Name: Etiquetado Celular y Orientación con superparamagnético nanopartículas de óxido de hierro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Aprende a sintetizar nanopartículas de óxido de hierro superparamagnéticas para el etiquetado celular y la orientación magnética. Este método permite la entrega específica de células terapéuticas en aplicaciones biomédicas.

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Los autores desean agradecer la financiación del Fondo Europeo de Desarrollo Regional – FNUSA-CICR (no. CZ.1.05/ 1.1.00/ 02.0123), la Subvención para el Desarrollo Científico de la Asociación Americana del Corazón (AHA #06-35185N) y los Institutos Nacionales de Salud (NIH #T32HL007111).

1. Síntesis de la magnetita de Gel <ol><li> Lave toda la cristalería usando ácido clorhídrico concentrado seguido de agua desionizada seguido por el alcohol etílico. Deje secar O / N, preferiblemente en un horno de secado. ¡CUIDADO! ácido clorhídrico es perjudicial - llevar equipo de protección personal y el trabajo en una campana de humos; alcohol etílico es perjudicial -, usar equipo de protección personal. </li><li> Utilice una botella Dreschel para de-gas 500 ml de H2O desionizada burbujeando suavemente gas N2 durante 30 minutos. </li><li> Puesta en marcha del aparato de síntesis de magnetita dentro de una campana de humos química. <ol><li> Coloque un frasco ml de tres bocas de fondo redondo de 500 dentro de un calentador isomantle y asegure la boca central utilizando una pinza y el soporte. </li><li> Instalar un septum de goma en uno de los cuellos laterales del matraz de fondo redondo y un condensador de reflujo con un septo de caucho en el cuello lado restante. Continuamente correr agua fría a través del condensador de reflujo. </li><li> Punción ªe septo de caucho del matraz de fondo redondo con una aguja conectada a una línea de gas N 2 y perforar tabique de caucho del condensador de reflujo con una aguja conectada a una línea de gas corriendo a un burbujeador (es decir, matraz con agua) para visualizar de salida de gas. </li><li> Instale una paleta de hoja en el cuello central del matraz de fondo redondo a través de un adaptador de paddle. Coloque el eje de la paleta de cuchilla para un agitador de cabeza montado en un soporte. </li></ol></li><li> Purgar el matraz de fondo redondo con gas N2 y dejar N2 gas que fluye a una velocidad baja, pero detectable. </li><li> Retire el condensador de reflujo desde el matraz de fondo redondo y añadir 1,000 g de hierro (III) cloruro, 0,6125 g de hierro (II) tetrahidrato de cloruro, y 50 ml de de-gaseados H 2 O. ¡CUIDADO! hierro (III) y cloruro de hierro (II) tetrahidrato de cloruro son perjudiciales -, usar equipo de protección personal. </li><li> Vuelva a colocar el condensador de reflujo y se agita a 1000 rpm mientras se calienta a 50° C. La agitación en estas condiciones produce 10 nanopartículas de magnetita nm de diámetro. </li><li> Una vez en 50 ° C, añadir 10 ml de solución de hidróxido de amonio al 28% mediante la inyección a través del septo de caucho en el matraz de fondo redondo mientras que todavía se agitaba. ¡CUIDADO! hidróxido de amonio es perjudicial -, usar equipo de protección personal. NOTA: La solución de hidróxido de amonio se utiliza para precipitar la magnetita y la solución debe volverse negro. </li><li> Quitar el tapón de caucho y N 2 línea de gas desde el matraz de fondo redondo y se calienta a 90 ° C a hervir el gas amoniaco mientras que todavía se agitaba. NOTA: Es opcional para mantener el flujo de N 2 en el matraz de fondo redondo por punción de tabique de caucho del condensador de reflujo, sin embargo, la oxidación de la magnetita a maghemita es insignificante durante este paso. </li><li> Una vez en 90 ° C, añadir 1 ml de ácido oleico a la matraz de fondo redondo mientras que todavía se agitaba. El ácido oleico se utiliza para recubrir la magnetita nanoparticles para formar gel de magnetita. ¡CUIDADO! ácido oleico es perjudicial -, usar equipo de protección personal. </li><li> Vuelva a colocar el tapón de goma y N 2 línea de gas en el matraz de fondo redondo y retire el condensador de reflujo. </li><li> Apagar el fuego y revuelva a 500 rpm durante 2 horas. </li><li> Retire el matraz de fondo redondo desde el calentador isomantle y decantar el líquido sobrante durante el uso de un imán fuerte sostenido contra la parte inferior del matraz para retener el gel de magnetita. ¡CUIDADO! manejar el imán fuerte con extremo cuidado para evitar daños o lesiones. </li><li> Permita gel de magnetita a O-aire seco / N (opcional). </li></ol> 2. Purificación de la magnetita de Gel <ol><li> Añadir 40 ml de hexano en el matraz de fondo redondo para disolver el gel de magnetita ¡CUIDADO! hexano es perjudicial -, usar equipo de protección personal y el trabajo en una campana de humos. </li><li> Use un embudo de separación con 40 ml de de-gaseados H2O para eliminar H 2 O residual frosoy la solución magnetita. <ol><li> Vierta lentamente la solución de magnetita en el H 2 O en el embudo de decantación y agitar suavemente el líquido de dos fases durante 5 minutos. </li><li> Escurra y deseche la fracción acuosa inferior. </li><li> Poco a poco agregue 40 ml de de-gaseados H2O para el embudo de separación de tal manera que se instala debajo de la solución de magnetita y agitar suavemente y drene como antes. </li><li> Repetir para lavar por tercera vez. </li></ol></li><li> Transfiera la solución de magnetita a un matraz Erlenmeyer, añadir unas espátulas valor de sulfato de sodio anhidro, y agitar para eliminar cualquier H 2 O residual que queda de la solución de magnetita. </li><li> Filtrar la solución a través de papel de filtro de magnetita 1 m en un embudo de filtro para eliminar el sulfato de sodio y H 2 O. residual NOTA: Se recomienda la asistencia de vacío. </li><li> Transferir la solución de magnetita a un matraz de evaporación de 50 ml y el uso de un evaporador rotatorio para evaporar el hexano durante2 h con las siguientes condiciones: Velocidad de rotación moderada, el vacío aplicado, evaporando matraz en un baño de agua 50 ° C, y 24 ° C de circulación de agua a través del condensador. NOTA: De forma opcional, almacenar el gel magnetita antes de recubrir con PLGA. </li></ol> 3. Recubrimiento de nanopartículas de magnetita con PLGA Shell <ol><li> Disolver 3,60 g de PLGA (75/25 mezcla) en 240 ml de acetato de etilo para crear un (m / v) solución de 1,5%. PRECAUCIÓN: acetato de etilo es perjudicial -, usar equipo de protección personal y el trabajo en una campana de humos. </li><li> Disolver 25,00 g de Pluronic F-127 en 500 ml de de-gaseados H 2 O usando un agitador magnético para crear un (m / v) solución de 5,0%. NOTA: Pluronic F-127 es un copolímero de bloques anfifílico no iónico que actúa como un agente tensioactivo biocompatible. Esto ayuda a estabilizar la emulsión aceite-en-agua en la etapa 3.3.2. </li><li> Utilizando una microespátula, recoger el gel de magnetita en seis alícuotas 0,040 g dentro de viales de vidrio ponderados. Perform el siguiente proceso de recubrimiento y lavado para cada alícuota. NOTA: Las alícuotas son necesarias para asegurar una manipulación eficiente y decantación magnética, que maximizará pureza y el rendimiento y reducir al mínimo la degradación antes de la liofilización en el paso 4. <ol><li> Añadir un 0,040 g alícuota de gel de magnetita y 40 ml de la solución de PLGA a un vaso de precipitados de plástico y se somete a ultrasonidos en un limpiador ultrasónico durante 10 minutos. </li><li> Añadir 80 ml de la solución de Pluronic al vaso de precipitados de plástico y emulsionar inmediatamente con un mezclador de laboratorio en la posición más alta durante 7 minutos para formar el revestimiento de PLGA en las nanopartículas de magnetita como una emulsión de aceite-en-agua. </li><li> Inmediatamente diluir la solución SPION en 1 litro de H2O desionizada y sonicar durante 1 h en una campana de extracción química para evaporar el acetato de etilo. </li><li> Coloque un imán fuerte junto a la solución SPION y revuelva suavemente para recoger SPIONs parduscos en el imán. NOTA: Puede ser necesario agitar de forma intermitente durante varias horass antes de que la solución se vuelve blanquecina que indica que la mayoría de los SPIONs se han recogido. </li><li> Decantar la solución acuosa al tiempo que conserva los SPIONs en el vaso de precipitados con el imán. </li><li> Lavar las SPIONs tres veces como sigue. <ol><li> Suspender los SPIONs en 1 litro de H2O desionizada </li><li> Sonicar la solución SPION durante 20 minutos. </li><li> Coloque un imán fuerte junto a la solución SPION y revuelva suavemente para recoger SPIONs parduscos en el imán. Puede ser necesario agitar intermitentemente durante varias horas antes de que la solución se vuelve clara que indica que la mayoría de los SPIONs han sido recogidos. </li><li> Decantar la solución acuosa al tiempo que conserva los SPIONs en el vaso de precipitados con el imán. </li></ol></li></ol></li><li> Recoge los SPIONs sintetizados a partir de cada una de las seis partes alícuotas de gel de magnetita en un único vial de vidrio ponderada como una suspensión acuosa. Opcionalmente decantar el exceso de agua magnéticamente según sea necesario. </li></ol> 4. CongelaciónSECADO de SPIONs <ol><li> Congelar la solución SPION. </li><li> Liofilizar la solución SPION O / N en un liofilizador. </li><li> Pesar los SPIONs liofilizados. SPIONs liofilizados pueden almacenarse a -20 ° C hasta su uso para el marcaje celular. NOTA: El almacenamiento a -20 ° C dramáticamente reduce la cinética de degradación y aumenta la vida útil. </li></ol> 5. Etiquetado de células con SPIONs <ol><li> Suspender una alícuota de SPIONs en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una concentración de 40 mg / ml y sonicar durante 30 minutos. </li><li> Añadir la solución a un matraz SPION casi confluente de células a una concentración de 5 l / ml de medio de cultivo celular. Asegurar una distribución uniforme moviendo suavemente el matraz. </li><li> Se incuban las células durante 16 horas a 37 ° C. </li><li> Aspirar suavemente el medio de cultivo y lavar las células dos veces con PBS. </li><li> Recoger las células marcadas magnéticamente y usar para los experimentos. </li><li> Solución SPION no utilizado se puede almacenar a 4 ° C y debe ser nosotrosed dentro de unos meses. Sonicar durante 30 minutos antes de cada uso. </li></ol>

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<li>Sun, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+labeling+of+endothelial+progenitor+cells+isolated+from+peripheral+blood+with+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med+Rep%22%5BJournal%5D)">In vitro labeling of endothelial progenitor cells isolated from peripheral blood with superparamagnetic iron oxide nanoparticles.</a> Mol Med Rep. 6 (2), 282-286 (2012).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+viability+of+transplanted+beta+cells+labeled+with+a+novel+contrast+agent+-+polyvinylpyrrolidone-coated+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles+by+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Media+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Detection of viability of transplanted beta cells labeled with a novel contrast agent - polyvinylpyrrolidone-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles by magnetic resonance imaging.</a> Contrast Media Mol Imaging. 7 (1), 35-44 (2012).</li>
<li>Song, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+efficacy+of+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles+to+human+neural+stem+cells%3A+comparison+of+ferumoxides%2C+monocrystalline+iron+oxide%2C+cross-linked+iron+oxide+%28CLIO%29-NH2+and+tat-CLIO%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+J+Radiol%22%5BJournal%5D)">Labeling efficacy of superparamagnetic iron oxide nanoparticles to human neural stem cells: comparison of ferumoxides, monocrystalline iron oxide, cross-linked iron oxide (CLIO)-NH2 and tat-CLIO.</a> Korean J Radiol. 8 (5), 365-371 (2007).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Como con cualquier protocolo de síntesis de nanopartículas, la pureza de los productos químicos reactivos es crítico para la consecución de SPIONs de alta calidad que tendrán efectos citotóxicos mínimos. Por tanto, es importante adquirir reactivos muy puros incluyendo el ácido oleico (≥99%), hierro (II) tetrahidrato de cloruro de (≥99.99%), (III) cloruro de hierro (≥99.99%), acetato de etilo (grado HPLC, ≥99.9% ), hexano (grado HPLC, ≥97.0%), hidróxido de amonio (≥99.99%), y sulfato de sodio (≥99.0%). Es de particular i...

La entrega y captura dirigida de células a sitios específicos dentro del cuerpo es deseable para una variedad de aplicaciones biomédicas. La administración de células madre neurales al cerebro mediante ultrasonido focalizado guiado por resonancia magnética se ha propuesto como una posible opción de tratamiento para la enfermedad neurodegenerativa, la lesión cerebral traumática y el accidente cerebrovascular1. Las células madre mesenquimales están siendo estudiadas por su capacidad para administrar fármacos anticancerígenos a los tumores debido a sus propiedades tumorales naturales2,3. Las células madre cardíacas han sido suministradas al corazón como un posible tratamiento para el infarto de miocardio4,5. Se han desarrollado stents vasculares con anticuerpos CD34 para capturar células progenitoras circulantes6. Aunque prometedores, estos enfoques de segmentación celular presentan inconvenientes, como la falta de especificidad celular, la retención celular inconsistente y la administración de células fuera del objetivo.
El objetivo general del método actual es permitir la orientación dirigida magnéticamente de las células para una variedad de aplicaciones de entrega y clasificación de células. La focalización magnética permite la entrega controlada de células específicas a un sitio objetivo específico con efectos mínimos fuera del objetivo7. Los campos magnéticos pueden ser generados por dispositivos implantados o externos para dirigir de manera segura el movimiento de las células marcadas magnéticamente dentro del cuerpo8. Numerosos esfuerzos de investigación se han centrado en la dirección magnética de las células madre a los tejidos lesionados, como el corazón9-14, la retina15, el pulmón16, la piel17, la médula espinal18,19, el hueso20, el hígado21 y el músculo22,23 con el fin de mejorar los resultados de la regeneración.
La orientación magnética de las células también se ha estudiado ampliamente como un medio para endotelizar dispositivos cardiovasculares implantables. Un endotelio uniforme y completo proporciona una barrera entre el dispositivo y los elementos sanguíneos circulantes para mitigar la trombosis y la inflamación. Las células endoteliales pueden ser entregadas al dispositivo ya sea antes de la implantación o a través del sistema vascular después de la implantación. En ambos casos, los campos magnéticos se utilizan para capturar células en la superficie del dispositivo y retener las células cuando se someten a la tensión de cizallamiento generada por la sangre circulante. Los stents vasculares magnéticos24-27 y los injertos vasculares28 han sido fabricados y probados para este propósito.
La focalización de células magnéticas requiere una estrategia para etiquetar las células con partículas portadoras magnéticas. Estas partículas pueden unirse a la superficie de las células a través de anticuerpos o pares de ligandos/receptores, o pueden ser endocitadas en las células. Las nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro (SPION) son biodegradables, biocompatibles y fácilmente endocitosas por una variedad de tipos de células29. Estas partículas hacen que una célula responda eficazmente a los campos magnéticos y se degradan naturalmente con el tiempo. Los SPION proporcionan un medio sencillo y seguro de marcar magnéticamente células en cultivo para una variedad de aplicaciones de clasificación y orientación magnética. Se proporciona un método para sintetizar SPIONs con un núcleo de magnetita (Fe3O4) y una capa de ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA). Además, se proporciona un método para etiquetar células en cultivo con SPIONs.

<table><tbody><tr><td>Solución de hidróxido de amonio, 28% NH3 en H2O, &ge; Base de metal traza al 99,99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338818-100ML&nbsp;</td><td>Reactivo nocivo: use equipo de protección personal</td></tr><tr><td>Frasco Dreschel, 500 ml</td><td>Ace Glass</td><td>5516-16</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de etilo, CHROMASOLVR Plus, para HPLC, 99,9%&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650528-1L</td><td>Reactivo nocivo: use equipo de protección personal y trabaje en una campana</td></tr> extractora <tr><td>Alcohol etílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>Reactivo nocivo: use equipo de protección personal</td></tr><tr><td>Matraz evaporador, 50 ml, junta 24/40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z515558</td><td>Para uso con rotoevaporador</td></tr><tr><td>Papel de filtro, 3 cm de diámetro, grado 1</td><td>Fisher</td><td>09-805P</td><td>Para usar con embudo de filtro de vidrio</td></tr><tr><td>Vasos de precipitados de vidrio, 1 L</td><td>Fisher</td><td>FB-101-1000</td><td>Para lavar SPIONs</td></tr><tr><td>Embudo de filtro de vidrio, adaptador de manguera de vacío, para 24/40, 30 mL</td><td>Fisher</td><td>K954100-0344&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tapones de vidrio para viales</td><td>Fisher</td><td>03-391-46</td><td>Para usar con viales de vidrio Viales de</td></tr><tr><td>vidrio, 2 ml</td><td>Fisher</td><td>03-391-44</td><td>Para recolectar gel de magnetita & SPIONs</td></tr><tr><td>Hexano, CHROMASOLVR, para HPLC, &ge; 97.0% (GC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34859-1L&nbsp;</td><td>Reactivo dañino: use equipo de protección personal y trabaje en la campana extractora</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td>Reactivo nocivo: use equipo de protección personal y trabaje en la campana extractora</td></tr><tr><td>Cloruro de hierro (II) tetrahidratado, &ge; 99.99% base de metales traza&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>380024-5G</td><td>Reactivo nocivo: use equipo de protección personal</td></tr><tr><td>Cloruro de hierro (III) anhidro, polvo, &ge; Base de metales traza al 99,99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>451649-1G</td><td>Reactivo nocivo: use equipo de protección personal</td></tr><tr><td>Calentador Isomantle, 500 mL</td><td>Voight Global</td><td>EM0500/CEX1</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador de laboratorio</td><td>Silverson</td><td>L5M-A</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizador</td><td>Labconco</td><td>7670520</td><td></td></tr><tr><td>Microespátulas</td><td>Fisher</td><td>21-401-25A</td><td>Para la transferencia de magnetita gel</td></tr><tr><td>Imán de NdFeB, 1 pulgada x 1 pulgada x 1</td><td>pulgada Imanes asombrosos</td><td>C1000H-M</td><td>Imán muy fuerte, maneje con cuidado</td></tr><tr><td>Ácido oleico, &ge; 99% (GC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1008-5G&nbsp;</td><td>Almacenar en el congelador; Reactivo nocivo: use equipo de protección personal</td></tr><tr><td>Agitador aéreo</td><td>IKA</td><td>2572201</td><td></td></tr><tr><td>Pinza para agitador aéreo</td><td>IKA</td><td>2664000</td><td>Para uso con agitador aéreo</td></tr><tr><td>Agitador aéreo Soporte en H IKA</td><td></td><td>1412000</td><td>Para uso con agitador</td></tr> aéreo <tr><td>Salina tamponada con fosfato</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Vasos de precipitados de plástico, 250 ml</td><td>Fisher</td><td>02-591-28</td><td></td></tr><tr><td>PLGA PURASORB PDLG (mezcla 75/25)</td>También se puede utilizar <td>Purac</td><td>PDLG 7502</td><td>PDLG 7502A; Almacenar en el congelador</td></tr><tr><td>Pluronic F-127 polvo, BioReactivo, apto para cultivo celular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443-250G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Paleta de cuchilla expandible de PTFE, 8 mm de diámetro</td><td>SciQuip</td><td>SP4018</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de recipiente de PTFE, para paletas 24/40, 8 mm de diámetro</td><td>Adaptador de recipiente de PTFE Monmouth Scientific A480</td><td>Para usar con paleta de cuchilla expandible de PTFE</td><td></td></tr><tr><td>Enfriador de recirculación</td><td>Clarkson</td><td>696613</td><td>Para usar con rotoevaporador</td></tr><tr><td>Condensador de reflujo, para 24/40, 250 mm</td><td>Ace Glass</td><td>5997-133</td><td></td></tr><tr><td>Rotoevaporador</td><td>Clarkson 216949</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tabiques de goma, se adapta a 24/40</td><td>Ace Glass</td><td>9096-56</td><td></td></tr><tr><td>Embudo separador con tapón, 250 ml</td><td>Fisher</td><td>10-438E</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de sodio ACS reactivo, &ge; 99.0%, anhidro, granular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239313-500G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de fondo redondo de tres cuellos, acodado, 24/40 juntas, 500 ml</td><td>Ace Glass</td><td>6948-16</td><td></td></tr><tr><td>Limpiador ultrasónico bandeja perforada</td><td>Fisher</td><td>15-335-20A</td><td>Para usar con limpiador ultrasónico</td></tr><tr><td>Limpiador ultrasónico, 2,8 L</td><td>Fisher</td><td>15-335-20</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de vacío</td><td>Clarkson</td><td>216639</td><td>Para uso con rotoevaporador (opcional)</td></tr><tr><td>Vacío bomba</td><td>Clarkson 219959</td><td></td><td>Para uso con rotoevaporador</td></tr></tbody></table>

etiquetado celular y orientación con superparamagnético nanopartículas de óxido de hierro

Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

La administración dirigida de las células y agentes terapéuticos se beneficiaría de una amplia gama de aplicaciones biomédicas concentrando el efecto terapéutico en el sitio diana, mientras que se minimizan los efectos deletéreos a sitios desviado. Focalización celular magnética es una técnica de suministro eficiente, seguro y sencillo. Nanopartículas de óxido de hierro superparamagnético (SPION) son biodegradables, biocompatibles, y pueden ser endocitosis en células para hacerlos sensibles a los campos magnéticos. El proceso de síntesis implica la creación de magnetita (Fe 3 O 4) Nanopartículas seguido por emulsificación de alta velocidad para formar un poli (ácido láctico-co-glicólico) revestimiento (PLGA). Los SPIONs PLGA-magnetita son de aproximadamente 120 nm de diámetro incluyendo el núcleo de magnetita diámetro aproximadamente 10 nm. Cuando se coloca en medio de cultivo, SPIONs son naturalmente endocitosis por las células y se almacenan como pequeños grupos dentro de endosomas citoplasmáticos. Estas partículas imparten masa magnética suficiente para las célulaspara permitir la orientación dentro de los campos magnéticos. Numerosos clasificación de células y aplicaciones dirigidas están habilitadas por la prestación de diversos tipos de células sensibles a los campos magnéticos. SPIONs tienen una variedad de otras aplicaciones biomédicas, así como el uso como agente de contraste de imagen médica, la administración de fármacos o gen diana, ensayos de diagnóstico, y la generación de la hipertermia local para la terapia de tumores o de soldadura de tejidos.

Nanopartículas de magnetita son de aproximadamente 10 nm de diámetro, como resultado de agitación una solución acuosa de hierro (III) y cloruro de hierro (II) cloruro tetrahidrato a 50 ° C y 1000 rpm (Figura 1). Estos resultados demuestran la síntesis exitosa de nanopartículas de magnetita. Es importante para verificar el tamaño y la forma de nanopartículas de magnetita tomadas de una pequeña muestra del lote cuando se intenta la síntesis por primera vez. Microscopía electrónica de transmisión (TEM) es ...

La administración celular dirigida es útil en una variedad de aplicaciones biomédicas. El objetivo de este protocolo es utilizar nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro (SPION) para marcar células y, por lo tanto, permitir enfoques de orientación de células magnéticas para un alto grado de control sobre la entrega y localización de células.

Etiquetado Celular y Orientación con superparamagnético nanopartículas de óxido de hierro

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the ...

El objetivo general de este procedimiento es sintetizar nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro y utilizar esas partículas para etiquetar células en aplicaciones de direccionamiento y separación magnéticos. Esto se logra primero sintetizando nanopartículas de magnetita con un diámetro de 10 nanómetros. El segundo paso consiste en recubrir las nanopartículas de magnetita con una capa de ácido poliláctico co glicólico o PLGA de 50 nanómetros de espesor.A continuación, las nanopartículas magnéticas se lavan y liofilizan. El paso final consiste en etiquetar células con nanopartículas magnéticas para aplicaciones de direccionamiento y clasificación celular. Finalmente, se utiliza microscopía fluorescente para mostrar el direccionamiento de células marcadas con nanopartículas magnéticas dentro de campos magnéticos.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el direccionamiento celular mediado por anticuerpos es que el direccionamiento celular magnético es altamente específico y controlable. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia terapias para una variedad de condiciones médicas, ya que las células terapéuticas pueden ser entregadas al sitio diana mientras se preservan los sitios fuera del blanco. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque se requiere una atención cuidadosa a los detalles para obtener nanopartículas puras y de alta calidad.Queríamos mejorar el direccionamiento y la localización de células vivas dentro del cuerpo. Comience utilizando un frasco Dressel para desgasificar 500 mililitros de agua desionizada haciendo burbujear suavemente gas nitrógeno durante 30 minutos. Para montar el aparato de reacción, coloque un matraz redondo de tres bocas de 500 mililitros dentro de un calentador con manta ISO.A continuación, cubra un lado del cuello con un septum de goma e instale un condensador de reflujo en el otro. Pase agua fría continuamente a través del condensador para establecer una atmósfera inerte para la reacción. Primero, atraviese el septum de goma del matraz con una aguja conectada a una línea de gas nitrógeno.Luego, punce el séptimo del condensador con una aguja conectada a un burbujeador para visualizar el flujo de gas de salida. A continuación, instale un pedal de paleta en el cuello central mediante un adaptador de paleta. Para mantener una agitación constante de la mezcla de reacción, conecte el eje de la paleta a un agitador superior montado en un soporte.Purgue el matraz con gas nitrógeno y mantenga un flujo de nitrógeno en el matraz a una velocidad baja pero detectable. Luego retire el condensador de reflujo y agregue un gramo de cloruro de hierro tres, 612,5 miligramos de cloruro de hierro dos tetra y 50 mililitros de agua desgasificada. Reemplace el condensador y agite la reacción a 1000 RPM mientras calienta hasta 50 grados Celsius.Esto producirá partículas de magnetita con un diámetro de 10 nanómetros. Una vez que la reacción alcance 50 grados Celsius, use una jeringa para inyectar 10 mililitros de hidróxido de amonio al 28 % a través del septo del matraz. A medida que la magnetita precipite, la solución debe volverse negra.Retire el septum de goma y la línea de gas, y caliente la reacción a 90 grados Celsius. A continuación, agregue un mililitro de ácido oleico al matraz para recubrir las nanopartículas y formar el gel de magnetita. Luego, reemplace el septum y la línea de gas en el matraz y retire el condensador.Apague el calor y agite la reacción a 500 RPM durante dos horas. Después de agitar, vierta el líquido en exceso mientras mantiene las nanopartículas en el fondo del matraz con un imán fuerte. Para comenzar la purificación, primero disuelva el gel de magnetita en 40 mililitros de hexanos.Vierta lentamente esta solución en un embudo de separación que contiene 40 mililitros de agua desgasificada y agite suavemente el embudo durante cinco minutos. Después de agitar, vierta la fracción acuosa inferior y lave la solución de magnetita dos veces más con agua desgasificada de manera similar. A continuación, transfiera la solución de magnetita a un matraz erlenmeyer.Seque la solución añadiendo varias espátulas de sulfato de sodio y agitando la mezcla. Luego, aplique vacío. Filtre la mezcla a través de un papel de filtro de un micrómetro.Configure la temperatura del baño de agua de un evaporador rotatorio a 50 grados Celsius con agua a 24 grados Celsius circulando a través del condensador. Luego, transfiera el filtrado a un matraz evaporador de 50 mililitros y evapore los hexanos durante dos horas a una velocidad de rotación moderada bajo vacío. En viales de vidrio, recoja el gel de magnetita en seis alícuotas de 40 miligramos; el recubrimiento y lavado se realizarán por separado en cada alícuota. Agregue una alícuota del gel junto con 40 mililitros de PLGA en acetato de etilo en un vaso de precipitados de plástico y someta la mezcla a ultrasonido durante 10 minutos.A continuación, agregue 80 mililitros de F1 27 onic al vaso de precipitados y emulsifique inmediatamente con una mezcladora a velocidad alta durante siete minutos. Estas nanopartículas son ahora nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro o spy; diluya la solución con un litro de agua desionizada y sométala a ultrasonido en una campana extractora durante una hora. Luego coloque un imán potente junto a la solución y agite suavemente para recoger las spy en el imán.Decante la disolución acuosa conservando los estolones de S en el vaso de precipitados. Lave los estolones de S tres veces con agua, centrifugando cada vez. Después de que las seis alícuotas hayan sido recubiertas y lavadas.Recolecte los vástagos S en un solo vial de vidrio. Liofilice la solución de spy durante la noche en un liofilizador para prepararla para la marcación celular. Primero, suspenda el pyon en PBS a una concentración de 40 miligramos por mililitro y sométalo a sonicación durante 30 minutos.A continuación, agregue la solución a un matraz con células casi confluentes, en una concentración de cinco microlitros por mililitro de medio de cultivo celular. Agite suavemente el matraz para distribuir uniformemente la solución. Incube las células durante 16 horas.A 37 grados Celsius. Aspire suavemente el medio de cultivo y luego lave las células dos veces. Con PBS, las células marcadas magnéticamente ya pueden utilizarse para experimentos.Las nanopartículas de magnetita con un diámetro de 10 nanómetros se pueden obtener de forma consistente agitando una solución acuosa de cloruro de hierro tres y cloruro de hierro dos tetrahidrato a 50 grados Celsius y 1000 RPM. La microscopía electrónica de transmisión o TEM es el método preferido para determinar el tamaño de las partículas. Recubrir las nanopartículas de magnetita con PLGA utilizando un emulsionador de alta velocidad produce de forma reproducible PLGA, escisiones de magnetita con un diámetro de 120 nanómetros. La microscopía electrónica de barrido o SEM se utiliza para visualizar estas partículas. La incubación de células endoteliales derivadas de sangre con pyon durante 16 horas da como resultado la endocitosis de las nanopartículas, utilizando TEM. Las nanopartículas de PLGA-magnetita pueden visualizarse dentro de la célula, donde se almacenan en endosomas citoplasmáticos.La incorporación de hierro en las células es suficientemente elevada como para lograr la captura magnética de células viables hacia dispositivos médicos implantables ferromagnéticos. Las células endoteliales marcadas magnéticamente son atraídas hacia un stent ferromagnético a una tasa mayor que hacia un stent no magnético. Al realizar este procedimiento, es importante recordar lavar cuidadosamente todo el material de vidrio y los equipos para maximizar la pureza y la seguridad de las nanopartículas tras seguir este procedimiento.Otros métodos, como la orientación magnética de células, pueden realizarse para responder preguntas adicionales, como qué terapias médicas pueden beneficiarse de la administración específica y controlada de células. Esta tecnología de orientación magnética permitirá el desarrollo de la administración focalizada de células para una variedad de aplicaciones biomédicas. Después de ver este video, usted debería tener una buena comprensión de cómo sintetizar nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro y utilizar esas partículas para marcar células en aplicaciones de orientación magnética.

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