Generación y Análisis Cuantitativo de pulsos de baja frecuencia de ultrasonido para determinar la sensibilidad de Sonic de tratados y no tratados células neoplásicas

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar la eficacia y la reproducibilidad del ultrasonido pulsátil de baja frecuencia en el daño de poblaciones de células leucémicas humanas en ausencia o presencia de un agente desplector de colesterol. Esto se logra limpiando el sistema de sonicación y evaluando su estabilidad. Luego, las células leucémicas humanas se someten a sonicación en ausencia y en presencia de metil beta ciclodextrina.

A continuación, se utilizan contadores automáticos de células para evaluar la viabilidad celular y los efectos de la sonicación y el agotamiento de colesterol. La actividad mitocondrial de las células leucémicas se evalúa mediante el ensayo XTT. En última instancia, los datos sugieren que el ultrasonido de baja frecuencia podría utilizarse para dañar células malignas, lo cual se potencia con el uso de un agente desprovisto de colesterol.

Nuestro laboratorio tiene interés en la terapia de namp sonar, una modalidad terapéutica novedosa que combina los efectos anti-neoplásicos del ultrasonido con agentes especializados para amplificar los efectos del son. Nuestro protocolo evalúa la sensibilidad sónica tanto de células neoplásicas como normales para determinar posibles enfoques quimioterapéuticos que merezcan una investigación preclínica adicional. En general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades con el equipo utilizado para evaluar la estabilidad del sistema so, ya que puede llevar cierto tiempo aprender a aplicar óptimamente esos dispositivos.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los procedimientos de limpieza y estabilización utilizados para evaluar el sistema de sonicación son imprescindibles para obtener resultados reproducibles. Antes de comenzar un experimento, utilice cloroformo y una torunda de algodón para limpiar la unión entre la punta y el convertidor. A continuación, aplique una capa ligera de aceite sobre las roscas de la punta y el convertidor.

Para eliminar cualquier viruta de metal, óxido o acumulación de oxidación, y luego retirar el aceite y cualquier otro contaminante de la unión con más cloroformo, vuelva a colocar el cuerno en el convertidor. Para ajustar adecuadamente el par del sistema, saque el cuerno desde la parte inferior del vaso y coloque una llave de ranura dentro de uno de los tres pequeños orificios cercanos a la parte superior del convertidor. Ahora, coloque una llave de torque equipada con una llave de gancho de media pulgada en la parte ranurada del cuerno y apriete en sentido horario estándar hasta que el medidor de par indique 39,99 libras-pie.

Después de apretar, coloque el convertidor y el cuerno nuevamente en el vaso y monte las piezas en un soporte con anillos en posición vertical, vuelva a conectar el convertidor a la fuente de alimentación y luego configure el sistema para dosificación por pulsos. Utilizando un segundo de sonicación con un segundo entre pulsos, ajuste luego el sistema a las amplitudes deseadas para evaluar la intensidad y el funcionamiento del sistema Sauna Fire. Comience sosteniendo el medidor de cavitación a 1,5 centímetros, teniendo cuidado de que no haya burbujas presentes en la superficie de la sonda del medidor.

Lea la pantalla del medidor de cavitación para confirmar que el sistema está funcionando con la intensidad adecuada. A continuación, sumerja completamente el sensor del hidrófono en un vial de muestra que contenga 12,5 mililitros de agua, y utilice el soporte de anillos para suspender el hidrófono. Para confirmar la estabilidad de las características de la forma de onda, conecte el hidrófono a la entrada del osciloscopio y verifique la presencia de una onda sinusoidal clara, ya que las ondas anómalas pueden alterar la frecuencia del sistema.

Para preparar las células para la sonicación, primero siémbralas a una concentración de cuatro veces 10 a la cuarta células por mililitro en un matraz de 25 centímetros cuadrados utilizando medio recién preparado. Después de determinar el número de células viables mediante exclusión con azul de tripano, incuba el cultivo a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono hasta que el cultivo alcance la concentración deseada. Cuando las células estén listas para la sonicación, utiliza una bomba de vacío y un matraz de Büchner para desgasificar un volumen de agua destilada desionizada.

Luego, use el agua para llenar el cuerno del vaso hasta 15 milímetros por encima del borde del cuerno. Haga funcionar el sistema con el agua desgasificada durante aproximadamente siete minutos. A continuación, transfiera tres mililitros de células a un vial de centelleo de vidrio de 20 mililitros y fije el vial al dispositivo de sujeción.

A continuación, fije el dispositivo de sujeción en la parte superior del cuerno de copa y utilice el mecanismo deslizante para ajustar el dispositivo de sujeción a una elevación de 15 milímetros desde la parte superior del cuerno, a la altura de la superficie del agua. Ahora, sonique las células utilizando tres pulsos de un segundo de ultrasonido con un intervalo de un segundo entre cada pulso, a una amplitud del 33 y el 50 %, y evalúe la viabilidad celular después de la sonicación mediante exclusión con azul de tripano. Para evaluar el daño celular, enjuague la abertura de un analizador de partículas Z2 al menos dos veces con solución salina isotónica.

A continuación, agregue 100 microlitros de las células sonicadas a 20 mililitros de solución salina isotónica y transfiera la muestra celular al soporte del contador. Luego eleve la plataforma hasta la abertura y analice el daño celular, la viabilidad y los restos celulares según las instrucciones del fabricante. Para evaluar la viabilidad de las células sonicadas mediante el ensayo XTT, sonique las células utilizando un rango de uno a tres.

Pulsos de un segundo separados por un segundo para inducir un rango de daño que el kit XTT pueda evaluar; luego centrifugar las células y resuspender los pellet en un volumen igual a una vez 10 a la quinta células por mililitro en medio de crecimiento recién preparado. A continuación, sembrar 100 microlitros de células por pocillo en placas individuales de 96 pocillos con fondo plano, en triplicado, incluyendo tres pocillos control que contengan únicamente 100 microlitros de medio de crecimiento completo para las lecturas de absorbancia en blanco.

Incube las células durante 24 horas por la mañana del día del ensayo; agite suavemente alícuotas de 37 grados Celsius del reactivo XTT y del reactivo de activación calentados hasta que las soluciones estén claras. Luego, agregue 0,1 mililitros del reactivo de activación a cinco mililitros de la solución Eloqua del reactivo XTT. A continuación, agregue 50 microlitros de la solución XTT activada a cada pocillo de las placas inoculadas con U 9 37 y THP uno y devuelva las células al incubador de cultivo celular.

Después de dos horas, agite suavemente las placas para distribuir uniformemente el colorante naranja en los pocillos positivos y mida la absorbancia en un lector de placas microtituladoras entre 450 y 500 nanómetros. Finalmente, mida nuevamente la absorbancia de todos los pocillos del ensayo entre 630 y 690 nanómetros. Como era de esperar, se observa un daño celular más extenso en la población celular sometida a sonicación al 50 % que al 33 % de amplitud.

La amplitud del 33 %, sin embargo, permite la detección de daños adicionales cuando se aplican agentes. Como en este experimento, en el que se evaluaron los efectos dependientes de la dosis del agente desplector de colesterol metil beta ciclodextrina sobre la potenciación de la sensibilidad ultrasónica de las células U 9 37.

Aunque las células tratadas con metil beta ciclodextrina no tuvieron viabilidad similar a las células no tratadas, la viabilidad disminuyó notablemente tras aplicar tres pulsos de un segundo de ultrasonido a 40 kilohercios. Además, la disminución de la viabilidad tras la sonicación parece haber sido dependiente de la dosis, ya que cinco milimolares del agente desplecionador de colesterol produjeron la mayor caída en el recuento celular, seguidos de tratamientos con uno milimolar y 0,5 milimolar de metil beta ciclodextrina, según se evaluó mediante el ensayo XTT. Aunque las células THP-1 parecieron ser ligeramente más resistentes a la sonicación que las células U-937, ambas líneas celulares de leucemia humana resultaron dañadas de manera dependiente de la dosis.

Además, la combinación de concentraciones más altas de metil beta ciclodextrina con un mayor número de pulsos de ultrasonido produjo la menor reducción de XTT a un derivado soluble de color naranja brillante tanto en las células U 9 37 como en las THP 1, lo que corresponde a una viabilidad celular y actividad mitocondrial más baja para ambas líneas celulares. Siguiendo este procedimiento, se pueden evaluar otros agentes sensibilizantes al sonido, como agentes que actúan sobre el citoesqueleto o que producen especies reactivas, en cuanto a su potenciación de la sensibilidad sónica, estableciendo así nuevos enfoques terapéuticos que pueden investigarse por su eficacia pleoclínica. Al intentar este procedimiento, es importante recordar organizar adecuadamente los datos de SON obtenidos de los contadores TC y Z 2, ya que proporcionan información detallada sobre la eficacia del protocolo de tratamiento que podría perderse.

Si no se utiliza ningún esquema logístico, después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar ultrasonidos de baja frecuencia en combinación con posibles sensibilizadores ano en modelos preclínicos in vitro para evaluar su potencial utilidad terapéutica.