Un modelo de tejido 3D Pulmón humano de Estudios funcionales en Mycobacterium tuberculosis Infección

El objetivo general de este procedimiento es construir un modelo de tejido pulmonar in vitro para estudios de la infección por M. tuberculosis. Esto se logra primero colocando una matriz de colágeno de fibroblastos en el filtro de un inserto de placa de cultivo celular. En el segundo paso, las células epiteliales inmunitarias y pulmonares infectadas se asientan sobre la capa de colágeno de fibroblastos.

A continuación, el modelo de tejido 3D resultante se expone al aire para facilitar la secreción de moco y la estratificación del epitelio. En el paso final, se recolecta el tejido y se monta. En última instancia, la microscopía de inmunofluorescencia se utiliza para analizar la formación de granuloma temprano inducido por M. tuberculosis.

La principal ventaja de esta técnica o de los métodos existentes, como la monocapa de células in vitro, es que las células de este sistema están presentes en un microambiente 3D, lo que permite la formación de granulomas tras la infección con microbacterias virulentas que se asemejan a la tuberculosis humana. Para preparar fibroblastos incrustados en colágeno, comience por tratar las células de fibroblastos pulmonares con tripsina durante 10 minutos a 37 grados centígrados cuando las células se han desprendido, Detenga la reacción con ocho mililitros de DMEM completo y luego gire las células. Vuelva a suspender los gránulos a 230.000 células por mililitro en dmm fresco y coloque las células en hielo. A continuación, agregue un inserto por pocillo en un seis.

Coloque y dispense un mililitro de una mezcla de capas celulares recién preparada en cada inserto, asegurándose de que la mezcla cubra todo el inserto sin burbujas de aire. Luego coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Al final de la incubación, mezcle dos mililitros de colágeno con 615 microlitros de premezcla en un tubo cónico estéril sobre hielo para neutralizar el pH del colágeno por inserto.

A continuación, añada 58 microlitros de dmem completo y 327 microlitros de fibroblastos pulmonares por inserto a la mezcla de colágeno. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para distribuir las células de manera uniforme por toda la mezcla. Ahora agregue rápidamente tres mililitros de la capa celular en el costado de cada inserto en cada capa de colágeno acelular.

Tenga cuidado de evitar burbujas de aire y devuelva la placa a la incubadora de cultivos celulares durante otras dos horas. Después de la polimerización del colágeno, agregue dos mililitros de dmem completo al fondo de cada pocillo y devuelva la placa a la incubadora durante otras 24 horas. Al día siguiente, use un par de pinzas limpias para levantar cuidadosamente los insertos uno a la vez y aspire el medio de cultivo desde la parte inferior de cada uno.

Bueno, luego agregue dos mililitros de DMM completo al fondo de cada pocillo, y dos mililitros de DMM completo a cada inserto. Cambiar ambos volúmenes de medio cada dos días durante cinco a siete días. Para preparar los macrófagos infectados, comience incubando un cultivo de macrófagos durante cuatro horas con M tuberculosis virulenta a una multiplicidad de infección de 10.

Al final de la incubación, lavar las células tres veces con PBS para eliminar las bacterias extracelulares y tratar los macrófagos con dos milimolares, A DTA durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Cuando las células se hayan desprendido, suspenderlas en dmm completo libre de antibióticos. A continuación, aspire todo el medio de la placa de matriz de colágeno de fibroblastos y añada 1,5 mililitros de DMM completo fresco y libre de antibióticos a las cámaras exteriores.

A continuación, mezcle los monocitos marcados con fluorescencia con los macrófagos infectados en una proporción de cinco a uno en 50 microlitros de DM EM completo libre de antibióticos por inserto. A continuación, añada 50 microlitros de la mezcla de macrófagos monocitos en el interior de cada inserto y devuelva la placa a la incubadora. Después de una hora, agregue lentamente dos mililitros de cultivo, a medio por las paredes de los insertos para evitar que las células se desplacen e incube los cultivos durante otras 24 horas.

Para sembrar los cultivos con células epiteliales pulmonares, agregue 4 millones de células epiteliales por mililitro en 50 microlitros de dmm completo sobre las matrices de colágeno de fibroblastos de la célula inmunitaria. Incubar las células durante dos minutos a temperatura ambiente, seguidos de una hora a 37 grados centígrados. A continuación, añada suavemente dos mililitros de DMM completo y libre de antibióticos a los insertos, como se acaba de demostrar, y cultive las células durante otros tres días.

Cinco días después de la siembra, los macrófagos infectados aspiran todo el medio de cultivo de la placa y añaden 1,8 mililitros de DMM completo y libre de antibióticos a las cámaras exteriores. A continuación, expuso al aire los modelos de tejido 3D en la incubadora durante dos días sin añadir medio al inserto el séptimo día. Publicación de la siembra.

Retire el medio por completo de la placa y mezcle los modelos de pañuelo con 4% de paraldehído durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Luego, con un bisturí, separe las membranas de los insertos del pocillo. A continuación, utilice un bisturí limpio para retirar con cuidado los lados de los modelos de tejido y corte cada tejido en cuatro piezas cuadradas de tamaño aproximadamente igual.

Transfiera las piezas a portaobjetos de vidrio súper escarchados y déjelas secar durante cinco minutos. Luego, usando un montaje fluorescente, medio que contiene anti decoloración y dpi, monte los pañuelos y cúbralos con cubreobjetos. Deje los portaobjetos a temperatura ambiente en la oscuridad hasta que estén secos, y luego selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas.

Cuando la laca esté seca, sumerja los portaobjetos en etanol al 70% para transferirlos fuera de las instalaciones de BSL tres. Para visualizar los tejidos, adquiera imágenes en 3D de cinco a 10 campos diferentes que cubren toda la pieza de tejido con una resolución de 512 por 512 con una cobertura Zack de un grosor mínimo de 20 micras con una separación de una a 1,5 micras entre las pilas en un microscopio confocal fluorescente para la cuantificación en 3D de los grupos de células. Abra el software de procesamiento de imágenes 3D y cargue la imagen que le interese.

A continuación, con la herramienta de ajuste de pantalla, ajuste cada canal para la imagen, el contraste, el brillo y la opacidad de la mezcla para optimizar la representación del volumen y minimizar la interferencia de ruido. A continuación, para visualizar la superficie del tejido, seleccione el canal de monocitos rojos y establezca los umbrales adecuados utilizando los filtros para restringir la selección de los monocitos rojos o para excluir el fondo según sea necesario. Por último, exporte los datos al programa de hoja de cálculo adecuado para su posterior análisis.

En el séptimo día, la microscopía confocal de siembra de células infectadas con tuberculosis M revela un agrupamiento de monocitos rojos en el sitio de la infección, como se observa por la presencia de las bacterias verdes que imitan las lesiones de la tuberculosis humana conocidas como granuloma 3D. La visualización proporciona la flexibilidad de interactuar, examinar y cuantificar varias características. Una imagen en 3D, por ejemplo, en estas imágenes que muestra un grupo de monocitos en el sitio de la emtuberculosis.

La disposición espacial de las bacterias verdes y los grupos de monocitos rojos se puede observar desde las vistas apicales, rotacionales y laterales. Como era de esperar, estos grupos no se observaron en los tejidos no infectados. La cuantificación del tamaño y el número de monocitos, grupos de células y tejidos infectados por M. tuberculosis reveló que el tamaño de los grupos de células aumenta mientras que el número de monocitos individuales disminuye en comparación con los modelos de tejido no infectado.

Los posibles usuarios de este modelo de tejido pulmonar incluyen el estudio del papel de las diferentes células inmunitarias y la inmunidad tisular en la tuberculosis, el estudio de los fenotipos de micobacterias y las pruebas de candidatos a fármacos que matan las micobacterias dentro del granuloma.