Name: Un modelo de tejido 3D Pulmón humano de Estudios funcionales en Mycobacterium tuberculosis Infección (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-05T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Aprende a construir un modelo de tejido pulmonar 3D para estudiar la infección por Mycobacterium tuberculosis. Este método permite analizar la formación de granulomas y la migración de células inmunes en un entorno fisiológicamente relevante.

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Los autores agradecen la instalación central de Microscopía en la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad de Linköping por proporcionar acceso a sistemas de imagen avanzados; Karl-Eric Magnusson (científico emérito) del Departamento de Medicina Clínica y Experimental de la Universidad de Linköping por proporcionar acceso al software de procesamiento de imágenes 3D/4D Imaris (Bitplane, Suiza); y a S. Braian por su ayuda con la caricatura del modelo de pulmón. Este trabajo fue apoyado por fondos del Consejo Sueco de Investigación (Alternativas a la investigación con animales, 2012-1951) y el Consejo Sueco de Investigación (2012-3349) a M.L. y la Fundación Sueca para la Investigación Estratégica a S.B. S.B. recibe subvenciones del Instituto Karolinska, el Consejo Sueco de Investigación, la Agencia Sueca de Cooperación Internacional para el Desarrollo (Sida) y la Agencia Sueca de Contingencias Civiles (MSB), y la Fundación Sueca del Corazón y los Pulmones (HLF). M.S. recibió becas del Instituto Karolinska y del Consejo del Condado de Estocolmo.

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

La capacidad de reclutar y formar grupos de células organizadas en el sitio de la infección es el sello distintivo de la tuberculosis humana 11. Estas estructuras dinámicas conocidas como granulomas tuberculosos consisten principalmente en células inmunitarias (macrófagos, monocitos, células T y células B) y células gigantes multinucleadas que rodean a M. tuberculosis. Durante mucho tiempo se ha considerado que el papel del granuloma es aislar la infección, evitando la propagación local de bacterias. Sin embargo, estudios más recientes muestran que la formación de granulomas es fundamental para la supervivencia, el crecimiento y la diseminación bacterianos tempranos 12. Una estrategia de nuevos estudios es identificar moléculas o vías que podrían dirigirse de manera eficiente para inhibir la migración celular en la formación de granulomas y/o la diseminación de la TB. 
Una advertencia para los nuevos estudios sobre la tuberculosis es la falta de modelos que recapitulen la tuberculosis humana. Los animales de experimentación más utilizados no forman un verdadero granuloma tras la infección por M. tuberculosis y, por lo tanto, no son opciones apropiadas para los estudios de TB 13-16. Los primates no humanos tienen el mayor parecido con la tuberculosis humana 17, pero no son la opción preferida debido a los altos costos operativos y los problemas éticos. La tuberculosis humana es un proceso inmunológico complejo y es difícil de modelar in vitro. Los cultivos celulares de monocapas o cocultivos carecen del entorno 3D y las respuestas tisulares. Por lo tanto, hemos desarrollado un modelo innovador de tejido pulmonar basado en células inmunitarias primarias humanas y líneas celulares específicas de pulmón humano 8,9. El modelo muestra rasgos característicos del tejido pulmonar humano, incluidos epitelios con macrófagos uniformemente integrados, formación de matriz extracelular, epitelio estratificado y secreción de moco 9. 
El modelo de tejido pulmonar humano en 3D tiene varios beneficios sobre los cultivos individuales o conjuntos in vitro sembrados en placas de cultivo de tejidos o insertos transwell. En primer lugar, las células específicas de los pulmones humanos (fibroblastos y células epiteliales) no se incluyen comúnmente en los cultivos individuales o cocultivos in vitro . En segundo lugar, las células inmunitarias y las células específicas de los pulmones están integradas en un contexto fisiológico 3D (productos de matriz extracelular ricos en colágeno). La respuesta de las células a un estímulo/infección y el comportamiento migratorio de las células, por ejemplo, la formación de un granuloma, difieren significativamente entre un entorno 2D y 3D. Además, el método descrito permite la visualización 3D y el análisis cuantitativo 3D robusto que proporciona información fundamental sobre la distribución espacial y las intrincadas interacciones celulares. 
La infección experimental en el tejido modelo con M. tuberculosis dio lugar a la agrupación de macrófagos en el sitio de la infección, que recuerda al granuloma de tuberculosis temprano (Figura 2 y 3). Recientemente hemos demostrado que las cepas mutantes defectuosas en la capacidad de secretar el factor de virulencia ESAT-6 o Mycobacterium bovis BCG que carece de ESAT-6 no indujeron la agrupación de monocitos (sin granuloma temprano), en contraste con la virulenta M. tuberculosis 9. Estos datos son consistentes con las observaciones realizadas a partir de embriones de pez cebra infectados con Mycobacterium marinum, cuya transparencia permite obtener imágenes en vivo elegantes de la formación de granulomas 12. Como no existe un modelo estándar de oro para la TB, aprovechamos las biopsias de tejido resecadas quirúrgicamente de pacientes con TB para la validación del método 9. Nuestro modelo de tejido in vitro comparte varias características con las biopsias de pulmón y ganglios linfáticos de pacientes con TB, incluida la agregación de macrófagos en el granuloma, la presencia de bacterias intra y extracelulares 18 y la inducción de necrosis 11. 
Aunque el modelo descrito tiene relevancia fisiológica para la TB humana y tiene varias ventajas sobre otros modelos in vitro , tiene algunas limitaciones. Por ejemplo, de las más de 20 proteínas de colágeno identificadas en humanos, solo el tipo I se incluye en el modelo para imitar la matriz extracelular. Sin embargo, el colágeno tipo I es una mezcla compleja de productos de matriz extracelular y es el colágeno más abundante en el cuerpo humano. Además, hemos demostrado la presencia de colágeno IV y varias proteínas de la matriz extracelular como la tropoelastina, la vimentina y la laminina, que son producidas por las células epiteliales y los fibroblastos en el modelo tisular, lo que indica la síntesis de nuevo colágeno 8. Actualmente, el modelo de tejido pulmonar solo tiene monocitos y macrófagos, además de células específicas del pulmón. Carece de neutrófilos y linfocitos que también se sabe que están presentes en el granuloma. Sorprendentemente, el modelo no se limita a la introducción de células inmunitarias adicionales y es de interés explorar cómo contribuyen a las complejas interacciones celulares en la tuberculosis humana. La implantación de macrófagos alveolares primarios, células específicas de la piel y células de carcinoma de pulmón ya se ha probado en el modelo. Dado que nuestro objetivo era utilizar un modelo que se pareciera mucho a la tuberculosis humana, no se ha intentado la introducción de células de ratón.
En resumen, el modelo de tejido pulmonar tiene implicaciones tanto para los estudios mecanicistas básicos como para los aplicados. Las aplicaciones potenciales del modelo pulmonar incluyen el estudio de la inmunidad innata, la investigación de aspectos mecanicistas de las defensas del huésped, como la maduración fagosomal, la autofagia, la producción de citocinas, quimiocinas y péptidos antimicrobianos, y la caracterización funcional de tipos de células individuales. Sorprendentemente, el modelo de tejido in vitro permite la manipulación de uno o más tipos de células y proporciona un microambiente tisular relevante, no solo para estudios sobre tuberculosis, sino para una variedad de enfermedades infecciosas y no infecciosas que afectan los pulmones.

En los seres humanos, las respuestas a la infección, la inflamación del tejido, el reclutamiento celular, la remodelación tisular y la regulación de la homeostasis del tejido son eventos complejos que implican diferentes tipos de células. Por lo tanto, estos procesos son los más estudiados en el entorno del tejido local. Anteriormente, esto ha sido principalmente posible utilizando modelos animales experimentales. Sin embargo, los animales experimentales utilizados tienen muchos límites ya que a menudo responden a los patógenos de una manera diferente que los humanos y también muestran un curso diferente de la enfermedad 1. Un humano en el modelo de tejido pulmonar vitro tiene las posibilidades para estudiar las respuestas inmunes específicas en el pulmón humano. Infección de tuberculosis humana (TB) es una enfermedad que afecta principalmente a los pulmones. Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), el agente causante de la TB, alcanza el pulmón a través de gotitas de aerosol que son transportados al espacio alveolar, donde las bacterias son engullidas por dendri pulmonarcélulas de tics y macrófagos alveolares como parte de la respuesta inmune innata a la infección 2,3. La fagocitosis del patógeno conduce a la compartimentación del error dentro de un fagosoma e idealmente como resultado la neutralización y el asesinato del agente patógeno por el fagocito. Hasta 50% de los individuos expuestos a M. la tuberculosis se cree que son capaces de eliminar la infección a través de la respuesta inmune innata 4. Otros resultados de la infección son un despeje de la adaptación del sistema inmunológico en una etapa posterior, la infección latente o en el peor de los casos la enfermedad activa crónica 5. Anteriormente no se han presentado los modelos de tejidos in vitro para el estudio de la tuberculosis humana. Cultivos de células individuales de los macrófagos humanos u otras células de sangre periférica a menudo se han utilizado 6,7. La desventaja de este enfoque es que no pueden reflejar la dinámica de los diferentes tipos de células que operan juntos en un tejido pulmonar expuesto a M. tuberculosis </em&gt;. Por lo tanto, hay una necesidad de un modelo in vitro para ser capaz de realizar estudios funcionales y mecanicistas sobre la tuberculosis. El modelo en el tejido pulmonar humano in vitro descrito aquí basada en células fue establecida originalmente por nuestro grupo de estudios sobre las funciones celulares dendríticas 8. Hemos adaptado este método para el estudio de la tuberculosis. El modelo de tejido pulmonar humano que aquí se presenta se compone de células epiteliales y fibroblastos 8 específicos de tejido. Estas células se cultivan en una matriz de colágeno en la parte superior de una membrana porosa en un inserto de transwell y las estructuras de forma que se asemeje tejido pulmonar humano normal (Figura 1). Cuando se expone al aire las células comienzan a secretar moco en la parte apical 8. Mediante la implantación de los macrófagos primarios humanos infectados con M. tuberculosis al modelo, hemos observado cómo las células inmunes migran en el tejido y forman primeras etapas de granulomas TB 9. Este es el primer modelo de tejido descr humanaibed para la tuberculosis y plantea una herramienta prometedora para el estudio de la respuesta inmune innata a la tuberculosis y otras enfermedades del pulmón. Hasta la fecha, hemos utilizado sólo monocitos y macrófagos como células inmunes en el modelo, pero el nivel de complejidad se puede aumentar mediante la inclusión de tipos de células relevantes adicionales. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53084/53084fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema Esquema del modelo de tejido pulmonar. (A) El modelo se compone de células epiteliales pulmonares-específica humanos, M. tuberculosis infectados con macrófagos primarios y tinte rojo monocitos marcados sembró en colágeno incrustado fibroblastos preparados en un filtro transwell. La exposición de la modelo de tejido al aire inicia la producción de proteínas de la matriz extra-celular, la secreción de moco y la estratificación por el epitelio. El modelo de tejido 3D así desarrollada es una herramienta útil para estudiar M. infección de tuberculosis en un entorno que closely se asemeja a un pulmón humano. (B) imágenes microscópicas representativas de los diferentes pasos en la preparación del modelo de tejido. (C) estructura completa de la sección de tejido modelo de pulmón. Escala -. 100 m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53084/53084fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Insertos de cultivo celular</td><td>BD Falcon</td><td>353092</td><td></td></tr><tr><td>placas de cultivo de 6 pocillos</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>células MRC-5, fibroblastos pulmonares</td><td></td><td></td><td>ATCC#CCL-171</td></tr><tr><td>16HBE células, células</td><td></td><td></td> epiteliales pulmonares <td>Regalo del Dr. Dieter Gruenert, Mt. Zion Cancer Center, Universidad de California, San Francisco, EE. UU.</td></tr><tr><td>5 x Dulbecco' Águila modificada' s medium (5 x DMEM)</td><td>Gibco</td><td>12800-082</td><td>Hecho de polvo pero añadir 5 veces menos agua. Ajuste el pH a 7.3 y fíltrelo con un 0.2 &micro; Filtro M.</td></tr><tr><td>Dulbecco' Águila modificada' s medio con glucosa (DMEM) 1x</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>Medio esencial mínimo (MEM) 1x con Earle' sales s</td><td>Sigma</td><td>M4655</td><td></td></tr><tr><td>Solución de aminoácidos no esenciales, 100x</td><td>Life Technologies</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Life Technologies</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3 (71,2 mg/ml)</td><td></td><td></td><td>Preparado internamente</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino inactivado por calor (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Calor inactivado durante 30 min, 56 &deg; C</td></tr><tr><td>Gentamicina (50 mg/ml)</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Hepes solución tampón 1M</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina (estreptococo en pluma)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Axis-Shield</td><td>7801</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure 0,5 M EDTA</td><td>Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno bovino tratado con PA (500 ml)</td><td>Organogénesis</td><td>200-055</td><td></td></tr><tr><td>Solución purificada de colágeno bovino purificado (100 ml)</td><td>Biomatrix avanzado</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>Proteína de matriz extracelular, Fibronectina (1 mg)</td><td>BD</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>Monocitos/macrófagos</td><td></td><td></td> humanos <td>primarios Aislados de sangre entera humana o pelajes leucocitarios.</td></tr><tr><td>PKH26 Enlazador de células rojas fluorescentes</td><td>Sigma</td><td>MINI26</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis H37Rv que expresa la proteína</td><td></td><td></td> verde fluorescente <td>M. tuberculosis H37Rv tipo salvaje se transformó con el plásmido pFPV2 que expresa constitutivamente GFP.</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 medio&nbsp;</td><td>Difco</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>BBL Middlebrook ADC Enriquecimiento</td><td>BBL</td><td>211887</td><td></td></tr><tr><td>Tween-80</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de kanamicina B (20 &micro; g/ml)</td><td>Sigma</td><td>B5264</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold reactivo anti=-decoloración con DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina -EDTA</td> Albúmina sérica bovina <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> LSM700 Microscopio confocal Zeiss <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de procesamiento de imágenes iMaris Scientific 3D/4D, versión 7.6.8</td><td>Bitplane AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un modelo de tejido 3d pulmón humano de estudios funcionales en<em&gt; mycobacterium tuberculosis</em&gt; infección

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

La tuberculosis (TB) sigue teniendo una gran amenaza para la salud de las personas en todo el mundo, y hay una necesidad de modelos rentables, pero fiables para ayudarnos a entender los mecanismos de la enfermedad y promover los descubrimientos de nuevas opciones de tratamiento. Cultivos celulares in vitro de las monocapas o co-cultivos carecen de la tridimensional medio ambiente (3D) y las respuestas de los tejidos. En este documento, se describe un innovador modelo in vitro de un tejido pulmonar humano, que promete ser una herramienta eficaz para el estudio de los complejos acontecimientos que ocurren durante la infección por Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). El modelo de tejido 3D consiste en células epiteliales y fibroblastos específicos de tejido, que son cultivadas en una matriz de colágeno en la parte superior de una membrana porosa. Tras la exposición de aire, las células epiteliales estratificar y secretar moco en la parte apical. Mediante la introducción de los macrófagos primarios humanos infectados con M. tuberculosis al modo de tejidol, hemos demostrado que las células inmunitarias migran al tejido infectado y forman primeras etapas de granuloma TB. Estas estructuras recapitulan la característica distintiva de la tuberculosis humana, el granuloma, que es fundamentalmente diferente o no se observa comúnmente en modelos animales experimentales utilizados. Este método de cultivo organotípico permite la visualización en 3D y el análisis cuantitativo robusto que proporciona información fundamental sobre las características espaciales y temporales de las interacciones célula-patógeno de acogida. En conjunto, el modelo de tejido pulmonar proporciona un tejido microambiente fisiológicamente relevante para los estudios sobre la tuberculosis. Por lo tanto, el modelo de tejido pulmonar tiene implicaciones potenciales para ambos estudios mecanicistas y aplicados básicos. Es importante destacar que el modelo permite la adición o manipulación de tipos de células individuales, que de este modo amplía su uso para modelar una variedad de enfermedades infecciosas que afectan a los pulmones.

Un modelo de tejido pulmonar 3D para la tuberculosis humana puede ser utilizado eficazmente para estudiar las interacciones huésped-patógeno en M. infección por tuberculosis. Los pasos básicos de este método, las imágenes microscópicas representativas de diferentes pasos y una estructura microscópica general de una sección de tejido se indica en la Figura 1. El modelo tiene varios componentes del tejido pulmonar humano, incluyendo fibroblastos de pulmón, células epiteliales bronquiales y monocitos primarios / macrófagos incrustado en el entorno del tejido 3D. Además de la incorporación de componentes de tejido de pulmón humano, el modelo se asemeja a condiciones fisiológicas a saber, la estratificación de los epitelios y la secreción de moco. Un ejemplo para el uso del modelo de tejido pulmonar en el seguimiento de una infección de TB se presenta en la Figura 2. Para visualizar la M. tuberculosis migración celular -immune e interacción, que introdujeron los macrófagos infectados con M. tuberculosis que expresan GFP(verde) junto con los monocitos PKH26 marcado recién aisladas (rojo) en el modelo de tejido (azul, manchado DAPI para los núcleos). En el día 7 después de la adición de M. tuberculosis células infectadas en el modelo de tejido, microscopía confocal revela la agrupación de los monocitos de color rojo en el sitio de infección (verde) (Figura 2), que imita las lesiones característicos de la TB humana 9. Una serie de imágenes representativas para la visualización 3D de M. tuberculosis infectados con modelo de tejido y la cuantificación de los grupos de células se muestra en la Figura 3. La visualización en 3D da la flexibilidad para el usuario para interactuar, examinar y cuantificar varias características en una imagen en 3D. La disposición espacial de las bacterias verdes y rojos racimos de monocitos se puede ver desde la vista apical, rotacional y lateral como se ilustra en la figura 3B, lo que revela la agrupación de los monocitos en el sitio de M. Los racimos de tuberculosis. no se observido en los tejidos no infectados (Figura 3A). Hemos cuantificado el tamaño y el número de grupos de células de monocitos y encontramos que el tamaño (volumen) de grupos de células se ha mejorado (p &lt;0,001), mientras que el número de monocitos individuales disminuyó (p &lt;0,01) en M. tuberculosis tejidos infectados en comparación con los modelos de tejido no infectadas (Figura 3C y 3D). Estos datos valida nuestra anterior conclusión de la formación de granulomas a principios de M. infección tuberculosa observa en los modelos de tejido pulmonar analizados en secciones de tejido 2D 9. Nuestros datos sugieren que el modelo de tejido proporciona un hábitat natural 3D para investigar el complejo de acogida por células M. red de comunicación tuberculosis. También se encontró que la visualización en 3D y el análisis cuantitativo son mejores herramientas para el estudio de las características del modelo de tejido (Figura 3). La cuantificación de un grupo de células (granuloma por ejemplo) a menudo stretch<html> hes a varias capas de células y pueden ser capturados por completo por un análisis cuantitativo 3D. Además, la visualización de las características espaciales y temporales exactas de las células individuales o bacterias en el modelo permite estudios de imagen en vivo, de migración y de seguimiento en un laboratorio designado. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53084/53084fig2.jpg" /> Figura 2. monocitos en el clúster modelo tejido alrededor virulenta M. tuberculosis. confocal de imágenes representativas de los no infectados y M. se presenta la tuberculosis modelo de tejido infectado. Paneles de verde (M. tuberculosis- GFP), rojo (monocitos PKH26 marcado), azul (núcleos teñidos con DAPI) y canales fusionadas muestran el reclutamiento de monocitos en el tejido infectado en comparación con los tejidos infectados. Scale - 100 micras.large.jpg &quot;style =&quot; font-size: 14px; line-height: 28px; &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53084/53084fig3.jpg" /> Figura 3. Visualización 3D y el análisis cuantitativo de modelo de tejido proporcionan información útil. Imágenes representativas de visualización en 3D de todo el modelo de tejido (A) del tejido infectado, (B) infectados con M. tuberculosis, a través de seccionamiento óptico Zeiss LSM700 usando microscopio confocal y análisis cuantitativo por el software de procesamiento de imágenes Imaris (versión 7.6.8). Estas imágenes fueron adquiridas a 20X aumentos, 14 z-pilas que cubren un espesor de tejido de 19,5 m con 1,5 micras intervalo, permitiendo la visualización de la posición horizontal apical, de rotación, vista vertical y lateral de rotación (A y B). (C) Quaanálisis ntitative de grupos de células de monocitos revelan mejorada (p &lt;0,0001) tamaño de los clusters granuloma primeros después M. infección de tuberculosis cuando se compara con la ausencia de infección. (D) Cuantificación de número de monocitos mostró una disminución (p &lt;0,01) en el tejido infectado en comparación con el tejido no infectado, reiterando más grupos en el tejido infectado. Verde - M. GFP tuberculosis, Red - monocitos marcados PKH26, Azul - núcleos celulares, Escala -. 100 m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53084/53084fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

La infección por tuberculosis humana es un proceso complejo, difícil de modelar in vitro. Aquí describimos un nuevo modelo de tejido pulmonar humano en 3D que recapitula la dinámica que ocurre durante la infección, incluida la migración de células inmunitarias y la formación temprana de granuloma en un entorno fisiológico.

Un modelo de tejido 3D Pulmón humano de Estudios funcionales en<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infección

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

El objetivo general de este procedimiento es construir un modelo de tejido pulmonar in vitro para estudios de infección por M tuberculosis. Esto se logra primero superponiendo una matriz de colágeno con fibroblastos sobre el filtro de un inserto de placa de cultivo celular. En el segundo paso, se siembran células epiteliales pulmonares e inmunitarias infectadas sobre la capa de colágeno con fibroblastos.El modelo de tejido tridimensional resultante se expone luego al aire para facilitar la secreción de moco y la estratificación del epitelio. En la etapa final, el tejido se cosecha y monta. Finalmente, se utiliza microscopía de inmunofluorescencia para analizar la formación del granuloma temprano inducido por M tuberculosis.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la monocapa de células in vitro, es que las células en este sistema se encuentran en un microentorno tridimensional, lo que permite la formación de granulomas tras la infección con micobacterias virulentas que se asemejan a la tuberculosis humana. Para preparar fibroblastos embebidos en colágeno, comience tratando células de fibroblastos pulmonares con tripsina durante 10 minutos a 37 grados Celsius; cuando las células se hayan desprendido, detenga la reacción con ocho mililitros de DMEM completo y luego centrifugue las células. Re suspenda los pellets a 230.000 células por mililitro en DMEM fresco y coloque las células en hielo. A continuación, agregue un inserto por pocillo en una placa de seis.Coloque en la placa de pozos y dispense un mililitro de mezcla recién preparada sin capa celular en cada inserto, asegurándose de que la mezcla cubra por completo el inserto sin formar burbujas de aire. Luego, coloque la placa en un incubador a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Al final de la incubación, mezcle dos mililitros de colágeno con 615 microlitros de la mezcla previa en un tubo cónico estéril sobre hielo para neutralizar el pH del colágeno por inserto.Luego, agregue 58 microlitros de DMEM completo y 327 microlitros de fibroblastos pulmonares por inserto a la mezcla de colágeno. Pase la pipeta hacia arriba y hacia abajo para distribuir las células uniformemente en toda la mezcla. Ahora, agregue rápidamente tres mililitros de la capa celular por el costado de cada inserto sobre cada capa acelular de colágeno.Asegurándose de evitar burbujas de aire y devuelva la placa al incubador de cultivo celular durante otras dos horas. Tras la polimerización del colágeno, agregue dos mililitros de DMEM completo en la parte inferior de cada pocillo y devuelva la placa al incubador durante otras 24 horas. Al día siguiente, utilice un par de pinzas limpias para levantar cuidadosamente los insertos uno por uno y aspire el medio de cultivo de la parte inferior de cada uno.A continuación, agregue dos mililitros de DMM completo en el fondo de cada pocillo y dos mililitros de DMM completo en cada inserto. Cambie ambos volúmenes de medio cada dos días durante cinco a siete días. Para preparar los macrófagos infectados, comience incubando una cultura de macrófagos durante cuatro horas con M. tuberculosis virulenta a una multiplicidad de infección de 10.Al final de la incubación, lave las células tres veces con PBS para eliminar las bacterias extracelulares y trate los macrófagos con dos milimolar, A DTA durante 10 minutos a 37 grados Celsius. Cuando las células se hayan desprendido, suspenda en dmm completo libre de antibióticos. Luego aspire todo el medio de la placa de matriz de colágeno de fibroblastos y agregue 1,5 mililitros de DMM completo fresco libre de antibióticos a las cámaras externas.A continuación, mezcle monocitos marcados con fluorescencia con los macrófagos infectados en una proporción de cinco a uno en 50 microlitros de DMEM completo sin antibióticos por inserto. Luego, agregue 50 microlitros de la mezcla de monocitos y macrófagos al interior de cada inserto y regrese la placa al incubador. Después de una hora, agregue lentamente dos mililitros de medio de cultivo por las paredes de los insertos para evitar desalojar las células e incube los cultivos durante otras 24 horas.Para sembrar los cultivos con células epiteliales pulmonares, agregue 4 millones de células epiteliales por mililitro en 50 microlitros de DMM completo encima de las matrices de colágeno de fibroblastos y células inmunitarias. Incube las células durante dos minutos a temperatura ambiente, seguido de una hora a 37 grados Celsius. Luego, agregue suavemente dos mililitros de DMM completo sin antibióticos a los insertos tal como se acaba de demostrar, y cultive las células durante otros tres días.Cinco días después de sembrar, aspire todo el medio de cultivo de la placa que contiene los macrófagos infectados y agregue 1,8 mililitros de DMM completo sin antibióticos a las cámaras externas. Luego, exponga los modelos de tejido 3D al aire en el incubador durante dos días sin agregar medio al inserto el día siete posteriores a la siembra.Retire completamente el medio de la placa y mezcle los modelos de tejido con paraformaldehído al 4 % durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Luego, utilizando un escalpelo, separe las membranas de los insertos de pozo. A continuación, use un escalpelo limpio para retirar cuidadosamente los lados de los modelos de tejido y corte cada tejido en cuatro piezas cuadradas de tamaño aproximadamente igual.Transfiera los fragmentos a portaobjetos de vidrio super frosts y déjelos secar durante cinco minutos. Luego, utilizando un medio de montaje fluorescente que contenga agente antidesvanecimiento y dpi, monte los tejidos y cúbralos con cubreobjetos. Deje los portaobjetos a temperatura ambiente en la oscuridad hasta que estén secos, y luego selle los bordes del cubreobjeto con esmalte de uñas.Una vez que el barniz esté seco, sumerja los portaobjetos en etanol al 70 % para su traslado fuera de la instalación de nivel de bioseguridad 3. Para visualizar los tejidos, adquiera imágenes tridimensionales de cinco a diez campos diferentes que cubran toda la pieza de tejido, con una resolución de 512 por 512 y un espesor de Zack de al menos 20 micrones, con una separación entre cortes de uno a 1,5 micrones, utilizando un microscopio confocal fluorescente para la cuantificación tridimensional de los grupos celulares. Abra el software de procesamiento de imágenes tridimensionales y cargue la imagen de interés.A continuación, utilizando la herramienta de ajuste de visualización, ajuste cada canal para la imagen, contraste, brillo y opacidad de superposición con el fin de optimizar la representación volumétrica y minimizar la interferencia del ruido. Luego, para visualizar la superficie del tejido, seleccione el canal del monocito rojo y establezca los umbrales adecuados utilizando los filtros para restringir la selección de los monocitos rojos o excluir el fondo según sea necesario. Finalmente, exporte los datos al programa de hojas de cálculo apropiado para un análisis posterior.El día siete, tras el siembra de células infectadas con M. tuberculosis, la microscopía confocal revela un agrupamiento de monocitos rojos en el sitio de infección, evidenciado por la presencia de bacterias verdes que imitan las lesiones de la tuberculosis humana conocidas como granulomas 3D. La visualización ofrece la flexibilidad de interactuar, examinar y cuantificar varias características. Una imagen 3D, por ejemplo, en estas imágenes que muestran un cúmulo de monocitos en el sitio de infección por M. tuberculosis.La disposición espacial de las bacterias verdes y los grupos de monocitos rojos puede observarse desde las vistas apical, rotacional y lateral. Como era de esperar, estos grupos no se observaron en los tejidos no infectados. La cuantificación del tamaño y número de monocitos, grupos de células y tejidos infectados con M tuberculosis reveló que el tamaño de los grupos celulares aumenta, mientras que el número de monocitos individuales disminuye en comparación con los modelos de tejidos no infectados.Los posibles usuarios de este modelo de tejido pulmonar incluyen el estudio del papel de diferentes células inmunitarias y la inmunidad tisular en la tuberculosis, el estudio de fenotipos de micobacterias y la evaluación de candidatos a fármacos que eliminan micobacterias dentro del granuloma.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Mueller, A., et al. Un modelo experimental para estudiar la coinfección tuberculosis-malaria tras la transmisión natural de Mycobacterium tuberculosis y Plasmodium berghei. J. Vis. Exp. (2014)Este vídeo muestra la administración en aerosoles de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) a ratones utilizando un sistema de cámaras basado en nebulizador para inducir infecciones pulmonares, proporcionando un modelo controlado y reproducible para estudiar la transmisión aérea de la tuberculosis y las...

Administración en aerosoles de Mycobacterium tuberculosis para infección pulmonar en un modelo murino

La tuberculosis y la malaria son dos de las infecciones más prevalentes en los humanos y las principales causas de morbilidad y mortalidad en las poblaciones pobres de las zonas tropicales. Hemos establecido un sistema de modelo experimental para estudiar los resultados de la coinfección tuberculosis-la malaria en ratones tras la exposición a ambos patógenos a través de su vía natural de infección.

Un modelo experimental para estudiar la tuberculosis-Malaria Coinfección sobre Transmisión Natural de Mycobacterium tuberculosis Y Plasmodium berghei</i

Presentamos un modelo tridimensional (3D) de cáncer de pulmón basado en un andamiaje biológico de colágeno para estudiar la sensibilidad hacia las terapias dirigidas al cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Demostramos diferentes técnicas de lectura para determinar el índice de proliferación, la apoptosis y el estado de transición epitelio-mesenquimal (EMT). Los datos recopilados se integran en un modelo in silico para la predicción de la sensibilidad a los fármacos.

Un Tejido Combinada 3D Diseñado<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In silico</em&gt; Modelo de tumor de pulmón para la predicción de la eficacia de drogas en Fondos Específicos mutacional

Hemos desarrollado un sistema de cribado de alto rendimiento modular para el descubrimiento de nuevos compuestos contra Mycobacterium tuberculosis, la orientación intracelular y en caldo creciente bacterias, así como la citotoxicidad contra la célula huésped de mamífero.

Sistema para la eficacia y la citotoxicidad de detección de inhibidores de focalización intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Aquí, presentamos un protocolo para describir el análisis de la proyección de imagen de 18F-FDG PET/CT en primates no humanos que han sido infectadas con M. tuberculosis para estudiar el proceso de la enfermedad, tratamiento farmacológico y la reactivación de la enfermedad.

Análisis de 18FDG PET/CT la proyección de imagen como una herramienta para estudiar la tuberculosis del Mycobacterium infección y tratamiento en Primates no humanos

Describimos la proyección de imagen óptica de ratones infectados con Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) mediante fluorescencia de enzima reporter (REF). Este protocolo facilita la detección sensible y específica de M. tuberculosis en modelos animales preclínicos para la investigación de la patogenia, terapéutica y vacunas.

Proyección de imagen de tuberculosis del Mycobacterium en ratones con reportero enzima fluorescencia

Aquí, presentamos un protocolo para la preparación de rodajas de agarosa llena el pulmón humano de precisión de corte de tejido resecado paciente aptas para generar cultivos de tejido 3D pulmón enfermedades de pulmón humano modelo en estudios biológicos y biomédicos.

Generación de cultivos de tejido de pulmón humano 3D (3D-LTCs) para el modelado de la enfermedad

Galleria mellonella se estableció recientemente como un modelo de infección reproducible, barato y éticamente aceptable para el complejo Mycobacterium tuberculosis. Aquí describimos y demostramos los pasos dados para establecer una infección exitosa de G. mellonella con Bioluminiscente Mycobacterium bovis BCG lux.

Uso de la Invertebrada Galleria mellonella como Modelo de Infección para Estudiar el Complejo Mycobacterium tuberculosis

Describimos un protocolo para un modelo de co-cultivo tridimensional de vías respiratorias infectadas, utilizando CFBE41o- células, macrófagos THP-1, y Pseudomonas aeruginosa, establecido en la interfaz aire-líquido. Este modelo proporciona una nueva plataforma para probar simultáneamente la eficacia de los antibióticos, la función de barrera epitelial y los marcadores inflamatorios.

P. aeruginosa Co-cultivo 3D infectado de células epiteliales bronquiales y macrófagos en la interfaz aire-líquido para la evaluación preclínica de los antiinfecciosos

Los modelos de pulmón en chip superan a los cultivos 2D tradicionales al imitar la interfaz aire-líquido y la perfusión de células endoteliales, simulando el flujo sanguíneo y el intercambio de nutrientes cruciales para los estudios de fisiología pulmonar. Esto aumenta la relevancia de la investigación pulmonar, ya que ofrece un entorno dinámico y fisiológicamente preciso para avanzar en la comprensión y el tratamiento de las infecciones respiratorias.

Modelo de alvéolo en chip inmunocompetente para el estudio de las respuestas inmunitarias de la mucosa alveolar

Aquí presentamos un protocolo para la imagen intravital de un Mycobacterium tuberculosis atenuado aprobado por BSL-2. Cepa en el pulmón murino utilizando una ventana pulmonar permanente. Este enfoque permite un análisis longitudinal con resolución de célula única de las interacciones tempranas huésped-patógeno, incluyendo la localización bacilar, la dinámica vascular y la captación de macrófagos dentro del mismo microambiente pulmonar.

Imagen intravital de Mycobacterium tuberculosis auxotrófico atenuado en el pulmón murino durante una infección intravascular temprana

Aprende a construir un modelo de tejido pulmonar 3D para estudiar la infección por Mycobacterium tuberculosis. Este método permite analizar la formación de granulomas y la migración de células inmunes en un entorno fisiológicamente relevante.

Un modelo de tejido 3D Pulmón humano de Estudios funcionales en

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