Etiquetado Celular y Orientación con superparamagnético nanopartículas de óxido de hierro

El objetivo general de este procedimiento es sintetizar nanopartículas de óxido de hierro superparamagnéticas y utilizar esas partículas para etiquetar células para aplicaciones de clasificación y orientación magnética. Esto se logra sintetizando primero nanopartículas de magnetita de 10 nanómetros de diámetro. El segundo paso es recubrir las nanopartículas de magnetita con una capa de 50 nanómetros de espesor de ácido coglicólico poliláctico o PLGA.

A continuación, las nanopartículas magnéticas se lavan y se liofilizan. El paso final es el etiquetado de células con nanopartículas magnéticas para aplicaciones de selección y selección de células. En última instancia, la microscopía fluorescente se utiliza para mostrar la orientación de las células marcadas con nanopartículas magnéticas dentro de los campos magnéticos.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la segmentación celular mediada por anticuerpos, es que la focalización magnética de células es altamente específica y controlable. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia para una variedad de condiciones médicas, ya que las células terapéuticas se pueden administrar en el sitio objetivo, mientras que las sitios fuera del objetivo se conservan. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque se necesita una cuidadosa atención a los detalles para lograr nanopartículas puras y de alta calidad.

Queríamos mejorar la focalización y localización de las células vivas dentro del cuerpo. Comience usando una botella de dressel para desgasificar 500 mililitros de agua desionizada burbujeando suavemente gas nitrógeno durante 30 minutos. Para configurar el aparato de reacción, coloque un matraz de fondo redondo de tres cuellos y 500 mililitros dentro de un calentador de manto ISO.

A continuación, cubra un cuello lateral con un tabique de goma e instale un condensador de reflujo en el otro. Haga correr continuamente agua fría a través del condensador para establecer una atmósfera inerte para la reacción. Primero, perfore el tabique de goma de los matraces con una aguja conectada a una línea de gas nitrógeno.

A continuación, perfore el tabique del condensador con una aguja conectada a un burbujeador para visualizar la salida de gas. A continuación, instale un pedal de cuchilla en el centro del cuello con un adaptador de paleta. Para mantener una agitación constante de la mezcla de reacción, conecte el eje de la cuchilla a un agitador superior montado en un soporte.

Purgue el matraz con gas nitrógeno y deje que el nitrógeno fluya hacia el matraz a una velocidad baja pero detectable. Luego retire el condensador de reflujo y agregue un gramo de hierro, tres cloruros, 612,5 miligramos de hierro, dos cloruros tetra y 50 mililitros de agua Degas. Reemplace el condensador y agite la reacción a 1000 RPM mientras se calienta a 50 grados centígrados.

Esto producirá partículas de magnetita de 10 nanómetros de diámetro. Una vez que la reacción haya alcanzado los 50 grados centígrados, utilice una jeringa para inyectar 10 mililitros de hidróxido de amonio al 28% a través del tabique del matraz. A medida que la magnetita precipita, la solución debe volverse negra.

Retire el tabique de goma y la línea de gas, y caliente la reacción a 90 grados centígrados. A continuación, añade un mililitro de ácido oleico al matraz para recubrir las nanopartículas y formar el gel de magnetita. A continuación, reemplace el tabique y la línea de gas en el matraz y retire el condensador.

Apague el fuego y revuelva la reacción a 500 RPM durante dos horas. Después de agitar, decantar el exceso de líquido mientras sostiene las nanopartículas en el fondo del matraz con un imán fuerte. Para comenzar la purificación, primero disuelva el gel de magnetita en 40 mililitros de hexanos.

Vierta lentamente esta solución en un embudo separador que contenga 40 mililitros de agua Degas y agite suavemente el embudo durante cinco minutos. Después de decantar la fracción acuosa inferior, lave la solución de magnetita dos veces más con agua Degas de manera similar. A continuación, transfiera la solución de magnetita a un matraz erlenmeyer.

Seque la solución agregando varias espátulas de sulfato de sodio y agitando la mezcla. A continuación, aspire. Filtre la mezcla a través de un micrómetro de papel de filtro.

Ajuste la temperatura del baño de agua de un evaporador rotativo a 50 grados centígrados con 24 grados centígrados de agua circulando a través del condensador. A continuación, transfiera el filtrado a un matraz evaporador de 50 mililitros y evapore los hexanos durante dos horas a una velocidad de rotación moderada al vacío. En viales de vidrio, recoja el gel de magnetita en seis capas de alícuota de 40 miligramos y se lavará cada alícuota por separado, agregue una alícuota de gel junto con 40 mililitros de PLGA en acetato de etilo en un vaso de precipitados de plástico y sonique la mezcla durante 10 minutos.

A continuación, añada 80 mililitros de onic F1 27 al vaso de precipitados y emulsione inmediatamente con una batidora a temperatura alta durante siete minutos. Estas nanopartículas ahora son nanopartículas de óxido de hierro súper paramagnéticas o espiar diluir la solución con un litro de agua desionizada y sonicar en una campana extractora durante una hora. A continuación, coloque un imán potente junto a la solución y revuelva suavemente la solución para recoger el espía en el imán.

Decanta la solución acuosa mientras conservas los vástagos S en el vaso de precipitados. Lave los vástagos S tres veces con agua fornicando cada vez. Después de todo, se han recubierto y lavado las seis alícuotas.

Recoja los vástagos S en un solo frasco de vidrio. Liofiliza la solución espía durante la noche en un liofilizador para prepararla para el marcaje celular. Primero: Suspenda el pyon en PBS a una concentración de 40 miligramos por mililitro y sonique durante 30 minutos.

A continuación, añada la solución a un matraz de células casi confluenciales a una concentración de cinco microlitros por mililitro de cultivo celular. Medio. Agite el matraz para distribuir uniformemente el Sion. Incubar las células durante 16 horas.

A 37 grados centígrados. Aspire suavemente el medio de cultivo y luego lave las células dos veces. Con PBS, las células marcadas magnéticamente ahora se pueden utilizar para experimentos.

Las nanopartículas de magnetita con un diámetro de 10 nanómetros se pueden fabricar de manera consistente agitando una solución acuosa de tres cloruros de hierro y tetrahidrato de dos cloruros de hierro a 50 grados Celsius y 1000 RPM, la microscopía electrónica de transmisión o TEM es el método preferido para determinar el tamaño de partícula, el recubrimiento de las nanopartículas de magnetita con PLGA utilizando un emulsionante de alta velocidad da como resultado reproducible PLGA, Se utilizan vástagos de magnetita S con un diámetro de 120 nanómetros, microscopía electrónica de barrido o SEM para visualizar estas partículas. La incubación de las células endoteliales de crecimiento sanguíneo con pyon durante 16 horas da lugar a la endocitosis de las nanopartículas mediante TEM. Las nanopartículas de magnetita PLGA se pueden visualizar en la célula o se almacenan dentro de endosomas citoplasmáticos.

La carga de hierro en las células es lo suficientemente alta como para lograr la captura magnética de células viables en dispositivos médicos implantables ferromagnéticos. Las células endoteliales marcadas magnéticamente son atraídas por un stent ferromagnético a una velocidad mayor que un stent no magnético. Al intentar este procedimiento, es importante recordar lavar a fondo toda la cristalería y el equipo para maximizar la pureza y seguridad de las nanopartículas.

Se pueden realizar otros métodos, como la focalización magnética de células, para responder a preguntas adicionales, como qué terapias médicas pueden beneficiarse de la administración específica y controlada de células. Esta tecnología de focalización magnética permitirá el desarrollo de la administración de células focalizadas para una variedad de aplicaciones biomédicas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo sintetizar nanopartículas de óxido de hierro superparamagnéticas y usar esas partículas para etiquetar celdas para aplicaciones de orientación magnética.