico producido por la respiración animal, pero no debe interferir con o bloquear la perfusión renal o el flujo de orina. </li><li> Permitir 45 minutos de tiempo de recuperación antes de realizar la recolección de datos. </li><li> Usando una aguja 26-30G, hacer un agujero de punción en el lugar deseado y la profundidad del sensor en el riñón. Seque el agujero superficie para eliminar la sangre exudada. Añadir solución de glicerol a la superficie del riñón. Esto evitará que la superficie de riñón se seque durante el experimento. </li&gt; <li> Retire el primer sensor de la cámara de la rehidratación y adjuntarlo a la micromanipulador. Rápidamente, dentro de los 20 segundos, inserte el electrodo en el agujero recién creado en el riñón. Repita los pasos 3,5 a 3,9 para el sensor nulo. </li><li> Insertar el electrodo de referencia en el riñón, aproximadamente 1 cm a partir de los sensores. </li></ol></li><li> Encienda la potenciostato y activar el programa de grabación en el equipo. La Figura 9 muestra la configuración final de la adquisición de datos de riñón ex vivo. La Figura 10 muestra la configuración final de la adquisición de datos de riñón in vivo con un catéter insertado. </li></ol> Análisis 4. Datos <ol><li> Importe el archivo de datos ASCII en origen o cualquier otro software similar. </li><li> Relación actual Concentración <ol><li> Utilice la función de ajuste / extrapolar lineal para construir una concentración lineal (eje x) a la corriente (eje y) la relación de la ATP o H 2 </sub&gt; O 2 puntos de calibración (Figuras 6 y 7). línea de ajuste lineal: y = mx + b </li></ol></li><li> Equiparar la corriente y la concentración </li><li> Restar las huellas medidos del sensor nula de los del sensor de ATP para obtener la corriente real producida por el ATP intracelular. </li><li> Convertir los valores de ATP en pA obtenidos por amperometría a nM usando la ecuación de calibración se detalla en 4.2.1. Determinar la concentración de la traza de datos resta del sensor de ATP mediante la importación de cada corriente ajustada en el valor de &quot;x&quot; y resolviendo para y (la concentración de analito). </li><li> Del mismo modo, el cálculo de H 2 O 2 concentración de su ecuación de calibración si es necesario. </li></ol>

<ol><li>Palygin, O., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+endogenous+substances+with+enzymatic+microelectrode+biosensors+in+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Detection of endogenous substances with enzymatic microelectrode biosensors in the kidney.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 305, 89-91 (2013).</li>
<li>Clark, L. C., Lyons, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrode+systems+for+continuous+monitoring+in+cardiovascular+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery.</a> Ann N Y Acad Sci. 102, 29-45 (1962).</li>
<li>Haruyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-+and+nanobiotechnology+for+biosensing+cellular+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Micro- and nanobiotechnology for biosensing cellular responses.</a> Adv Drug Deliv Rev. 55, 393-401 (2003).</li>
<li>Huckstepp, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+hemichannel-mediated+CO2-dependent+release+of+ATP+in+the+medulla+oblongata+contributes+to+central+respiratory+chemosensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Connexin hemichannel-mediated CO2-dependent release of ATP in the medulla oblongata contributes to central respiratory chemosensitivity.</a> J Physiol. 588, 3901-3920 (2010).</li>
<li>Lopatar, J., Dale, N., Frenguelli, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minor+contribution+of+ATP+P2+receptors+to+electrically-evoked+electrographic+seizure+activity+in+hippocampal+slices%3A+Evidence+from+purine+biosensors+and+P2+receptor+agonists+and+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Minor contribution of ATP P2 receptors to electrically-evoked electrographic seizure activity in hippocampal slices: Evidence from purine biosensors and P2 receptor agonists and antagonists.</a> Neuropharmacology. 61, 25-34 (2011).</li>
<li>Avshalumov, M. V., Chen, B. T., Marshall, S. P., Pena, D. M., Rice, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate-dependent+inhibition+of+dopamine+release+in+striatum+is+mediated+by+a+new+diffusible+messenger%2C+H2O2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate-dependent inhibition of dopamine release in striatum is mediated by a new diffusible messenger, H2O2.</a> J Neurosci. 23, 2744-2750 (2003).</li>
<li>Frenguelli, B. G., Wigmore, G., Llaudet, E., Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+mechanistic+dissociation+of+ATP+and+adenosine+release+during+ischaemia+in+the+mammalian+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Temporal and mechanistic dissociation of ATP and adenosine release during ischaemia in the mammalian hippocampus.</a> J. Neurochem. 101, 1400-1413 (2007).</li>
<li>Lalo, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytosis+of+ATP+from+astrocytes+modulates+phasic+and+tonic+inhibition+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Exocytosis of ATP from astrocytes modulates phasic and tonic inhibition in the neocortex.</a> PLoS Biol. 12, e1001747(2014).</li>
<li>Heinrich, A., Ando, R. D., Turi, G., Rozsa, B., Sperlagh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K%2B+depolarization+evokes+ATP%2C+adenosine+and+glutamate+release+from+glia+in+rat+hippocampus%3A+a+microelectrode+biosensor+study%5BTitle%5D)+AND+%22Br.J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">K+ depolarization evokes ATP, adenosine and glutamate release from glia in rat hippocampus: a microelectrode biosensor study.</a> Br.J Pharmacol. 167, 1003-1020 (2012).</li>
<li>Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+signaling+in+hypothalamic+tanycytes%3A+potential+roles+in+chemosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Purinergic signaling in hypothalamic tanycytes: potential roles in chemosensing.</a> Semin Cell Dev Biol. 22, 237-244 (2011).</li>
<li>Gourine, A. V., Llaudet, E., Dale, N., Spyer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+ATP+in+the+ventral+medulla+during+hypoxia+in+rats%3A+role+in+hypoxic+ventilatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Release of ATP in the ventral medulla during hypoxia in rats: role in hypoxic ventilatory response.</a> J Neurosci. 25, 1211-1218 (2005).</li>
<li>Palygin, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+electrochemical+detection+of+ATP+and+H2O2+release+in+freshly+isolated+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Real-time electrochemical detection of ATP and H2O2 release in freshly isolated kidneys.</a> Am J Physiol Renal Physiol. , (2013).</li>
<li>Thome-Duret, V., Gangnerau, M. N., Zhang, Y., Wilson, G. S., Reach, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+the+sensitivity+of+glucose+sensor+implanted+into+subcutaneous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab%22%5BJournal%5D)">Modification of the sensitivity of glucose sensor implanted into subcutaneous tissue.</a> Diabetes Metab. 22, 174-178 (1996).</li>
<li>Wilson, G. S., Gifford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensors+for+real-time+in+vivo+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Biosensors for real-time in vivo measurements.</a> Biosens. Bioelectron. 20, 2388-2403 (2005).</li>
<li>Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Channel+Analysis+of+TRPC+Channels+in+the+Podocytes+of+Freshly+Isolated+Glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-Channel Analysis of TRPC Channels in the Podocytes of Freshly Isolated Glomeruli.</a> Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).</li>
<li>Stockand, J. D., Vallon, V., Ortiz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+ex+vivo+analysis+of+tubule+function%5BTitle%5D)+AND+%22Compr+Physiol%22%5BJournal%5D)">In vivo and ex vivo analysis of tubule function.</a> Compr Physiol. 2, 2495-2525 (2012).</li>
<li>Turner, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensors%3A+Fundamentals+and+applications+-+Historic+book+now+open+access%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Biosensors: Fundamentals and applications - Historic book now open access.</a> Biosens. Bioelectron. 65C, A1(2014).</li>
<li>Kauffmann, J. M., Guilbault, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+electrode+biosensors%3A+theory+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Biochem+Anal%22%5BJournal%5D)">Enzyme electrode biosensors: theory and applications.</a> Methods Biochem Anal. 36, 63-113 (1992).</li>
<li>Barlett, P. N., Cooper, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+immobilization+of+enzymes+in+electropolymerized+films%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electroanal+Chem%22%5BJournal%5D)">A review of the immobilization of enzymes in electropolymerized films.</a> J Electroanal Chem. 362, 1-12 (1993).</li>
<li>Kano, K., Morikage, K., Uno, B., Esaka, Y., Goto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+microelectrodes+for+choline+and+acetylcholine+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Enzyme microelectrodes for choline and acetylcholine and their applications.</a> Anal Chim Acta. 299, 69-74 (1994).</li>
<li>Llaudet, E., Hatz, S., Droniou, M., Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrode+biosensor+for+real-time+measurement+of+ATP+in+biological+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Microelectrode biosensor for real-time measurement of ATP in biological tissue.</a> Anal Chem. 77, 3267-3273 (2005).</li>
<li>Llaudet, E., Botting, N. P., Crayston, J. A., Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-enzyme+microelectrode+sensor+for+detecting+purine+release+from+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A three-enzyme microelectrode sensor for detecting purine release from central nervous system.</a> Biosens Bioelectron. 18, 43-52 (2003).</li>
<li>Cosnier, S., Lepellec, A., Guidetti, B., Isabelle, R. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+biosensor+sensitivity+in+aqueous+and+organic+solvents+using+a+combination+of+poly%28pyrrole-ammonium%29+and+poly%28pyrrole-lactobionamide%29+films+as+host+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electroanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhancement of biosensor sensitivity in aqueous and organic solvents using a combination of poly(pyrrole-ammonium) and poly(pyrrole-lactobionamide) films as host matrices.</a> J Electroanal Chem. 449, 165-171 (1998).</li>
<li>Gourine, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+control+breathing+through+pH-dependent+release+of+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP.</a> Science. 329, 571-575 (2010).</li>
<li>Kluess, H. A., Stone, A. J., Evanson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+overflow+in+skeletal+muscle+1A+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">ATP overflow in skeletal muscle 1A arterioles.</a> J. Physiol. 588, 3089-3100 (2010).</li>
<li>Nishiyama, A., Jackson, K. E., Majid, D. S., Rahman, M., Navar, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+interstitial+fluid+ATP+responses+to+arterial+pressure+and+tubuloglomerular+feedback+activation+during+calcium+channel+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Renal interstitial fluid ATP responses to arterial pressure and tubuloglomerular feedback activation during calcium channel blockade.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290, H772-H777 (2006).</li>
<li>Jin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+renal+perfusion+pressure+on+renal+medullary+hydrogen+peroxide+and+nitric+oxide+production%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Effects of renal perfusion pressure on renal medullary hydrogen peroxide and nitric oxide production.</a> Hypertension. 53, 1048-1053 (2009).</li>
<li>Khan, A. S., Michael, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+consequences+of+using+micro-electrodes+and+microdialysis+probes+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Invasive consequences of using micro-electrodes and microdialysis probes in the brain.</a> Trends Anal. Chem. 22, 503-508 (2003).</li>
</ol>

Sensores para la grabación de vídeo de este manuscrito fueron proporcionados por Sarissa Biomédica Limited (Coventry, Reino Unido).

Los actuales protocolos fueron desarrollados para proporcionar una resolución temporal y espacial mejorada de ATP y H 2 O 2 de señalización para ex vivo aislados, perfundidos e in vivo riñones perfundidos sangre. Las diferencias entre los protocolos y los sensores utilizados aquí proporcionan la adquisición de datos óptima, ya sea para agentes farmacológicos o estudios fisiológicos. Los protocolos consisten en 1) la calibración del sensor, 2) procedimiento quirúrgico, 3) de configuración de ...

Biosensores microelectrodos enzimática (También denominada sensores en el presente manuscrito) han sido una herramienta valiosa para el estudio de procesos de señalización dinámica en las células y tejidos vivos. Los sensores proporcionan una mayor resolución temporal y espacial de las moléculas de señalización celular en concentraciones biológicamente relevantes. En lugar de toma de muestras y el análisis de los fluidos extracelulares tomadas a intervalos durante largos períodos de tiempo, estos sensores responden tan rápido como sus enzimas reaccionan con el analito, produciendo de ese modo mediciones en tiempo real 1,2. Detección rápida de las concentraciones intersticiales de factores autocrinos y paracrinos, como purinas o el peróxido de hidrógeno, y la dinámica de su liberación se puede utilizar para establecer un perfil de los efectos de las drogas en condiciones normales y patológicas 3. En la actualidad, la mayoría de las aplicaciones que utilizan sensores de haber estado en cortes de tejido del cerebro y cultivos celulares 4-10. Los protocolos detallados en este objetivo manuscrito aestablecer los medios para medir con precisión las concentraciones en tiempo real de analitos en los riñones enteros. Los siguientes protocolos se desarrollaron para estudiar ATP intersticial y H 2 O 2 de señalización en los riñones. En el entorno natural de los riñones, el ATP extracelular se cataboliza rápidamente por ectonucleotidasas endógenos en sus derivados (ADP, AMP y adenosina). Los sensores utilizados aquí son muy selectivos a la ATP sobre otras purinas o productos de degradación de ATP 11. Esto ofrece una gran ventaja, ya que permite la monitorización precisa de las concentraciones constantes y dinámicos de la liberación de ATP y su función de señalización. La concentración de ATP intersticial se mide usando la combinación de dos microelectrodos, un sensor de ATP y un sensor de Null. El sensor de Null en combinación con aplicaciones de catalasa es capaz de detectar intersticial H 2 O 2 concentraciones 12. Los siguientes protocolos utilizan dos diseños diferentes de sensors que tienen características óptimas para ya sea ex vivo o in vivo. aplicaciones Ambos diseños se basan en la reacción catalítica secuencial de glicerol quinasa y glicerol oxidasa-3-fosfato contenida en una capa enzimática del sensor y está impulsado por la presencia de ATP. En el conjunto de sensores utilizados en los estudios ex vivo, H 2 O 2, el producto final de reacción enzimática, se detecta por oxidación en un platino / iridio (Pt-Ir) electrodo de alambre. Sensores para estudios in vivo en cambio se basan en H 2 O 2 reducción en un electrodo de oro mediador recubierto diseñado para el tejido perfundido con sangre. Se muestra en la Figura 1 es un esquema de ambos protocolos descritos en este manuscrito. El sensor Null es idéntica a su sensor de ATP correspondiente, excepto que carece de las enzimas unidas. Por lo tanto, además de la detección de H 2 O 2 con la enzima catalasa, la mea sensor NullSures interferencias no específicas. Concentraciones de ATP se calculan restando el Null detecta interferencias no específicas y fondo H 2 O 2 de la señal del sensor de ATP. Varios sensores también están disponibles comercialmente para detectar otros analitos incluyendo adenosina, ionosine, hipoxantina, la acetilcolina, colina, glutamato, glucosa, lactato, D-serina para aplicaciones ex vivo o adenosina, ionosine, e hipoxantina para in vivo cuando se combina con el Null correspondiente sensor. La capacidad del sensor para detectar con precisión analitos depende de la pre adecuada y calibraciones posteriores 13. Esto asegura que el análisis representa la deriva en la sensibilidad del sensor que se produce durante el uso en los tejidos biológicos. El sensor tiene un depósito de glicerol que se utiliza como reactivo en las reacciones enzimáticas del sensor. Si el sensor no se utiliza en soluciones de baño que contiene glicerol, que se lave con el tiempo. Shorter rtiempos ecording son entonces necesarias para minimizar la deriva del sensor. Además del sensor de ensuciamiento por proteasas endógenas y los fragmentos de proteínas puede disminuir en gran medida la sensibilidad de los sensores 14. El presente manuscrito establece el uso de microelectrodos de biosensores enzimáticos para ex vivo e in vivo en forma de preparados de riñón. Cuantificación de analitos en tiempo real ofrece un detalle sin precedentes de la señalización celular que puede revelar nuevos conocimientos sobre los mecanismos de las enfermedades renales y agentes farmacológicos.

<table><tbody><tr><td>Kit de sensor</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBK-ATP-05-125</td><td>El kit incluye botella de almacenamiento, cámara de rehidratación, cables de electrodos y electrodos de referencia. También se incluye con el kit la elección de sensores por parte del usuario.</td></tr><tr><td>Sarissaprobe ATP Biosensor 125 &mu; m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBS-ATP-05-125</td><td>almacenar a 2-8 oC antes de usar</td></tr><tr><td>Sarissagold ATP Biosensor 50 &mu; m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SGS-ATP-10-50</td><td>almacenar a 2-8 oC antes de usar</td></tr><tr><td>Sarissaprobe sensor nulo 125 &mu; m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBS-NUL-20-125</td><td>almacenar a 2-8 oC antes de usar</td></tr><tr><td>Sarissagold sensor nulo 50 &mu; m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SGS-NUL-10-50</td><td>tienda a 2-8 oC antes de usar</td></tr><tr><td>Sarissaprobe ATP Manual</td><td>Sarissa Biomedical</td><td></td><td><a href="http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf">http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf</a></td></tr><tr><td>jaula de Faraday&nbsp;</td><td>TMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potenciostato de doble canal</td><td>Digi-Ivy</td><td>DY2021</td><td>Tipo II Jaula de Faraday</td></tr><tr><td>Programa de adquisición de datos</td><td>Digi-Ivy</td><td>DY2000</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de perfusión</td><td>Razel Scientific Instruments</td><td>Modelo R99E</td><td></td></tr><tr><td>Iluminador de fibra óptica</td><td>Schott</td><td>ACE 1</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td></td></tr><tr><td>soporte magnético para micromanipulador</td><td>Narishige</td><td>GJ-8</td><td></td></tr><tr><td>mesa de aire</td><td>TMC</td><td>63-500</td><td></td></tr><tr><td>ventilador de isoflurano</td><td>LEI Medical</td><td>M2000</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri de 3 ml</td><td>Fisher Scientific</td> aguja <td>de S3358OA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Santa Cruz</td><td></td><td>26-30 G</td></tr><tr><td>clavijas</td><td></td><td></td><td>de disección estándar</td></tr><tr><td>catéter</td><td></td><td></td><td>Tubo de polietileno (PE50)</td></tr><tr><td>catéter pegamento para tejidos Vetbond</td><td></td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>sutura</td><td>Look</td><td>SP117</td><td></td></tr><tr><td>gomas</td><td></td><td></td><td>elásticas cualquier 2-4 mm de ancho gomas</td></tr><tr><td>de silicona</td><td>Momentive</td><td>RTV-615 Clear 1#</td><td></td></tr><tr><td>clamp</td><td>Fine Science Tools</td><td>18052-03</td><td></td></tr><tr>kit <td></td><td></td><td>de disección estándar</td><td>El kit debe incluir bisturí y tijeras de disección&nbsp;</td></tr><tr>Copa <td></td><td></td> de <td>riñón</td><td>De diseño propio</td></tr><tr><td>productos químicos estándar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6559-25UMO</td><td>100 mM solución</td></tr><tr><td>de ATP peróxido de hidrógeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Apirasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7646</td><td></td></tr><tr><td>Catalasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>isoflurano</td><td>Clipper</td><td>10250</td><td></td></tr><tr><td>inactin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T133</td><td></td></tr><tr><td>ketamina</td><td>Clipper</td><td>2010012</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Solución salina equilibrada&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td></td></tr></tbody></table>

el uso de biosensores para cuantificar enzimática endógena atp o h<sub&gt; 2</sub&gt; o<sub&gt; 2</sub&gt; en el riñón

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Biosensores enzimáticos de microelectrodos han sido ampliamente utilizados para medir la señalización extracelular en tiempo real. La mayor parte de su uso se ha limitado a secciones de cerebro y cultivos de células neuronales. Recientemente, esta tecnología se ha aplicado a los órganos enteros. Los avances en el diseño del sensor han hecho posible la medición de la señalización celular en vivo en los riñones perfundidos con sangre. Los actuales protocolos enumeran los pasos necesarios para medir el ATP y H 2 O 2 de señalización en el intersticio de riñón de rata. Dos diseños de sensores separados se utilizan para la ex vivo y en los protocolos in vivo. Ambos tipos de sensor se recubren con una capa biológica enzimática delgada en la parte superior de una capa de permeabilidad selectiva para dar respondieron rápido, biosensores sensibles y selectivos. La capa permselectividad protege la señal de los interferentes en el tejido biológico, y la capa enzimática utiliza la reacción catalítica secuencial de glicerol quinasa y glicerol-3-phosfosfato oxidasa en presencia de ATP para producir H 2 O 2. El conjunto de sensores utilizados para los estudios ex vivo detecta más analito mediante la oxidación de H 2 O 2 en un platino / iridio (Pt-Ir) electrodo de alambre. Los sensores para los estudios in vivo se basan en su lugar la reducción de H 2 O 2 en un electrodo de oro mediador recubierta diseñada para el tejido perfundido con sangre. Cambios concentración final son detectados por amperometría en tiempo real seguido de calibración para concentraciones conocidas de analito. Además, la especificidad de la señal amperométrica se puede confirmar mediante la adición de enzimas como la catalasa y la apirasa que descomponen H 2 O 2 y ATP correspondientemente. Estos sensores también se basan en gran medida en las calibraciones precisas antes y después de cada experimento. Los dos protocolos siguientes establecen el estudio de la detección en tiempo real de ATP y H 2O 2 en los tejidos renales, y puede ser modificado adicionalmente para extender el método descrito para su uso en otras preparaciones biológicas u órganos enteros.

El diseño del biosensor microelectrodo enzimática permite la detección en tiempo real de analitos en los riñones enteros. El diseño experimental general para ya sea ex vivo o in vivo estudios se ilustra en la Figura 1 .Los sensores utilizados y los procedimientos quirúrgicos difieren dependiendo de si el estudio es ex vivo o in vivo. Para obtener resultados reproducibles, pre precisa y calibraciones posteriores son críticos. <stro...

Los biosensores de microelectrodos enzimáticos permiten mediciones en tiempo real de la señalización de células extracelulares en concentraciones biológicamente relevantes. Los siguientes protocolos amplían las aplicaciones de los biosensores a la detección ex vivo e in vivo de ATP yH2O2en el riñón.

El uso de biosensores para cuantificar enzimática endógena ATP o H<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; En el riñón

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

El objetivo general de estos procedimientos es medir en tiempo real las concentraciones endógenas intersticiales de un TP y peróxido de hidrógeno en riñones completos. Esto se logra primero rehidratando y calibrando sensores para aplicaciones ex vivo y en vivo frente a concentraciones conocidas de un TP y peróxido de hidrógeno. Para la instalación del sensor ex vivo, el riñón fue instrumentado quirúrgicamente y limpiado de sangre.Este procedimiento se realiza lavando el riñón a través de la aorta. Luego, el riñón de rata se aísla quirúrgicamente, se coloca en una cámara de registro y se perfunde con solución salina. Un TP y peróxido de hidrógeno se miden utilizando sensores ex vivo para el procedimiento in vivo.Se realiza una incisión para permitir la visualización del riñón perfundido con sangre. El riñón se coloca en el capilar de sujeción y se puede instalar un catéter intersticial para la administración de fármacos. Además, las concentraciones intersticiales renales de ATP y peróxido de hidrógeno se miden utilizando sensores in vivo.En última instancia, estos protocolos facilitan el uso de biosensores enzimáticos con microelectrodos para mediciones en tiempo real de ATP y peróx

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Los efectos de la activación de la proteína quinasa C (PKC) las isoenzimas en las funciones mitocondriales asociadas con la respiración y la fosforilación oxidativa y en la viabilidad celular se describen. El enfoque se adapta técnica adenoviral para sobreexpresar selectivamente las isozimas de la PKC en cultivo de células primarias y una diversidad de ensayos para determinar las funciones mitocondriales y el estado de energía de la célula.

Evaluación de las funciones mitocondriales y la viabilidad celular renal de células que sobreexpresan la proteína quinasa C Isoenzimas

Este video muestra un ensayo enzimático basado en cromatografía en capa fina para determinar la actividad de la pirofosfoquinasa utilizando nucleótidos radiomarcados. El método proporciona información sobre la síntesis de nucleótidos y las reacciones de fosfotransferencia.

Ensayo de actividad enzimática basado en cromatografía en capa fina: una técnica para determinar la actividad de la pirofosfoquinasa in vitro mediante cromatografía en capa fina

Describimos un método para cuantificar la actividad de las ATPasas de tipo P que contratransportan K+ mediante la expresión heteróloga de las enzimas en los ovocitos de Xenopus y midiendo la absorción de Rb+ o Li+ en células individuales mediante espectrofotometría de absorción atómica. El método es una alternativa sensible y segura a los experimentos de flujo de radioisótopos, ya que facilita estudios cinéticos complejos.

Medición de transporte de cationes por Na, K y H, K-ATPasa en<em&gt; Xenopus</em&gt; Los ovocitos mediante espectrofotometría de absorción atómica: una alternativa a ensayos de radioisótopos

Se describe el uso de dos, biosensores ratiometric codificados genéticamente, que se basan en la GFP, para vigilar los niveles de ATP estado redox mitocondrial y en la resolución subcelular en células de levadura vivas.

Biosensores radiométricos que miden el estado redox mitocondrial y ATP en las células vivas de levadura

Aquí describimos ensayos bioquímicos que se pueden utilizar para caracterizar las enzimas de remodelación de la cromatina dependientes de ATP por sus capacidades para 1) catalizar el deslizamiento de nucleosomas dependientes de ATP, 2) interactuar con sustratos de nucleosomas y 3) hidrolizar ATP de una manera dependiente de nucleosomas o ADN.

Los ensayos bioquímicos para Actividades Analizando de ATP-dependientes remodelación de la cromatina enzimas

Describimos un protocolo básico para cuantificar la actividad de la ATPasa in vitro. Este protocolo se puede optimizar en función del nivel de actividad y los requisitos de una ATPasa purificada determinada.

Medición<em&gt; In Vitro</em&gt; Actividad ATPasa para enzimática Caracterización

Las proteínas quinasas son enzimas de señalización altamente evolucionadas y andamios que son críticos para la transducción de señales inter e intracelulares. Se presenta un protocolo para medir la actividad quinasa mediante el uso de adenosina trifosfato radiomarcado ([γ- 32 P] ATP), un método fiable para ayudar a la elucidación de la regulación de señalización celular.

Ensayo de la actividad de proteína quinasa con ATP radiomarcado

Las proteasas son fuertemente reguladas las enzimas implicadas en procesos biológicos fundamentales y desajuste proteasa actividad unidades progresión de enfermedades complejas como el cáncer. Este método pretende crear nanosensores que miden actividad proteasa en vivo produciendo una señal de escote que es detectable de la orina de host y discrimina la enfermedad.

Nanosensores para detectar actividad proteasa en Vivo para el diagnóstico no invasivo

Un ensayo ATPase acoplado a la nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) se ha adaptado al cribado de rendimiento semialto de inhibidores de la miosina de moléculas pequeñas. Este ensayo cinético se ejecuta en un formato de microplaca de 384 pocillos con volúmenes de reacción totales de sólo 20 s por poca. La plataforma debe ser aplicable a prácticamente cualquier enzima productora de ADP.

Una adaptación de semi-alto rendimiento del ensayo ATPase acoplado a NADH para la detección de inhibidores de moléculas pequeñas

El kit de detección fluorescente de la proteasa se ha diseñado para la medición de la actividad de la proteasa con fluorometría. También es adecuado para la detección de trazas de contaminación de la proteasa. El método se basa en la hydroysis proteolítica de una fórmula propia de un sustrato marcado con FITC caseína.

El uso del kit de la proteasa detección fluorescente para determinar la actividad de la proteasa

Aprende a medir ATP y peróxido de hidrógeno endógenos en riñón mediante biosensores enzimáticos de microelectrodos. Este protocolo permite cuantificación en tiempo real para estudios ex vivo e in vivo.

El uso de biosensores para cuantificar enzimática endógena ATP o H

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