Un modelo de tejido 3D Pulmón humano de Estudios funcionales en

El objetivo general de este procedimiento es construir un modelo de tejido pulmonar in vitro para estudios de infección por M tuberculosis. Esto se logra primero superponiendo una matriz de colágeno con fibroblastos sobre el filtro de un inserto de placa de cultivo celular. En el segundo paso, se siembran células epiteliales pulmonares e inmunitarias infectadas sobre la capa de colágeno con fibroblastos.

El modelo de tejido tridimensional resultante se expone luego al aire para facilitar la secreción de moco y la estratificación del epitelio. En la etapa final, el tejido se cosecha y monta. Finalmente, se utiliza microscopía de inmunofluorescencia para analizar la formación del granuloma temprano inducido por M tuberculosis.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la monocapa de células in vitro, es que las células en este sistema se encuentran en un microentorno tridimensional, lo que permite la formación de granulomas tras la infección con micobacterias virulentas que se asemejan a la tuberculosis humana. Para preparar fibroblastos embebidos en colágeno, comience tratando células de fibroblastos pulmonares con tripsina durante 10 minutos a 37 grados Celsius; cuando las células se hayan desprendido, detenga la reacción con ocho mililitros de DMEM completo y luego centrifugue las células. Re suspenda los pellets a 230.000 células por mililitro en DMEM fresco y coloque las células en hielo. A continuación, agregue un inserto por pocillo en una placa de seis.

Coloque en la placa de pozos y dispense un mililitro de mezcla recién preparada sin capa celular en cada inserto, asegurándose de que la mezcla cubra por completo el inserto sin formar burbujas de aire. Luego, coloque la placa en un incubador a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Al final de la incubación, mezcle dos mililitros de colágeno con 615 microlitros de la mezcla previa en un tubo cónico estéril sobre hielo para neutralizar el pH del colágeno por inserto.

Luego, agregue 58 microlitros de DMEM completo y 327 microlitros de fibroblastos pulmonares por inserto a la mezcla de colágeno. Pase la pipeta hacia arriba y hacia abajo para distribuir las células uniformemente en toda la mezcla. Ahora, agregue rápidamente tres mililitros de la capa celular por el costado de cada inserto sobre cada capa acelular de colágeno.

Asegurándose de evitar burbujas de aire y devuelva la placa al incubador de cultivo celular durante otras dos horas. Tras la polimerización del colágeno, agregue dos mililitros de DMEM completo en la parte inferior de cada pocillo y devuelva la placa al incubador durante otras 24 horas. Al día siguiente, utilice un par de pinzas limpias para levantar cuidadosamente los insertos uno por uno y aspire el medio de cultivo de la parte inferior de cada uno.

A continuación, agregue dos mililitros de DMM completo en el fondo de cada pocillo y dos mililitros de DMM completo en cada inserto. Cambie ambos volúmenes de medio cada dos días durante cinco a siete días. Para preparar los macrófagos infectados, comience incubando una cultura de macrófagos durante cuatro horas con M. tuberculosis virulenta a una multiplicidad de infección de 10.

Al final de la incubación, lave las células tres veces con PBS para eliminar las bacterias extracelulares y trate los macrófagos con dos milimolar, A DTA durante 10 minutos a 37 grados Celsius. Cuando las células se hayan desprendido, suspenda en dmm completo libre de antibióticos. Luego aspire todo el medio de la placa de matriz de colágeno de fibroblastos y agregue 1,5 mililitros de DMM completo fresco libre de antibióticos a las cámaras externas.

A continuación, mezcle monocitos marcados con fluorescencia con los macrófagos infectados en una proporción de cinco a uno en 50 microlitros de DMEM completo sin antibióticos por inserto. Luego, agregue 50 microlitros de la mezcla de monocitos y macrófagos al interior de cada inserto y regrese la placa al incubador. Después de una hora, agregue lentamente dos mililitros de medio de cultivo por las paredes de los insertos para evitar desalojar las células e incube los cultivos durante otras 24 horas.

Para sembrar los cultivos con células epiteliales pulmonares, agregue 4 millones de células epiteliales por mililitro en 50 microlitros de DMM completo encima de las matrices de colágeno de fibroblastos y células inmunitarias. Incube las células durante dos minutos a temperatura ambiente, seguido de una hora a 37 grados Celsius. Luego, agregue suavemente dos mililitros de DMM completo sin antibióticos a los insertos tal como se acaba de demostrar, y cultive las células durante otros tres días.

Cinco días después de sembrar, aspire todo el medio de cultivo de la placa que contiene los macrófagos infectados y agregue 1,8 mililitros de DMM completo sin antibióticos a las cámaras externas. Luego, exponga los modelos de tejido 3D al aire en el incubador durante dos días sin agregar medio al inserto el día siete posteriores a la siembra.

Retire completamente el medio de la placa y mezcle los modelos de tejido con paraformaldehído al 4 % durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Luego, utilizando un escalpelo, separe las membranas de los insertos de pozo. A continuación, use un escalpelo limpio para retirar cuidadosamente los lados de los modelos de tejido y corte cada tejido en cuatro piezas cuadradas de tamaño aproximadamente igual.

Transfiera los fragmentos a portaobjetos de vidrio super frosts y déjelos secar durante cinco minutos. Luego, utilizando un medio de montaje fluorescente que contenga agente antidesvanecimiento y dpi, monte los tejidos y cúbralos con cubreobjetos. Deje los portaobjetos a temperatura ambiente en la oscuridad hasta que estén secos, y luego selle los bordes del cubreobjeto con esmalte de uñas.

Una vez que el barniz esté seco, sumerja los portaobjetos en etanol al 70 % para su traslado fuera de la instalación de nivel de bioseguridad 3. Para visualizar los tejidos, adquiera imágenes tridimensionales de cinco a diez campos diferentes que cubran toda la pieza de tejido, con una resolución de 512 por 512 y un espesor de Zack de al menos 20 micrones, con una separación entre cortes de uno a 1,5 micrones, utilizando un microscopio confocal fluorescente para la cuantificación tridimensional de los grupos celulares. Abra el software de procesamiento de imágenes tridimensionales y cargue la imagen de interés.

A continuación, utilizando la herramienta de ajuste de visualización, ajuste cada canal para la imagen, contraste, brillo y opacidad de superposición con el fin de optimizar la representación volumétrica y minimizar la interferencia del ruido. Luego, para visualizar la superficie del tejido, seleccione el canal del monocito rojo y establezca los umbrales adecuados utilizando los filtros para restringir la selección de los monocitos rojos o excluir el fondo según sea necesario. Finalmente, exporte los datos al programa de hojas de cálculo apropiado para un análisis posterior.

El día siete, tras el siembra de células infectadas con M. tuberculosis, la microscopía confocal revela un agrupamiento de monocitos rojos en el sitio de infección, evidenciado por la presencia de bacterias verdes que imitan las lesiones de la tuberculosis humana conocidas como granulomas 3D. La visualización ofrece la flexibilidad de interactuar, examinar y cuantificar varias características. Una imagen 3D, por ejemplo, en estas imágenes que muestran un cúmulo de monocitos en el sitio de infección por M. tuberculosis.

La disposición espacial de las bacterias verdes y los grupos de monocitos rojos puede observarse desde las vistas apical, rotacional y lateral. Como era de esperar, estos grupos no se observaron en los tejidos no infectados. La cuantificación del tamaño y número de monocitos, grupos de células y tejidos infectados con M tuberculosis reveló que el tamaño de los grupos celulares aumenta, mientras que el número de monocitos individuales disminuye en comparación con los modelos de tejidos no infectados.

Los posibles usuarios de este modelo de tejido pulmonar incluyen el estudio del papel de diferentes células inmunitarias y la inmunidad tisular en la tuberculosis, el estudio de fenotipos de micobacterias y la evaluación de candidatos a fármacos que eliminan micobacterias dentro del granuloma.