Name: Generación y Análisis Cuantitativo de pulsos de baja frecuencia de ultrasonido para determinar la sensibilidad de Sonic de tratados y no tratados células neoplásicas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Aprende a evaluar la eficacia del ultrasonido de baja frecuencia en células leucémicas humanas usando methyl beta cyclodextrin. Este método permite analizar la viabilidad celular mediante conteo automatizado y ensayo XTT.

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Los autores desean agradecer al personal del taller del Departamento de Física de la Universidad de Syracuse por su innovadora asistencia en asuntos relacionados con el diseño de nuestro sistema.

1. Sistema Sonifier Limpieza celular <ol><li> Limpie la unión entre el cuerno y el convertidor utilizando cloroformo y un hisopo de algodón. Aplicar un aceite ligero o aceite mineral a las roscas de la bocina y el convertidor para eliminar aún más la acumulación de virutas de metal, óxido, o la oxidación. </li><li> Utilice cloroformo para eliminar el aceite y otros contaminantes de la unión después de limpiar las roscas con aceite. </li></ol> 2. Montaje de la célula Sonifier y Configuración del Sistema <ol><li> Vuelva a colocar la bocina para el convertidor. Para apretar adecuadamente el sistema, quitar el convertidor de ensamblado y el cuerno desde el conjunto de taza tirando de la bocina de la parte inferior de la copa (Figura 2A). Coloque una llave de ranura dentro de uno de los tres pequeños agujeros cerca de la parte superior del convertidor (Figura 2B). Entonces, posicionar una llave dinamométrica equipado con un pie de cuervo ½ pulgada en la parte ranurada de la bocina (Figura 2B). Apriete en standard sentido horario hasta que el medidor de par lee 54.23 N. m (Figura 2C), el par de apriete recomendado por el fabricante 16. Montar el convertidor apretado y cuerno de nuevo en la copa, y montar la bocina y el convertidor a un soporte de anillo en una posición vertical. Vuelva a conectar el convertidor a la fuente de alimentación antes de ajustar el sistema para la dosificación de pulso experimental. </li><li> Ajuste el sistema para la dosificación de pulso utilizando 1 seg de sonicación con 1 seg entre pulsos. Diferentes modelos de dosificación se pueden usar para otras condiciones experimentales. Muchas variables, como el volumen de agua y el diámetro del cuerno serían potencialmente requerir cambios en esta dosificación. Uso de los tipos antes mencionados muestra de células, el volumen y la concentración, los datos empíricos y la observación han llevado a la formulación de este régimen de dosificación. </li><li> Ajustar el sistema a la amplitud deseada. En este protocolo, utilizar 33% y el 50% de la amplitud para prevenir la destrucción celular completa, que haría la eficacia de sonosensitizers difíciles o imposibles de medir. NOTA: En este estudio se comparan las amplitudes. </li></ol> 3. La evaluación de la intensidad del sistema y Función <ol><li> Mantenga el medidor de cavitación en 1,5 cm, que es el nivel de la sonicación muestra. Tenga en cuenta las lecturas de evaluar que el sistema está funcionando a una intensidad esperada. Utilizando los niveles del sistema y de agua corriente, esperar entre 100 a 110 W / cm 2 para 33% de la amplitud y 115-125 W / cm 2 para 50% de la amplitud. Tenga en cuenta las lecturas de los contadores de cavitación de la pantalla del medidor, que representa la energía de cavitación en W / cm2 directamente. Tome estas lecturas en la superficie del agua, y aseguran no hay burbujas están presentes en la superficie de la sonda metros. NOTA: Es importante tener en cuenta que estos procedimientos se realizan sin la tapa para el acceso por encima de la bocina. No es necesario repetir después de cada tratamiento con ultrasonidos. Más bien, deben ser realizados después de la limpieza, volver a montar, y la configuración del sistema. </li&gt; <li> Coloque el hidrófono en un vial de muestra que contiene 12,5 ml de agua para sumergir completamente el sensor del hidrófono. Suspender el hidrófono utilizando el soporte de anillo. </li><li> Una el hidrófono a la entrada del osciloscopio con el fin de evaluar las características de forma de onda. Examine el osciloscopio para una onda sinusoidal clara, como ondas aberrantes pueden alterar la frecuencia del sistema de las especificaciones del fabricante. Tanto el metro cavitación y osciloscopio dan una lectura de frecuencia, pero sólo el osciloscopio mostrará olas aberrantes que son indicativos de un sistema defectuoso o montaje incorrecto. </li></ol> 4. Preparación de las células y Medio <ol><li> Preparar el medio mediante el uso de 240 ml de Iscove Modified Medio de Dulbecco (IMDM) y 50 ml de suero fetal bovino. No descongele suero fetal bovino en un baño de agua caliente, ya que los aumentos bruscos de temperatura pueden dar lugar a un compromiso en la estabilidad en suero. Combinar 240 l de gentamicina 50 mg / ml y 5 ml de penicilina/ Estreptomicina 100x en un matraz de cultivo estándar, y añadir al medio. Guarde el medio a 4 ° C. </li><li> Células U937 Seed a ~ 4 x 10 4 células / ml en un matraz de 25 cm 2 utilizando el medio preparado. Evaluar las células para la concentración y la viabilidad usando un contador de células TC 20 y exclusión azul tripán mediante la colocación de 15-20 l de células y 15-20 l de azul de tripano en un tubo de microcentrífuga y mezclar el contenido. L Pipette15-20 de esta mezcla en una diapositiva de muestreo TC 20, e iniciar el recuento mediante la colocación de la diapositiva en el contador de células TC 20. </li><li> Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO 2, y compruebe si la viabilidad celular mediante exclusión de azul de tripano y el contador de células TC 20. Cuando las células se encuentran en una concentración apropiada y / o han sido tratados con sonosensitizers para un plazo apropiado, la transferencia de 3 ml de células del frasco de cultivo a 20 ml vial de centelleo de vidrio. En este protocolo, crecer células U937 durante 48 horas, y luego tratar con 0,5, 1,o MeβCD 5 mM durante 30 min para agotar suficientemente el colesterol de las células antes de la sonicación. </li></ol> 5. celular Sonicación <ol><li> Degas desionizada, agua destilada utilizando un vacío y matraz de Buchner. Transferir el agua para el cuerno taza, y llenar a un nivel de 15 mm por encima de la parte superior de la bocina. El proceso de sonicación causa más desgasificación del agua durante un período de unos pocos minutos, y puede conducir a inconsistencias en el transcurso del experimento si el sistema no se ejecuta antes de muestrear sonicación. Por lo tanto, el funcionamiento del sistema de ~ 7 minutos antes de muestrear sonicación. </li><li> Coloque el vial de centelleo que contiene las células en el dispositivo de retención. A continuación, conecte el dispositivo de sujeción de la parte superior del cuerno taza y ajustado a una altura de 15 mm desde la parte superior de la bocina (en la superficie del agua utilizando el mecanismo de deslizamiento). </li><li> Las células se sometieron a ultrasonidos típicamente utilizando tres pulsos de 1 seg de ultrasonido, con 1 seg espaciamiento entre cada uno de estos pulsos. Para estoprotocolo, las células sonicado en 33% y 50% de la amplitud de pulso utilizando la dosificación mencionada. </li></ol> 6. La evaluación de células para daños post-tratamiento con ultrasonidos <ol><li> Evaluar las células suspendidas por daños y viabilidad utilizando azul de tripano y el contador de células TC 20. Además, analizar la muestra utilizando un contador Z2. Para el análisis de contador Z2, pipetear una suspensión celular 100 l en 20 ml de solución salina isotónica (200: 1). Antes del análisis, lave la abertura del analizador de partículas Z2 al menos dos veces utilizando solución salina isotónica. Coloque la muestra Z2 en el soporte de venta libre, y elevar la plataforma para la apertura antes de iniciar el recuento. </li><li> Adquirir los datos de los contadores de TC 20 y Z2 utilizando el software proporcionado por el fabricante. Analizar estos datos para el daño celular, la viabilidad y la creación de los restos celulares de ultrasonidos. </li></ol> 7. XTT Ensayo para determinar la viabilidad celular y mitocondrial Actividad de U937 tratadas y células THP1 <ol><li> Príor para los ensayos XTT, crecer U937 y THP1 células bajo las mismas condiciones. Pretratar las células con el mismo intervalo de concentración de MeβCD durante 30 min antes de la sonicación. Utilice los mismos parámetros de ultrasonido como antes, excepto que las células están sonicaron utilizando un rango de 1-3 una pulsos por segundo espaciados uno seg, aparte de desarrollar una serie de daños para el kit de XTT para evaluar. Nota: Muchas de estas medidas se toman directamente del manual del kit XTT y sólo se repiten para la comodidad de los laboratorios interesados. </li><li> Recoger las células por centrifugación a 200 xg durante 10 min. Resuspender el sedimento celular en el medio de crecimiento descrito anteriormente. Resuspender las células en ~ 1 x 10 5 células / ml. Células U937 de semillas en 100 l por pocillo en una placa de microtitulación de 96 pocillos de fondo plano, por triplicado, y luego repiten para las células THP1 utilizando una placa de 96 pocillos separada. Incluya 3 pocillos de control que contenían 100 l de medio de crecimiento completo solo como lecturas de absorbancia en blanco. A continuación, se incuban las placas inoculadas a 24 hr. </li><li> Descongelar dos alícuotas del reactivo XTT y el reactivo de activación a 37 ° C antes de su uso. Alícuotas Remolino suavemente hasta que se obtienen soluciones claras. Añadir 0,1 ml de reactivo de activación a 5,0 ml del reactivo XTT, que forma suficiente solución XTT activado por un ensayo de 96 pocillos de placas de microtitulación. Repita el proceso para la otra placa. </li><li> Añadir 50 l de la solución de XTT activado a cada pocillo. Devuelva la placa para el cultivo celular incubadora de CO 2 durante 2 horas. Agitar la placa suavemente tras el período de incubación para distribuir uniformemente el color naranja en los pocillos positivos. Medir la absorbancia de los pocillos de ensayo que contienen las células y los pocillos de control de fondo en blanco a una longitud de onda entre 450-500 nm de longitud de onda usando un lector de placa de microtitulación. </li><li> Cualquiera de cero el lector de placas de microtitulación utilizando los pocillos de control en blanco o restar su valor medio de los resultados específicos. Medir la absorbancia de todos los pocillos de ensayo de nuevo en una wavelengº entre 630 a 690 nm y restar los valores de los valores de 450 a 500 nm obtenidos. Nota: Esta segunda determinación absorbancia ayuda a eliminar las lecturas no específicos de los resultados del ensayo. El ensayo XTT se repitió cuatro veces para ambas líneas celulares. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Para lograr resultados óptimos, especial cuidado se debe tomar para colocar cuidadosamente la muestra y limpiar la unión convertidor bocina. La colocación de la muestra en el cuerno es importante para la obtención de la destrucción celular consistente, como el cambio de la distancia desde el cuerno alterará los focos acústico, y por lo tanto alterar la energía de la muestra se expone a. La energía acústica dentro del cuerno taza se puede mapear usando el metro cavitación para encontrar la posición de máxima cavitación. Además, el medidor de cavitación, junto con el osciloscopio son vitales para la determinación de la intensidad del sonido de las células están siendo expuestos a, así como la homogeneidad de la forma de onda. Por lo tanto, estos instrumentos deben ser utilizados para detectar problemas con el sistema, y ​​ayudar a determinar lo que la solución de problemas puede ser necesaria para corregir la inestabilidad del sistema. Como se mencionó anteriormente, el sistema de baja frecuencia puede actuar para desgasificar más el agua durante todo el experimento si se ejecuta paravarios minutos antes de muestrear sonicación. Este plazo inicial debe realizarse para obtener un medio de ultrasonidos relativamente desgasificado y resultados así consistentes durante los experimentos. Además, las células no se deben sonicaron en o cerca de la amplitud máxima en la evaluación de la eficacia de sonosensitizers, como la verdadera medida de la sensibilización sería difícil de evaluar. El uso de 33% de la amplitud en el sistema kHz 40 es un lugar ideal, ya que produce daño notable, pero ofrece sonosensitizers amplio espacio para demostrar su eficacia, como se ha demostrado con MeβCD contra U937 y células THP1 (Figura 7). Estos datos también confirman que MeβCD sensibiliza múltiples líneas de leucemia a ultrasonido de baja frecuencia de una manera dependiente de la dosis. Ha habido una serie de experimentos realizados con mayor frecuencia en el intervalo de 0,75 MHz a 8 MHz mostrando evidencia de burbujas de cavitación intramembrane siendo generado a través de sonicación 17-19. Sin embargo, Questions aún permanecen en lo que respecta a el mecanismo exacto de inducida por ultrasonidos lisis celular 18. Hemos demostrado un vínculo entre el citoesqueleto de fluidización y aumento de la sensibilidad sonic utilizando ultrasonido de baja frecuencia 15, un fenómeno demostrado por otros laboratorios 20, 21. Además, hemos encontrado que los agentes de microfilamentos de alteración tales como citocalasina B potencian la sensibilidad de ultrasonidos en la leucemia múltiple líneas, pero no hHSCs o leucocitos 22, lo que sugiere que la inhibición de la polimerización de actina pueden ser un mecanismo sonosensitizing de particular interés. También hemos observado que la vincristina, un agente de microtúbulos disruptores que inhibe la polimerización de tubulina 23, 24, aumenta notablemente la sensibilidad de ultrasonidos de diferentes tipos de leucemia in vitro incluyendo leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, y leucemia linfoide aguda. Por el contrario, los agentes del citoesqueleto-dirigida que estabilizan los componentes del citoesqueleto (una paclitaxeld jasplaquinolida) parece hacer que las células resistentes al tratamiento con ultrasonidos, se refleja en menores tasas de lisis celular 22. Tomados en conjunto, estos datos apoyan la hipótesis de que la fluidización de los componentes del citoesqueleto de las células neoplásicas es de hecho un factor importante en el aumento de la eficacia de SDT 25. El presente estudio también demuestra que el agotamiento de colesterol puede ser otro método por el cual para potenciar aún más la sensibilidad de ultrasonidos de células neoplásicas, como las células U937 tratadas con MeβCD están marcadamente sensibilizados a 40 kHz ultrasonido. Mientras que nuestros protocolos de sonicación han demostrado notable actividad antineoplásica in vitro, la metodología actual se limita a trabajar en modelos de cultivo y pequeños vertebrados que son capaces de encajar en los viales utilizados para ultrasonidos. Hemos demostrado que el pez cebra puede ser sonicado de forma segura utilizando pulsos de ultrasonido de baja frecuencia (20 kHz), y que su tolerancia a los agentes quimioterapéuticos es cuantitativamente comparable adosis toleradas por los modelos murinos, lo que sugiere 26 que el pez cebra portador de un tumor pueden ser utilizados en investigaciones preliminares para evaluar la actividad antineoplásica in vivo de estos protocolos. Sin embargo, la administración de agentes quimioterapéuticos antes de la sonicación de modelos de mamíferos ha sido reportado en el rango de 1 MHz, y tales protocolos probable puede ser ampliado para incorporar ultrasonido de baja frecuencia, así como el colesterol de ozono y agentes del citoesqueleto-dirigida. Aplicaciones clínicas potenciales de esta forma de SDT pueden implicar sonicación de sangre extracorpóreo en el que agentes antineoplásicos se administran por vía intravenosa (iv) antes de la sangre que son removidos por sonicación 25. Este método elimina posibles barreras de sonido planteados por la anatomía humana, y puede ser una manera eficaz para dañar blastos leucémicos, así como metástasis de tumores sólidos. También es posible que el colesterol de ozono y agentes del citoesqueleto dirigida podríausarse en protocolos HIFU que ya están siendo examinadas en la clínica en un intento de mejorar la eficacia de esta modalidad de tratamiento. Los métodos descritos en el presente estudio son capaces de evaluar el valor de sonosensitizers potenciales, y el perfeccionamiento del sistema puede mejorar esta utilidad. Sin embargo, hay muchas variables a tener en cuenta cuando se utiliza este tipo de legados ultrasónicas, incluyendo la calidad de suministro de energía, focos acústica, y la variación individual entre los convertidores. Por lo tanto, la investigación futura se centrará en la visualización de las ondas sonoras y la comprensión de su influencia en los resultados. SDT ha demostrado mejorar la lisis celular in vitro y puede llegar a ser clínicamente viable si hay más datos in vivo en modelos de mamíferos se adquieren. Los experimentos que examinan otras características potencialmente explotables de células malignas, así como diversas modalidades combinadas que participan múltiples agentes y ecografía continúan en nuestro laboratorio.

Ultrasonido se refiere a cualquier onda de presión de sonido oscilante con una frecuencia mayor que el límite superior de la capacidad auditiva humana (~ 20 kHz) 1. Ultrasonido de baja frecuencia en el intervalo de 20-60 kHz se ha utilizado en el laboratorio como un medio de generación de emulsiones, la preparación de muestras celulares para la extracción de ácido nucleico, para la interrupción del tejido, y para una variedad de otras pruebas. La utilidad de ultrasonido de baja frecuencia se ha extendido también a la configuración industrial para la soldadura, la limpieza de diversos materiales, y en el procesamiento de materiales. Comercialmente generadores de ultrasonido disponibles vienen en frecuencias que van desde 18 hasta 60 kHz, y en gran escala de potencias 100-1,200 W. Aunque la ecografía ha sido utilizado en el ámbito clínico para diagnóstico por imagen, se ha aplicado como una modalidad terapéutica sólo recientemente. Ultrasonido ≥1 MHz es capaz de interrumpir de forma segura los cálculos urinarios (piedras en el riñón) y cálculos biliares (piedras en ªe vesícula biliar o en el hígado) en pacientes para reducir los síntomas 2,3. Este enfoque conocido como litotricia extracorpórea (ESWL) actualmente se aplica ampliamente en la clínica (más de un millón de pacientes son tratados anualmente con ESWL en los Estados Unidos solamente 4), y ofrece una modalidad por la cual no invasiva romper los cálculos con daño colateral mínimo a través del uso de pulsos acústicos aplicado externamente, enfocado, de alta intensidad 2-4. Debido a las fuerzas de cizallamiento únicas directos, así como burbujas de cavitación generados por ultrasonidos de alta intensidad, estas metodologías han sido examinados en la terapia del cáncer para el tratamiento de carcinoma de próstata resistente a la castración y el adenocarcinoma de páncreas en un enfoque conocido como ultrasonido enfocado de alta intensidad (HIFU ) 5-8. De una manera muy similar a la LEOC, HIFU utiliza múltiples haces de ultrasonidos y los concentra en una esfera de actividad seleccionada para generar temperaturas de 60 ° C o higella a través de la utilización de la energía acústica, la inducción de necrosis coagulativa en el tejido diana 5. Aunque en la actualidad existen otras modalidades de ablación térmica (ablación por radiofrecuencia y la ablación por microondas), HIFU ofrece una clara ventaja sobre estos métodos en que es la única modalidad de hipertermia no invasiva 5. HIFU ha logrado resultados mixtos en la clínica y en la actualidad sólo está disponible en los ensayos clínicos 8-11. Sin embargo, el escaso éxito que ha logrado, y el muy prometedor datos in vivo adquiridos a partir de modelos de mamíferos preclínicos han demostrado el potencial de la ecografía en la terapia del cáncer. En un esfuerzo por mejorar HIFU, los investigadores han intentado combinar ultrasonido con agentes antineoplásicos apropiados para generar una forma de sonochemotherapy. Terapia Sonodynamic (SDT) es una novela modalidad de tratamiento prometedor que ha demostrado impresionante actividad antineoplásica en tanto in vitro como <em&gt; Estudios in vivo 1. Se ha demostrado que el ultrasonido preferentemente daños células malignas basados ​​en el tamaño diferencial entre tales células y los de histología normal 1,5. SDT incorpora agentes especializados conocidos como sonosensitizers para aumentar la extensión del daño preferencial ejercida por ultrasonido contra las células neoplásicas. Mientras que las aplicaciones terapéuticas de SDT se han examinado anteriormente, los sistemas ultrasónicos utilizados normalmente emplean más alta frecuencia de ultrasonido (≥1 MHz), y los efectos de baja frecuencia kHz ultrasonido aún no se ha explorado a fondo. Las frecuencias más bajas de ultrasonido a menudo son más eficientes en la producción de cavitación inercial, un fenómeno que resulta en la destrucción de las células debido al rápido colapso de microburbujas, la inducción de daño físico-12-14. Esta diferencia en la generación de cavitación inercial entre MHz y ultrasonido de baja kHz se ha atribuido al hecho de que las frecuencias de onda inferiores permiten microburbujass más tiempo para crecer por difusión rectificada en el ciclo de expansión media, en consecuencia producir colapsos más violentos durante el ciclo medio tras la compresión 12. Hemos demostrado previamente que las células de leucemia monocítica humana U937 son sensibles a los ultrasonidos de baja frecuencia (23,5 kHz), y que esta sensibilidad se puede incrementar notablemente mediante la aplicación de agentes antineoplásicos que perturban el citoesqueleto 15. Además, hemos demostrado que las células preferentemente se dañan basan en el tamaño, con células más grandes que exhiben una mayor sensibilidad ultrasónica. Además, las células humanas normales madre hematopoyéticas (hHSCs) y leucocitos en tamaños de celda comparables son mucho más resistentes a sonicación que sus contrapartes neoplásicas 15, lo que sugiere que tentativamente ultrasonido de baja frecuencia se puede utilizar para dañar preferentemente a las células malignas en la presencia de tejido normal. Para examinar más a fondo la hélice únicapropie- de ultrasonido de baja frecuencia para uso terapéutico potencial, se han desarrollado procedimientos de limpieza y de estabilización para aumentar la eficacia y la fiabilidad de uno de nuestros sistemas de sonicación actuales, el Branson Modelo SLPe 150 W, 40 kHz Cell Disrupter, equipado con un cuerno de 20 mm equipado en una taza de 7,62 cm. Además, hemos sido capaces de determinar las energías precisas muestra de cavitación, así como formas de onda consistentes y amplitud dentro del rango de 40 kHz usando un medidor de cavitación y el osciloscopio con hidrófono. Por refinación y sistematizar nuestros protocolos, hemos sido capaces de establecer la coherencia de nuestros sonicaciones experimentales, lo que nos permite comparar cuantitativamente las sensibilidades sonoras de las células neoplásicas y normales de diferentes linajes histogenéticos. Nuestro protocolo para el sistema de 40 kHz se presenta en extenso detalle para que los laboratorios interesados ​​para ser capaz de realizar experimentos comparables, y evaluar nuestros resultados de los efectos antineoplásicos provocados porultrasonido de baja frecuencia. Además, se examinan los efectos de dosis dependientes de metil-β-ciclodextrina (MeβCD; Figura 1), un agente de colesterol de ozono, en el aumento de la sensibilidad de ultrasonidos de U937 y THP1 células de leucemia monocítica humana.

<table><tbody><tr><td>Medio de Dulbecco modificado de Iscove con NaHCO3 y Hepes de 25 mM&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12440079</td><td></td></tr><tr><td>Solución de anfotericina B&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina 100x Solución &nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12105</td><td></td></tr><tr><td>Branson SLPe 40kHz Disruptor de células con 3" (25mm) Cuphorn</td><td>Branson Ultrasonics</td><td>101-063-726</td><td>dispositivo de sonicación</td></tr><tr><td>Brisk Heat SDC Benchtop Digital Temperature Controler con 1000 ml Calentador de vasos de precipitados</td><td>Brisk Heat</td><td>SDCJF1A-GBH1000-1</td><td>utilizado para el control de temperatura</td></tr><tr><td>Calibrador de celdas Beckman-Coulter Z2 con AccuComp&reg; Software</td><td>Beckman-Coulter</td><td>6605700</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad TC20 Contador Celular Automatizado</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0102</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina 50 mg/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Solución Azul de Trypan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml & 25 ml Matraces de Cultivo Ventilados</td><td>Fisher Scientific</td><td>353082</td><td></td></tr><tr><td>Lonza L-Glutamina 200 mM 0.85% NaCl</td><td>Lonza</td><td>17-605C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Seal-Rite 1,5 ml Tubos de microcentrífuga</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5510</td><td></td></tr><tr><td>Beckman-Coulter Accuvette ST 25 ml Viales y tapones</td><td>Beckman-Coulter</td><td>&nbsp; A35473</td><td></td></tr><tr><td>AccuJet Pro Auto Pipet&nbsp;</td><td>BrandTech Scientific</td><td>26330</td><td></td></tr><tr><td>USA Scientific 10 ml Pipetas Serológicas Desechables</td><td>USA Scientific</td><td>1071-0810</td><td></td></tr><tr><td>Tip One 100 &#956; l y 1.000 &#956; l Puntas de filtro USA</td><td>Scientific</td><td>1120-1840, 1126-7810</td><td></td></tr><tr><td>100 &#956; l Micropipeta&nbsp;</td><td>Wheaton</td><td>851164</td><td></td></tr><tr><td>1.000 &#956; l Micropipeta</td><td>Wheaton</td><td>851168</td><td></td></tr><tr><td>BioRad Portaobjetos de conteo de doble cámara</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0015</td><td></td></tr><tr><td>Forma Scientific Incubadora con camisa de agua de doble cámara</td><td>Forma Scientific</td><td>3131</td><td></td></tr><tr><td>Tektronix&nbsp; Osciloscopio de fósforo digital DPO 2002B</td><td>Tektronix</td><td>DPO2002B</td><td>utiliza para medir la forma de onda ultrasónica</td></tr><tr><td>PPB MegaSonics modelo PB-500 Medidor de energía ultrasónico</td><td>PPB Megasonics</td><td>PB-500 &nbsp;</td><td>utilizado para evaluar la intensidad sonora en W/cm2</td></tr><tr><td>Teledyne RESON TC4013-1 Hidrófono</td><td>Teledyne</td><td>TC4013-1&nbsp;</td><td>se conecta al osciloscopio&nbsp;</td></tr><tr><td>Wheaton 250 ml Frascos</td><td>Sigma-Aldrich Z364827</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ml Viales de centelleo de vidrio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z190527</td><td></td></tr><tr><td>Beckman-Coulter solución salina isotónica &nbsp;</td><td>Beckman-Coulter</td><td>N/A</td><td>diluyente para Z2 contador</td></tr><tr><td>Cloroformo 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 Prueba Anhidro&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XTT Kit de ensayo de proliferación celular</td><td>ATCC</td><td>30-1011K</td><td></td></tr><tr><td>Lector de microplacas de 96 pocillos</td><td>Cole-Palmer</td><td>&nbsp; EW-13055-54</td><td></td></tr><tr><td>U937 Células de leucemia monocítica humana</td><td>ATCC</td><td>CRL&shy; 1593.2</td><td></td></tr><tr><td>THP1 Células de leucemia monocítica humana</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr></tbody></table>

generación y análisis cuantitativo de pulsos de baja frecuencia de ultrasonido para determinar la sensibilidad de sonic de tratados y no tratados células neoplásicas

Generation and Quantitative Analysis of Pulsed Low Frequency Ultrasound to Determine the Sonic Sensitivity of Untreated and Treated Neoplastic Cells

El ultrasonido de baja frecuencia en el rango de 20 a 60 kHz es una nueva modalidad física para inducir la lisis celular selectiva y la muerte en células neoplásicas. Además, este método se puede utilizar en combinación con agentes especializados conocidos como sonosensibilizadores para aumentar el grado de daño preferencial ejercido por el ultrasonido contra las células neoplásicas, un enfoque conocido como terapia sonodinámica (SDT). Se presenta la metodología para generar y aplicar ultrasonidos de baja frecuencia en un entorno preclínico in vitro con el fin de demostrar que se puede lograr una destrucción celular reproducible con el fin de examinar y comparar los efectos de la sonicación en células neoplásicas y normales. Esto ofrece un medio para sonicar de forma fiable las células neoplásicas con el nivel de consistencia necesario para la evaluación terapéutica preclínica. Además, se discuten los efectos de los agentes destructores del colesterol y dirigidos al citoesqueleto en la potenciación de la sensibilidad ultrasónica en células neoplásicas con el fin de profundizar en los mecanismos de acción conducentes a los enfoques sonochemoterapéuticos.

La estabilidad del sistema es de suma importancia en la obtención de resultados repetibles y confiables. La especificación de par de apriete correcto de 54,23 N. M logra acoplamiento adecuado del transductor y sonotrodo 2, con la consistencia de la forma de onda que se evalúa mediante el uso de un osciloscopio y hidrófono (Figura 3A). Figura 3B representa las mediciones en el interior del vial de muestra, y Figura 3C evalúa la estabilidad dentro de la trompa taza. Como era de esperar, la amplitud se redujo ligeramente debido a un poco de energía sea absorbida por el vidrio. Sin embargo, la forma de onda no fue perturbado o distorsionada, ya sea en el panel B o C, que es necesaria para la entrega fiable de energía sónica a la muestra. Una forma de onda que no aparece como una onda sinusoidal singular clara indica un transductor defectuoso o instalación incorrecta. Esto se expresa en la figura 3D que muestra múltiples olas aberrantes, una clara ausencia de una onda sinusoidal, y una frecuencia de lectura sint espera con un sistema que funcione correctamente. El medidor de cavitación utilizado para medir la energía de cavitación generada (Figura 4) encontró la intensidad del sonido a ser 100-110 W / cm 2 a 33% de la amplitud, y 125-130 W / cm 2 a 50% de la amplitud. Una vez que el sistema de 40 kHz fue calibrado y montado en su totalidad (Figura 5) apropiadamente, la destrucción de células fiable se logró fácilmente, como se determina tanto por los contadores de TC 20 y Z2 (Figura 6). Como era de esperar, se observó más extenso daño celular en las poblaciones de células sonicadas a 50%, en lugar de a 33% de la amplitud. Sin embargo, 33% de la amplitud es útil como punto de partida para detectar posibles efectos sensibilizadores sónica de agentes administrados, ya que produce daño notable, pero deja espacio para más daño a ser detectada cuando se aplican agentes para evaluar su potenciación de la sensibilidad ultrasónica. Esto se demuestra en la Figura 7A, donde else presentan los efectos dependientes de la dosis de MeβCD en la potenciación de la sensibilidad de ultrasonidos de células U937. Aunque las células tratadas con MeβCD no sonicados fueron muy similares en la viabilidad de las células no sonicado, no tratados, la viabilidad se redujo marcadamente después de tres pulsos de 1 seg 40 kHz ultrasonido fue aplicado. Además, la disminución de la viabilidad después de la sonicación parece haber sido dependiente de la dosis, como 5 mM MeβCD produjo la mayor caída en el recuento de células, seguido de 1 mM, y luego mM MeβCD 0.5. Se observaron efectos similares sobre la viabilidad celular y la actividad mitocondrial en las células U937 y THP1 que fueron tratados con concentraciones variables de MeβCD antes de la sonicación, tal como se evaluó con el kit de XTT (Figura 7B). Aunque THP1 células parecen ser ligeramente más resistente que las células U937 sonic, ambas líneas de leucemia humana se dañan en una manera dependiente de la dosis. Las concentraciones más altas de MeβCD y más pulsos de ultrasonido produced la menor reducción de XTT a un derivado soluble de naranja, colores brillantes tanto para U937 y THP1 células, correspondiente a reducir la viabilidad celular y la actividad mitocondrial. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig1.jpg" /> Figura 1. Estructura molecular de metil- β-ciclodextrina. (A) estructura completa de metil-β-ciclodextrina (MeβCD). (B) MeβCD es un polímero de siete unidades de repetición con un grupo R de H o CH 3. Fórmula molecular: C 56 H 98 O 35. Peso molecular = 1331.36. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig2.jpg" /> Figura 2. torqueing correctamente el sistema de ultrasonido 40 kHz. (A) El cuerno y el convertidor se eliminan de la pri tazao para torqueing. (B) Coloque la llave de la ranura y la llave de torsión en sus respectivas posiciones. (C) Aplicar 54.23 N. M de par motor en sentido horario antes de volver a colocar la bocina y el convertidor a la taza. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig3.jpg" /> Figura 3. Uso de un osciloscopio para caracterizar la forma de onda del sistema ultrasónico. (A) Un osciloscopio con hidrófono se puede utilizar para evaluar la consistencia de amplitud y forma de onda. De grabación (B) Un tomada con la copa directamente por encima de la bocina en 1,5 cm y se fijó en 33% de la amplitud. (C) La forma de onda se muestra aquí es de una lectura adquirida cuando el hidrófono se coloca dentro de la 20 ml vial de centelleo de vidrio. El vial se sitúa en 1,5 cm por encima de la bocina y de nuevo ha fijado en 33% de la amplitud. (D) Un osciloscopio pantalla osistema de fa con frecuencias aberrantes como cabría esperar de un sistema defectuoso o acoplamiento incorrecto de la unión convertidor bocina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53060/53060fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig4.jpg" /> Figura 4. El uso de un medidor de cavitación para caracterizar la intensidad del sonido del sistema ultrasónico. El metro cavitación se ve aquí se utiliza para representar la energía cavitación en W / cm2. Este es un instrumento muy importante para evaluar la consistencia de la energía con respecto a la muestra. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig5.jpg" /> Figura 5. Los componentes clave del sistema de ultrasonido 40 kHz. El sistema ultrasónico se muestra completa con el cuerno taza ( <strong&gt; A), aparato de calentamiento (B), el convertidor (C), y el mecanismo de posicionamiento de la muestra (D). Este diseño permite un fácil posicionamiento de la muestra (E) por encima del cuerno (F). <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig6.jpg" /> Figura 6. Efectos de diferentes niveles de amplitud en la lisis por ultrasonidos de células U937 utilizando los contadores de TC 20 y Z2. Las células se sonicaron con el Dismembrator 40 kHz celular en 33% de la amplitud (100-110 W / cm 2) o 50% de la amplitud (125-130 W / cm 2), utilizando tres pulsos de 1 seg de ultrasonido, con 1 seg espaciamiento entre cada de estos pulsos. (A) Una captura de pantalla desde el software contador Z2 demuestra el efecto de la sonicación en células U937. (B) Los datos del contador TC 20 fueron compilados en un gráfico para demostrar la reproducibilidad de los resultadoss. Estos datos incluyen los recuentos de células totales y en vivo, así como el azul de tripano evaluó la viabilidad celular. Bares reflejan el error estándar de la media (SEM) para 4 poblaciones de células independientes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53060/53060fig6large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig7.jpg" /> Figura 7. Efectos de metil- β-ciclodextrina en la potenciación de la sensibilidad ultrasónica de U937 y células THP1. (A) células U937 se trataron con concentraciones variables de MeβCD durante 30 min antes de ser sonicado con 40 kHz ultrasonido (105 W / cm 2 ) utilizando tres pulsos de 1 seg 1 seg espaciados aparte. Las poblaciones de células se agruparon en ≥12 my ≥17 micras. (B) células U937 o THP1 fueron tratados de nuevo con diferentes concentraciones de MeβCD durante 30 min antes de ser sonicado con el sistema de 40 kHz usando 1-3 pulsos de ultrasonido 1 seg 1 seg espaciadas aparte. La viabilidad celular y la actividad mitocondrial fueron evaluados con el kit de XTT. 100 l de células se sembraron por pocillo en una placa de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos. La placa se incubó durante 24 h antes de la adición de solución de XTT. Las células se incubaron entonces durante 2 horas más antes de que se lea la longitud de onda. Bares reflejan SEM para 4 poblaciones de células independientes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53060/53060fig7large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

El daño selectivo de las células leucémicas humanas se puede lograr mediante un enfoque novedoso de aplicación de ultrasonido de baja frecuencia con y sin pretratamiento quimioterapéutico de células leucémicas y hematopoyéticas normales.

Generación y Análisis Cuantitativo de pulsos de baja frecuencia de ultrasonido para determinar la sensibilidad de Sonic de tratados y no tratados células neoplásicas

Low frequency ultrasound in the 20 to 60 kHz range is a novel physical modality by which to induce selective cell lysis and death in neoplastic cells. In ...

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar la eficacia y la reproducibilidad del ultrasonido pulsátil de baja frecuencia en el daño de poblaciones de células leucémicas humanas en ausencia o presencia de un agente desplector de colesterol. Esto se logra limpiando el sistema de sonicación y evaluando su estabilidad. Luego, las células leucémicas humanas se someten a sonicación en ausencia y en presencia de metil beta ciclodextrina.A continuación, se utilizan contadores automáticos de células para evaluar la viabilidad celular y los efectos de la sonicación y el agotamiento de colesterol. La actividad mitocondrial de las células leucémicas se evalúa mediante el ensayo XTT. En última instancia, los datos sugieren que el ultrasonido de baja frecuencia podría utilizarse para dañar células malignas, lo cual se potencia con el uso de un agente desprovisto de colesterol.Nuestro laboratorio tiene interés en la terapia de namp sonar, una modalidad terapéutica novedosa que combina los efectos anti-neoplásicos del ultrasonido con agentes especializados para amplificar los efectos del son. Nuestro protocolo evalúa la sensibilidad sónica tanto de células neoplásicas como normales para determinar posibles enfoques quimioterapéuticos que merezcan una investigación preclínica adicional. En general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades con el equipo utilizado para evaluar la estabilidad del sistema so, ya que puede llevar cierto tiempo aprender a aplicar óptimamente esos dispositivos.La demostración visual de este método es fundamental, ya que los procedimientos de limpieza y estabilización utilizados para evaluar el sistema de sonicación son imprescindibles para obtener resultados reproducibles. Antes de comenzar un experimento, utilice cloroformo y una torunda de algodón para limpiar la unión entre la punta y el convertidor. A continuación, aplique una capa ligera de aceite sobre las roscas de la punta y el convertidor.Para eliminar cualquier viruta de metal, óxido o acumulación de oxidación, y luego retirar el aceite y cualquier otro contaminante de la unión con más cloroformo, vuelva a colocar el cuerno en el convertidor. Para ajustar adecuadamente el par del sistema, saque el cuerno desde la parte inferior del vaso y coloque una llave de ranura dentro de uno de los tres pequeños orificios cercanos a la parte superior del convertidor. Ahora, coloque una llave de torque equipada con una llave de gancho de media pulgada en la parte ranurada del cuerno y apriete en sentido horario estándar hasta que el medidor de par indique 39,99 libras-pie.Después de apretar, coloque el convertidor y el cuerno nuevamente en el vaso y monte las piezas en un soporte con anillos en posición vertical, vuelva a conectar el convertidor a la fuente de alimentación y luego configure el sistema para dosificación por pulsos. Utilizando un segundo de sonicación con un segundo entre pulsos, ajuste luego el sistema a las amplitudes deseadas para evaluar la intensidad y el funcionamiento del sistema Sauna Fire. Comience sosteniendo el medidor de cavitación a 1,5 centímetros, teniendo cuidado de que no haya burbujas presentes en la superficie de la sonda del medidor.Lea la pantalla del medidor de cavitación para confirmar que el sistema está funcionando con la intensidad adecuada. A continuación, sumerja completamente el sensor del hidrófono en un vial de muestra que contenga 12,5 mililitros de agua, y utilice el soporte de anillos para suspender el hidrófono. Para confirmar la estabilidad de las características de la forma de onda, conecte el hidrófono a la entrada del osciloscopio y verifique la presencia de una onda sinusoidal clara, ya que las ondas anómalas pueden alterar la frecuencia del sistema.Para preparar las células para la sonicación, primero siémbralas a una concentración de cuatro veces 10 a la cuarta células por mililitro en un matraz de 25 centímetros cuadrados utilizando medio recién preparado. Después de determinar el número de células viables mediante exclusión con azul de tripano, incuba el cultivo a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono hasta que el cultivo alcance la concentración deseada. Cuando las células estén listas para la sonicación, utiliza una bomba de vacío y un matraz de Büchner para desgasificar un volumen de agua destilada desionizada.Luego, use el agua para llenar el cuerno del vaso hasta 15 milímetros por encima del borde del cuerno. Haga funcionar el sistema con el agua desgasificada durante aproximadamente siete minutos. A continuación, transfiera tres mililitros de células a un vial de centelleo de vidrio de 20 mililitros y fije el vial al dispositivo de sujeción.A continuación, fije el dispositivo de sujeción en la parte superior del cuerno de copa y utilice el mecanismo deslizante para ajustar el dispositivo de sujeción a una elevación de 15 milímetros desde la parte superior del cuerno, a la altura de la superficie del agua. Ahora, sonique las células utilizando tres pulsos de un segundo de ultrasonido con un intervalo de un segundo entre cada pulso, a una amplitud del 33 y el 50 %, y evalúe la viabilidad celular después de la sonicación mediante exclusión con azul de tripano. Para evaluar el daño celular, enjuague la abertura de un analizador de partículas Z2 al menos dos veces con solución salina isotónica.A continuación, agregue 100 microlitros de las células sonicadas a 20 mililitros de solución salina isotónica y transfiera la muestra celular al soporte del contador. Luego eleve la plataforma hasta la abertura y analice el daño celular, la viabilidad y los restos celulares según las instrucciones del fabricante. Para evaluar la viabilidad de las células sonicadas mediante el ensayo XTT, sonique las células utilizando un rango de uno a tres.Pulsos de un segundo separados por un segundo para inducir un rango de daño que el kit XTT pueda evaluar; luego centrifugar las células y resuspender los pellet en un volumen igual a una vez 10 a la quinta células por mililitro en medio de crecimiento recién preparado. A continuación, sembrar 100 microlitros de células por pocillo en placas individuales de 96 pocillos con fondo plano, en triplicado, incluyendo tres pocillos control que contengan únicamente 100 microlitros de medio de crecimiento completo para las lecturas de absorbancia en blanco.Incube las células durante 24 horas por la mañana del día del ensayo; agite suavemente alícuotas de 37 grados Celsius del reactivo XTT y del reactivo de activación calentados hasta que las soluciones estén claras. Luego, agregue 0,1 mililitros del reactivo de activación a cinco mililitros de la solución Eloqua del reactivo XTT. A continuación, agregue 50 microlitros de la solución XTT activada a cada pocillo de las placas inoculadas con U 9 37 y THP uno y devuelva las células al incubador de cultivo celular.Después de dos horas, agite suavemente las placas para distribuir uniformemente el colorante naranja en los pocillos positivos y mida la absorbancia en un lector de placas microtituladoras entre 450 y 500 nanómetros. Finalmente, mida nuevamente la absorbancia de todos los pocillos del ensayo entre 630 y 690 nanómetros. Como era de esperar, se observa un daño celular más extenso en la población celular sometida a sonicación al 50 % que al 33 % de amplitud.La amplitud del 33 %, sin embargo, permite la detección de daños adicionales cuando se aplican agentes. Como en este experimento, en el que se evaluaron los efectos dependientes de la dosis del agente desplector de colesterol metil beta ciclodextrina sobre la potenciación de la sensibilidad ultrasónica de las células U 9 37.Aunque las células tratadas con metil beta ciclodextrina no tuvieron viabilidad similar a las células no tratadas, la viabilidad disminuyó notablemente tras aplicar tres pulsos de un segundo de ultrasonido a 40 kilohercios. Además, la disminución de la viabilidad tras la sonicación parece haber sido dependiente de la dosis, ya que cinco milimolares del agente desplecionador de colesterol produjeron la mayor caída en el recuento celular, seguidos de tratamientos con uno milimolar y 0,5 milimolar de metil beta ciclodextrina, según se evaluó mediante el ensayo XTT. Aunque las células THP-1 parecieron ser ligeramente más resistentes a la sonicación que las células U-937, ambas líneas celulares de leucemia humana resultaron dañadas de manera dependiente de la dosis.Además, la combinación de concentraciones más altas de metil beta ciclodextrina con un mayor número de pulsos de ultrasonido produjo la menor reducción de XTT a un derivado soluble de color naranja brillante tanto en las células U 9 37 como en las THP 1, lo que corresponde a una viabilidad celular y actividad mitocondrial más baja para ambas líneas celulares. Siguiendo este procedimiento, se pueden evaluar otros agentes sensibilizantes al sonido, como agentes que actúan sobre el citoesqueleto o que producen especies reactivas, en cuanto a su potenciación de la sensibilidad sónica, estableciendo así nuevos enfoques terapéuticos que pueden investigarse por su eficacia pleoclínica. Al intentar este procedimiento, es importante recordar organizar adecuadamente los datos de SON obtenidos de los contadores TC y Z 2, ya que proporcionan información detallada sobre la eficacia del protocolo de tratamiento que podría perderse.Si no se utiliza ningún esquema logístico, después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar ultrasonidos de baja frecuencia en combinación con posibles sensibilizadores ano en modelos preclínicos in vitro para evaluar su potencial utilidad terapéutica.

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Insonación de microburbujas es una estrategia prometedora para la ablación del tumor en un promedio de reducción de tiempo de potencias acústicas, así como para la distribución selectiva de la terapéutica. El propósito del presente estudio es desarrollar estrategias de ultrasonido de baja deber ciclo de pulsación y nanotransportadores para maximizar no de ablación térmica microvascular y la entrega a la carga por vía subcutánea C6 gliomas.

Ecografía de contraste dirigidos tratamiento de los gliomas en ratones a través de la entrega de nanopartículas de drogas y la ablación Teniendo microvascular

Este protocolo describe la estimulación de los fibroblastos cultivados con ultrasonido pulsado de baja intensidad, que impulsa la formación de adherencias de coordinación y activación de Rac1 imitando la participación de los receptores transmembrana de la matriz, sindecano-4. Este enfoque permite la investigación de una técnica exitosa clínica en el nivel celular, proporcionando oportunidades para el perfeccionamiento de la terapia.

La inducción de señales de adhesión dependientes de Uso de ultrasonido de baja intensidad

Este video describe el daño selectivo de las células de leucemia humana mediante el uso de ultrasonido de baja frecuencia. Esta aplicación de ultrasonidos de baja frecuencia en una condición preclínica in vitro demuestra que la destrucción celular puede lograrse para examinar y comparar los efectos de la sonicación en la leucemia y las células normales.

Aplicación de ultrasonido de baja frecuencia: un método para determinar el efecto de la sonicación en las células de leucemia humana

Este artículo describe el protocolo para el ensayo XTT, que es un ensayo colorimétrico para evaluar la viabilidad celular y la actividad mitocondrial.

Ensayo XTT: un ensayo colorimétrico para evaluar la viabilidad celular y la actividad mitocondrial

Este protocolo describe la aplicación de ultrasonidos de alta frecuencia (HFUs) para obtener imágenes del ratón ganglios linfáticos cervicales. Esta técnica optimiza la visualización y cuantificación de la morfología de ganglio linfático cervical, el volumen y el flujo de sangre. Biopsia guiada por imágenes de los ganglios linfáticos y el procesamiento de tejido linfático para la evaluación histológica del cuello del útero también se demuestra.

Alta frecuencia de imágenes por ultrasonido del mouse ganglios linfáticos cervicales

Los campos de tratamiento tumoral (TTFields) son una modalidad eficaz de tratamiento antitumoral administrada mediante la aplicación continua y no invasiva de campos eléctricos alternados de baja intensidad e intermedia. La aplicación de TTFields a líneas celulares usando un sistema de aplicación in vitro TTFields permite la determinación de la frecuencia óptima que conduce a la reducción más alta en el recuento celular.

Determinar la frecuencia inhibidora óptima para las células cancerosas Usando Tumor Tratamiento Fields (TTFields)

Aquí describimos la técnica de ultrasonido de alta frecuencia para el análisis en vivo de fetos de ratones. Este método permite el seguimiento de los fetos y el análisis de parámetros placentarios, así como el flujo de sangre materna y fetal durante el embarazo.

Ultrasonido de alta frecuencia para el análisis del desarrollo Fetal y placentario en Vivo

Estimulación de ultrasonido pulsado (LIPUS) de baja intensidad es una modalidad de estimulación mecánica no invasiva de células endógenas o ingeniería con alta resolución espacial y temporal. Este artículo describe cómo implementar LIPUS a un microscopio de epifluorescencia y cómo minimizar el desajuste de impedancia acústica en el camino de ultrasonido para evitar artefactos mecánicos no deseados.

La multiplexación enfocada ultrasonido estimulación con microscopía de fluorescencia

La barrera hematoencefálica (BBB) se puede interrumpir temporalmente con ultrasonido enfocado mediado por microburbujas (FUS). Aquí, describimos un protocolo paso a paso para la apertura de BBB de alto rendimiento in vivo utilizando un sistema FUS modular accesible para expertos que no son de ultrasonido.

Un Alto Rendimiento De Imagen Guiada Por Neuronavegación Estereotáctica Y Sistema De Ultrasonido Enfocado Para La Apertura De La Barrera Hematoencefálica En Roedores

El protocolo experimental presentado se puede utilizar para realizar medidas en tiempo real de la actividad de cavitación en un dispositivo de cultivo celular con el objetivo de permitir la investigación de las condiciones requeridas para la administración exitosa de fármacos y / u otros bioefectos.

Estudio de la terapia mejorada de cavitación

El melanoma es una enfermedad muy agresiva que se propaga rápidamente a otros órganos. Este protocolo describe la aplicación de imágenes de ultrasonido de frecuencia ultra alta, junto con la representación 3D, para monitorear el volumen de los ganglios linfáticos inguinales en el modelo de ratón Braf / Pten de melanoma metastásico.

Análisis del volumen de los ganglios linfáticos mediante imágenes de ultrasonido de frecuencia ultra alta en el modelo de melanoma de ratón genéticamente modificado braf/pten

Aprende a evaluar la eficacia del ultrasonido de baja frecuencia en células leucémicas humanas usando methyl beta cyclodextrin. Este método permite analizar la viabilidad celular mediante conteo automatizado y ensayo XTT.

Generación y Análisis Cuantitativo de pulsos de baja frecuencia de ultrasonido para determinar la sensibilidad de Sonic de tratados y no tratados células neoplásicas (Video) | JoVE Journal

Generación y Análisis Cuantitativo de pulsos de baja frecuencia de ultrasonido para determinar la sensibilidad de Sonic de tratados y no tratados células neoplásicas

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