Name: Métodos para inhibir bacteriana Pyomelanin Producción y determinar el correspondiente aumento en la sensibilidad al estrés oxidativo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Aprende a inhibir la producción de piomelanina bacteriana con NTBC y evalúa el aumento de sensibilidad al estrés oxidativo mediante ensayos de placas con peróxido de hidrógeno.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Los autores agradecen a Dara Frank y Carrie Harwood por su generosa contribución de cepas. La Fundación de Investigación de Milwaukee de la Universidad de Wisconsin posee la patente n.º 8.354.451; con afirmaciones ampliamente dirigidas a tratar o inhibir la progresión de la infección de un microorganismo en un paciente mediante la administración de un compuesto inhibidor de la 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenasa como la 2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-ciclohexanediona (NTBC). Los inventores son Graham Moran y Pang He. Esta investigación fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud (R00-GM083147). La biblioteca de transposones mutantes P. aeruginosa de la Universidad de Washington cuenta con el apoyo de la DK089507 P30 de los NIH.

1. Preparación de medios de cultivo, antibióticos, y 2- [2-nitro-4- (trifluorometil) benzoil] -1,3-ciclohexanodiona (NTBC) <ol><li> Hacer caldo LB (1% triptona, extracto de levadura 0,5%, 0,25% de NaCl en H 2 O) y alícuota en volúmenes apropiados. Esterilizar en autoclave. Almacenar a temperatura ambiente. </li><li> Hacer 100 ml de LB agar (1% triptona, extracto de levadura 0,5%, 0,25% de NaCl, 1,5% de agar en H 2 O) en matraces de 250 ml. Esterilizar en autoclave y almacenar a temperatura ambiente. Asegúrese de que el agar se derrita antes de verter en placas. NOTA: Los frascos que contienen 100 ml de agar LB producirá 4 platos. La cantidad de agar LB puede ser alterado para que se corresponda con el número de placas necesarias para el ensayo. </li><li> Hacer PBS (NaCl 137 mM, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4) 16. Esterilizar en autoclave o filtración y se almacena a temperatura ambiente. </li><li> Preparar las soluciones madre de antibióticos para la gentamicina, kanamicina, und tobramicina. <ol><li> Preparar las concentraciones de valores antibióticos apropiados para P. aeruginosa cepas que contienen 100 mg / ml de gentamicina, 30 mg / ml de kanamicina, y 10 mg / ml de tobramicina. Disolver los antibióticos en el agua, esterilizar filtro (0,2 micras), y se almacena a 4 ° C. Alterar los antibióticos y concentraciones dependiendo de la bacteria estudiada. </li></ol></li><li> Preparar las soluciones madre NTBC. Disolver 10 mg de NTBC en 400 l de DMSO. Esto produce una concentración de 75,9 mM NTBC. Tienda soluciones NTBC acciones a -20 ° C. Soluciones Descongelar a temperatura ambiente, según sea necesario. NOTA: Diferentes fuentes de NTBC tienen diferencias en la solubilidad. Determinar el vehículo apropiado en el que se disuelva el NTBC basado en las recomendaciones del fabricante y ajuste Paso 1.5 en consecuencia. </li></ol> 2. NTBC titulaciones de Cepas bacterianas <ol><li> Establecer cultivos de una noche de las cepas a ensayar. Añadir 2 ml de LB tubo de ensayo de caldo de 16 x 150 mms (uno por cepa) y inoculan con 1 aislada colonia de cada cepa. Incubar durante la noche a 37 ° C con aireación en un rotador de cultivo de tejidos en una incubadora de aire. </li><li> El día siguiente, se preparan titulaciones de NTBC en caldo LB. Utilice un rango inicial de 0 a 900 mM NTBC desde diferentes cepas tienen diferencias en la sensibilidad a la NTBC. <ol><li> Añadir 1 ml de caldo LB a 4 a 5 tubos de ensayo (16 x 150 mm) por cepa. </li><li> Añadir la solución madre NTBC (75,9 mM) a los tubos de ensayo (16 x 150 mm) en un intervalo de concentraciones. Ver Tabla 1 para las concentraciones NTBC y volúmenes de valores correspondientes a añadir a 1 ml de caldo LB. </li></ol></li><li> Mida la OD 600 de los cultivos de una noche. Lávese las culturas antes de tomar OD 600 lecturas para eliminar pyomelanin presente en los medios de comunicación. <ol><li> Lávese las culturas mediante la centrifugación de 1 ml de la cultura en una microcentrífuga a 16.000 xg durante 2 min. Eliminar el sobrenadante y las células sedimentadas vagamente conuna micropipeta y resuspender el sedimento celular sólida en 1 ml de LB. </li></ol></li><li> Inocular los tubos de titulación a una DO 600 0,05. Calcular la cantidad de cultivo se lavó necesaria para inocular los tubos. NOTA: Utilice las culturas lavadas para inoculaciones desde pyomelanin no debe estar presente. </li><li> Incubar los tubos de titulación durante aproximadamente 24 horas a 37 ° C con aireación usando un cultivo de tejido de los rotadores en una incubadora de aire. </li><li> Fotografiar los tubos de valoración y comparación de la producción de pigmento dentro y entre las cepas para determinar la cantidad de NTBC utilizar para los ensayos de MIC y el estrés oxidativo. Utilice OD 600 lecturas para determinar la cantidad de pyomelanin en la celda sobrenadante del cultivo libre y para determinar la densidad celular. NOTA: La relación de OD 600 de pyomelanin en el sobrenadante del cultivo de células se puede calcular para cuantificar las diferencias en la producción pyomelanin después del tratamiento con NTBC. </li></ol> 3. antibióticos inhibi mínimoConcentración (MIC) Ensayo tory en placas de 96 pocillos <ol><li> Establecer cultivos de una noche de las cepas a ensayar en LB con y sin NTBC. NOTA: Este protocolo se describe utilizando el nivel representativo de 300 M NTBC. El nivel apropiado de NTBC para ser utilizado se determina en el paso 2.6. <ol><li> Añadir 300 mM NTBC a 2 ml LB. Añadir un volumen equivalente de vehículo (DMSO) a 2 ml de LB para la condición no NTBC. </li><li> El uso de palillos de dientes estériles, inocular tubos con una colonia aislada de bacterias. Habrá una cultura con NTBC y una cultura sin NTBC para cada cepa. Incubar durante la noche a 37 ° C con aireación usando un cultivo de tejido de los rotadores en una incubadora de aire. </li></ol></li><li> Al día siguiente, hacer que las soluciones magistrales LB + DMSO LB + NTBC y para configurar el ensayo MIC. Añadir NTBC a una concentración de 600 mM como este se diluirá doble cuando se añade inóculo, produciendo una concentración final de 300 mM. <ol><li> Para probar un solo antibiótica de una cepa, añadir 600 M NTBC a 2 ml de LB y mezclar para que la solución principal NTBC. Añadir un volumen equivalente de vehículo (DMSO) a 2 ml de LB y se mezcla para hacer la solución ningún maestro NTBC. Utilice estas soluciones para crear soluciones madre de antibióticos, así como para la creación de la serie de dilución en placas de 96 pocillos. NOTA: Las formulaciones de solución maestros darán solución adicional para tener en cuenta los errores de pipeteo. Las soluciones magistrales se pueden escalar hacia arriba o hacia abajo según sea necesario en función de la cantidad de antibióticos y cepas probadas. </li></ol></li><li> Preparar las soluciones de antibióticos en las soluciones magistrales LB + NTBC o LB + DMSO. NOTA: La concentración de antibiótico en estas soluciones debería ser el doble de la concentración final deseada. Suficiente solución se debe hacer para transferir 100 l de cuatro pozos en una placa de 96 pocillos. <ol><li> Preparar gentamicina +/- NTBC solución madre a los 64 mg / ml. Para hacer esta solución, añadir 0,288 l de Stock gentamicina (100 mg / ml) para 450l LB + NTBC o solución maestro LB + DMSO. NOTA: La concentración máxima de gentamicina para P. aeruginosa PAO1 es 32 mg / ml. </li><li> Haga la kanamicina +/- NTBC solución madre a 256 g / ml. Para que esta solución, añadir 3,84 l de kanamicina social (30 mg / ml) a 450 mu l LB + NTBC o LB + DMSO soluciones magistrales. NOTA: La concentración máxima de kanamicina para P. aeruginosa PAO1 es 128 g / ml. </li><li> Preparar tobramicina +/- NTBC solución madre a 8 mg / ml. Para que esta solución, añadir 0,36 l de tobramicina social (10 mg / ml) a 450 mu l LB + NTBC o LB + DMSO soluciones magistrales. NOTA: Para P. aeruginosa PAO1, la concentración máxima de tobramicina es 4 mg / ml. NOTA: Los antibióticos y concentraciones se pueden ajustar para las bacterias a ensayar. </li></ol></li><li> Añadir 100 l de cada solución de antibiótico 2x para cuatro pozos en una placa de 96 pocillos. Coloque estas soluciones en la fila A. Para example, gentamicina debe ser colocado en A1 a A4, kanamicina debe ser colocado en A5 a A8, y tobramicina debe ser colocado en A9 a través de A12. Ver Figura 1A para un diagrama de una placa de 96 pocillos de configurar. NOTA: Múltiples antibióticos pueden ser probados en un plato, pero sólo una cepa debe ser probado por placa para eliminar el potencial de contaminación cruzada de otras cepas. </li><li> Añadir 50 l de la solución maestro LB + NTBC o LB + DMSO a las filas B a H de la placa de 96 pocillos. Asegúrese de que un plato es LB + NTBC y una placa es LB + DMSO. Ver Figura 1A. <ol><li> Utilice LB + NTBC para los antibióticos en LB + NTBC. Utilice LB + DMSO para los antibióticos en LB + DMSO. </li></ol></li><li> Usando una micropipeta realizar dos diluciones seriadas dobles de los antibióticos mediante la transferencia de 50 l de la solución de la fila A a la fila B. Mezcle la solución, cambiar las puntas de pipeta y transferir 50 l de la solución de la línea B de la fila C. Repita el procedimiento para el remainifilas NG. Después de diluir la fila G, retirar 50 l de la solución de esa fila y descarte. Utilice la fila H como un control de antibióticos para el crecimiento bacteriano. Ver Figura 1B. NOTA: Cada Un pozo en filas a G ahora contiene 50 l de antibióticos en LB + NTBC o LB + DMSO a 2X la concentración final deseada. Fila H contiene LB + NTBC o LB + DMSO sin antibióticos. </li><li> Mida la OD 600 de los cultivos de una noche. Lave todas las culturas antes de tomar OD 600 lecturas para eliminar pyomelanin presente en los medios de comunicación. <ol><li> Lávese las culturas mediante la centrifugación de 1 ml de la cultura en una microcentrífuga a 16.000 xg durante 2 min. Eliminar el sobrenadante con una micropipeta y resuspender el botón celular en 1 ml de LB. </li></ol></li><li> Diluir los cultivos de una noche de 2.75x10 5 UFC / ml en LB. NOTA: Supongamos que un OD 600 unidad es el equivalente de 1x10 9 UFC / ml para P. aeruginosa. OD / a conversiones ml CFU puede ser different en otras bacterias. </li><li> Añadir 50 l de cultivo bacteriano diluido al pocillo apropiado. NOTA: Los cultivos cultivados en NTBC deben añadirse a los pocillos que contienen NTBC y culturas crecido en DMSO deben añadirse a los pocillos que contienen DMSO. Ver Figura 1B. <ol><li> Añadir bacterias para tres pozos para cada cepa y la concentración de antibiótico. Añadir 50 l de LB a la cuarta bien para actuar como un control para la contaminación bacteriana. Ver Figura 1B. </li><li> Utilice una micropipeta multicanal para inocular los pozos. Asegúrese de que la pipeta consejos son cerca de la parte inferior de los pozos cuando se añade inóculo para evitar la contaminación de los pozos vecinos. NOTA: La adición de cultivo bacteriano a los pozos diluirá las concentraciones de antibióticos y NTBC doble. </li></ol></li><li> Cubrir las placas de 96 pocillos con parafilm y se incuba aproximadamente 24 horas a 37 ° C. Incubar las placas de 96 pocillos de forma estática, en una incubadora de aire. </li><li> Examinarlas placas para el crecimiento bacteriano en los pocillos. El MIC es la concentración más baja de antibiótico en el que no se observa crecimiento bacteriano para las tres repeticiones de cada cepa. <ol><li> Examine visualmente la placa para el crecimiento o leer mediante un conjunto lector de placas a OD 600. </li></ol></li></ol> Ensayo Placa 4. Punto de Estrés Oxidativo Respuesta <ol><li> Establecer cultivos de una noche de las cepas a ensayar en LB con y sin NTBC como se describe en el paso 3.1. </li><li> Al día siguiente, se preparan placas de agar LB que contenían H 2 O 2 como un factor de estrés oxidativo. Una gama de H 2 O 2 concentraciones de 0 a 1 mm es un buen punto de partida. <ol><li> Derretir los frascos de agar LB. Frescos medios a aproximadamente 50 ° C a la temperatura ambiente. </li><li> Añadir H 2 O 2 directamente a los medios de comunicación enfriados a las concentraciones deseadas. Frascos del remolino para mezclar. Ver Tabla 2 para las concentraciones de H 2 O 2y los volúmenes de H 2 O 2 concentrada para agregar. Estos valores se basan en 100 ml de LB agar. </li><li> Vierta platos inmediatamente después de la adición de H 2 O 2 y la llama de la superficie para eliminar las burbujas. El rendimiento es de 4 placas por cada 100 ml de agar LB. Marque las placas con la concentración de H 2 O 2. </li><li> Colocar las placas descubiertos en una campana de flujo biológica con el ventilador funcionando durante 30 min para eliminar el exceso de humedad de las placas. NOTA: Utilice las placas el mismo día que se preparan. El no hacerlo puede resultar en datos inconsistentes. NOTA: los factores de estrés oxidativo como el paraquat pueden ser sustituidos por H 2 O 2 en este ensayo. Las concentraciones utilizadas para otros factores de estrés oxidativo puede ser diferente de los utilizados para H 2 O 2. </li></ol></li><li> Lavar y medir el OD 600 de los cultivos de una noche como se describe en el paso 3.7. </li><li> Normalizar el OD 600 de todo el cu nocheltures al valor más bajo para el conjunto de cepas están probando. P. aeruginosa en general, tiene un OD 600 de aproximadamente 2,5 cuando se desarrolló durante la noche en LB + NTBC o LB + DMSO. <ol><li> Determinar el volumen de cultivo necesario para diluir la cultura al más bajo OD 600 en un volumen total de 1 ml. Por ejemplo, si una cultura tiene una DO 600 de 3 y el más bajo OD 600 para el conjunto de las cepas es 2.5, realice el siguiente cálculo: (2,5) (1 ml) = (3) (x). x = 0,833 ml. Se colocarán 0,833 ml de cultivo en un tubo de microcentrífuga. </li><li> Calcular la cantidad de LB + NTBC (300 mM) o LB + DMSO necesario para llevar el volumen a 1 ml de cultivo. Para el ejemplo en el paso 4.4.1, la cantidad de LB + NTBC o LB + DMSO añade al cultivo sería 0,167 ml (1 ml de volumen total de 0.833 ml - Cultura). Hacer que las soluciones stock de LB + NTBC y LB + DMSO a utilizar para estas diluciones basado en el volumen necesario para diluir todas las cepas. </li><li> Mezclar la cultura y LB + NTBC o LB + DMSO mediante agitación con vórtex. </li></ol></li><li> Para mantener los cultivos en una concentración constante de NTBC o DMSO, realizar diluciones en serie de diez veces de los cultivos de una noche normalizados en PBS + NTBC o PBS + DMSO. <ol><li> Haga soluciones madre de PBS + NTBC y PBS + DMSO. Para un conjunto de diluciones de una cepa, mezclar 300 mM NTBC o un volumen equivalente de DMSO con PBS para dar un volumen total de 720 l. Escala estas poblaciones hacia arriba o abajo dependiendo del número de cepas se ponen a prueba. </li><li> Tubos de microcentrífuga Etiqueta para 10 -1 a través de diluciones 10 -7 serie. Añadir 90 l de PBS + NTBC o PBS + DMSO a los tubos apropiados. Utilice PBS + NTBC para las cepas cultivadas en LB + NTBC y utilizar PBS + DMSO para las cepas cultivadas en LB + DMSO. </li><li> Añadir 10 l de la cultura al tubo de dilución 10 -1 apropiado. Mezclar mediante agitación y la transferencia de 10 l de la dilución 10 -1 al tubo de dilución 10 -2. Repita hasta que todas las diluciones han sido performó. Cambie puntas de pipeta entre las diluciones. </li></ol></li><li> Spot 5 l de la 10 -3 a través de 10 -7 diluciones en LB + H 2 O 2 placas por duplicado para cada cepa. Utilice una punta de pipeta si se colocan puntos de la mayoría diluir al menos diluido (10 -7 a 10 -3). No incline o inclinar la placa hasta que el líquido se haya secado en la placa. </li><li> Incubar las placas durante 24-48 horas a 37 ° C (incubadora de aire), dependiendo de la cepa. NOTA: P. aeruginosa PAO1 tendrá buenas colonias de tamaño en LB después de 24 h de incubación. Incubar las cepas hasta que tienen colonias de aproximadamente el mismo tamaño que PAO1. </li><li> Fotografiar las placas utilizando una cámara CCD por encima de un transiluminador. Opcionalmente, editar las fotos para el contraste y la cosecha al mismo tamaño. Contar el número de colonias en cada punto para determinar cambios en la sensibilidad al estrés oxidativo. </li></ol>

<ol><li>Rodriguez-Rojas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+hmgA++of+Pseudomonas+aeruginosa++to+pyomelanin+hyperproduction%2C+stress+resistance+and+increased+persistence+in+chronic+lung+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the hmgA of Pseudomonas aeruginosa to pyomelanin hyperproduction, stress resistance and increased persistence in chronic lung infection.</a> Microbiology. 155, 1050-1057 (2009).</li>
<li>Keith, K. E., Killip, L., He, P., Moran, G. R., Valvano, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burkholderia+cenocepacia++Produces+a+Pigment+with+Antioxidant+Properties+Using+a+Homogentisate+Intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Burkholderia cenocepacia Produces a Pigment with Antioxidant Properties Using a Homogentisate Intermediate.</a> J Bacteriol. 189, 9057-9065 (2007).</li>
<li>Schmaler-Ripcke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Pyomelanin%2C+a+Second+Type+of+Melanin%2C+via+the+Tyrosine+Degradation+Pathway+in+Aspergillus+fumigatus%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Production of Pyomelanin, a Second Type of Melanin, via the Tyrosine Degradation Pathway in Aspergillus fumigatus.</a> Appl Environ Microbiol. 75, 493-503 (2009).</li>
<li>Turick, C. E., Knox, A. S., Becnel, J. M., Ekechukwu, A. A., Milliken, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+and+Function+of+Pyomelanin%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers+In+Tech%22%5BJournal%5D)">Properties and Function of Pyomelanin.</a> Biopolymers In Tech. Elnashar, M. , 449-472 (2010).</li>
<li>Bridelli, M. G., Ciati, A., Crippa, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+chemicals+to+melanins+re-examined%3A+adsorption+of+some+drugs+to+the+surface+of+melanin+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Chem%22%5BJournal%5D)">Binding of chemicals to melanins re-examined: adsorption of some drugs to the surface of melanin particles.</a> Biophys Chem. 119, 137-145 (2006).</li>
<li>Barza, M., Baum, J., Kane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+antibiotic+activity+in+vitro+by+synthetic+melanin%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Inhibition of antibiotic activity in vitro by synthetic melanin.</a> Antimicrob Agents Chemother. 10, 569-570 (1976).</li>
<li>Nosanchuk, J. D., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Melanin+on+Microbial+Virulence+and+Clinical+Resistance+to+Antimicrobial+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Impact of Melanin on Microbial Virulence and Clinical Resistance to Antimicrobial Compounds.</a> Antimicrob Agents Chemother. 50, 3519-3528 (2006).</li>
<li>Arias-Barrau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Homogentisate+Pathway%3A+a+Central+Catabolic+Pathway+Involved+in+the+Degradation+of+L-Phenylalanine%2C+L-Tyrosine%2C+and+3-Hydroxyphenylacetate+in+Pseudomonas+putida%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Homogentisate Pathway: a Central Catabolic Pathway Involved in the Degradation of L-Phenylalanine, L-Tyrosine, and 3-Hydroxyphenylacetate in Pseudomonas putida.</a> J Bacteriol. 186, 5062-5077 (2004).</li>
<li>Ernst, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+mosaicism+is+conserved+but+not+unique+in+Pseudomonas+aeruginosa++from+the+airways+of+young+children+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genome mosaicism is conserved but not unique in Pseudomonas aeruginosa from the airways of young children with cystic fibrosis.</a> Environ Microbiol. 5, 1341-1349 (2003).</li>
<li>Sanchez-Amat, A., Ruzafa, C., Solano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+tyrosine+degradation+in+Vibrio+cholerae++The+strain+ATCC+14035+as+a+prokaryotic+melanogenic+model+of+homogentisate-releasing+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+B+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative tyrosine degradation in Vibrio cholerae The strain ATCC 14035 as a prokaryotic melanogenic model of homogentisate-releasing cell.</a> Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 119, 557-562 (1998).</li>
<li>Hunter, R. C., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Putative+ABC+Transporter%2C+HatABCDE%2C+Is+among+Molecular+Determinants+of+Pyomelanin+Production+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">A Putative ABC Transporter, HatABCDE, Is among Molecular Determinants of Pyomelanin Production in Pseudomonas aeruginosa.</a> J Bacteriol. 192, 5962-5971 (2010).</li>
<li>Ketelboeter, L. M., Potharla, V. Y., Bardy, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NTBC+treatment+of+the+pyomelanogenic+Pseudomonas+aeruginosa++isolate+PA1111+inhibits+pigment+production+and+increases+sensitivity+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Microbiol%22%5BJournal%5D)">NTBC treatment of the pyomelanogenic Pseudomonas aeruginosa isolate PA1111 inhibits pigment production and increases sensitivity to oxidative stress.</a> Curr Microbiol. 69, 343-348 (2014).</li>
<li>Kavana, M., Moran, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+%284-Hydroxyphenyl%29pyruvate+Dioxygenase+with+the+Specific+Inhibitor+2-%5B2-Nitro-4-%28trifluoromethyl%29benzoyl%5D-1%2C3-cyclohexanedione%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interaction of (4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase with the Specific Inhibitor 2-[2-Nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione.</a> Biochemistry. 42, 10238-10245 (2003).</li>
<li>Andrews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+minimum+inhibitory+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Determination of minimum inhibitory concentrations.</a> J Antimicrob Chemother. 48, 5-16 (2001).</li>
<li>Nikodinovic-Runic, J., Martin, L. B., Babu, R., Blau, W., O'Connor, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+melanin-overproducing+transposon+mutants+of+Pseudomonas+putida+F6%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Characterization of melanin-overproducing transposon mutants of Pseudomonas putida F6.</a> FEMS Microbiol Lett. 298, 174-183 (2009).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , 3 edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Roy-Burman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+III+protein+secretion+is+associated+with+death+in+lower+respiratory+and+systemic+Pseudomonas+aeruginosa+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Type III protein secretion is associated with death in lower respiratory and systemic Pseudomonas aeruginosa infections.</a> J Infect Dis. 183, 1767-1774 (2001).</li>
<li>Jacobs, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+transposon+mutant+library+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 14339-14344 (2003).</li>
<li>Youngchim, S., Pornsuwan, S., Nosanchuk, J. D., Dankai, W., Vanittanakom, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanogenesis+in+dermatophyte+species+in+vitro++during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Melanogenesis in dermatophyte species in vitro during infection.</a> Microbiology. 157, 2348-2356 (2011).</li>
<li>Khajo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+Melanized+Cryptococcus+neoformans+Lethal+Dose+Gamma+Irradiation+Involves+Changes+in+Melanin%27s+Chemical+Structure+and+Paramagnetism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Protection of Melanized Cryptococcus neoformans Lethal Dose Gamma Irradiation Involves Changes in Melanin's Chemical Structure and Paramagnetism.</a> PLoS ONE. 6, e25092(2011).</li>
<li>Hancock, R. E. W. Hancock Laboratory Methods. , University of British Columbia, Department of Microbiology and Immunology. British Columbia, Canada. Available from:
	 
 <a target="_blank" href="http://www.cmdr.ubc.ca/bobh/methods.htm">http://www.cmdr.ubc.ca/bobh/methods.htm</a> (2015).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El método de titulación de NTBC descrito en este protocolo permitirá al usuario determinar si NTBC puede reducir o eliminar la producción de piomelanina en bacterias y determinar la concentración de NTBC requerida. El paso más crítico en el ensayo de valoración de NTBC es determinar el rango de concentraciones de NTBC que se utilizarán en el ensayo. Diferentes cepas de P. aeruginosa tienen diferentes sensibilidades a NTBC, y las cepas de laboratorio pueden ser más sensibles a NTBC que los aislados clínicos1...

Pseudomonas aeruginosa es una bacteria Gram negativa que produce una variedad de pigmentos, incluida la piomelanina, un pigmento marrón rojizo que ayuda a proporcionar protección contra el estrés oxidativo1-4 y se une a una variedad de compuestos, incluidos los antibióticos aminoglucósidos5-7. La producción de piomelanina está causada por un defecto en la vía del catabolismo de la tirosina4,8, ya sea a través de deleciones o mutaciones del gen que codifica la homogentisa 1,2-dioxigenasa (HmgA)1,9 o a través de desequilibrios en las diversas enzimas de la vía10. El homogentizado se acumula debido a la inactivación de la HmgA, y se secreta y oxida para formar piomelanina11. La producción de piomelanina puede ser abolida o reducida de una manera dependiente de la dosis mediante el tratamiento con el herbicida 2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-ciclohexanediona (NTBC)12, que inhibe la 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (Hpd) en la vía del catabolismo de tirosina13. La Hpd es necesaria para la formación de homogentizado y, por lo tanto, de piomelanina11. 
Describimos en detalle tres técnicas que fueron importantes en nuestros estudios sobre el tratamiento con NTBC de las cepas productoras de piomelanina de P. aeruginosa. Estas técnicas incluyen la titulación de NTBC para determinar las concentraciones que suprimirán o reducirán la producción de piomelanina en las cepas productoras de piomelanina de laboratorio y clínicas, la determinación de la concentración inhibitoria mínima (MIC) de los antibióticos cuando las bacterias se tratan con NTBC y la sensibilidad resultante al estrés oxidativo con el tratamiento con NTBC.
El ensayo de valoración que desarrollamos tiene dos propósitos. En primer lugar, el ensayo permitirá al usuario determinar si el NTBC puede abolir o reducir la producción de piomelanina en la bacteria que se está estudiando y en qué concentraciones. Esto permitirá al usuario determinar la sensibilidad al NTBC, ya que diferentes cepas de bacterias pueden tener diferentes sensibilidades a este compuesto, como se observó en P. aeruginosa12. En segundo lugar, el ensayo de titulación de NTBC permitirá al usuario determinar la concentración adecuada de NTBC para usar en ensayos posteriores, como MIC de antibióticos y ensayos de respuesta al estrés oxidativo, si el objetivo es abolir o reducir la producción de piomelanina y determinar los efectos de la reducción de pigmentos. 
El ensayo de titulación funciona porque se puede observar una diferencia visible en la producción de piomelanina en las cepas tratadas con NTBC y las diferencias en la producción de piomelanina dependen de la dosis12. Además, esta técnica se puede aplicar al estudio de otros compuestos que pueden eliminar o mejorar la producción de pigmentos en las bacterias.
Las CMI de antibióticos se utilizan para determinar la sensibilidad de las bacterias a los antibióticos. Existen varios métodos para determinar los MIC, incluyendo las placas de dilución en agar y las diluciones en caldo14. Las diluciones de caldo se pueden realizar en pequeños tubos de ensayo o en una placa de microtitulación de 96 pocillos. El método de la placa de microtitulación para la determinación de la CMI descrito en este documento permitirá al usuario probar una amplia gama de antibióticos utilizando un mínimo de recursos. El ensayo proporciona reproducibilidad, así como flexibilidad en el número de antibióticos y cepas analizadas por este método. Además, con la incorporación de NTBC en el ensayo, el usuario puede determinar si la eliminación o reducción de la producción de piomelanina altera la sensibilidad a los antibióticos en las bacterias productoras de piomelanina.
La respuesta bacteriana al estrés oxidativo se puede probar de varias maneras. Los métodos más comunes descritos son los recuentos viables de bacterias sometidas a estrés oxidativo durante un período de tiempo1, o los ensayos de difusión en disco de estrés oxidativo15. Estos métodos tienden a utilizar altas concentraciones de estresores oxidativos para examinar los efectos del estrés oxidativo en las bacterias y los resultados pueden ser bastante variables entre las réplicas biológicas. El ensayo de conteo viable también tiende a usar más placas de agar que los otros métodos. El ensayo de placa puntual que describimos utiliza bajas concentraciones deH2O2 y permite al usuario probar la respuesta al estrés oxidativo de múltiples cepas utilizando un mínimo de placas. El ensayo también es consistentemente reproducible entre réplicas técnicas y biológicas. Dado que la piomelanina está implicada en la resistencia al estrés oxidativo, la incorporación de NTBC en el ensayo permite al usuario determinar los efectos de la eliminación de la producción de piomelanina sobre la resistencia al estrés oxidativo.

<table><tbody><tr><td>2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-ciclohexanediona (NTBC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0269-50mg</td><td>También llamado nitisinona.&nbsp; Soluble en DMSO.</td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763-100ML</td><td>30 % en peso en H2O.&nbsp; Estabilizado.</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Oro Bio</td><td>G-400-100</td><td>Soluble en H2O.&nbsp; Filtro esterilizante.</td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td>Soluble en H2O.&nbsp; Filtro esterilizante.</td></tr><tr><td>Tobramicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4014-100MG</td><td>Soluble en H2O.&nbsp; Filtro esterilizante.</td></tr></tbody></table>

métodos para inhibir bacteriana pyomelanin producción y determinar el correspondiente aumento en la sensibilidad al estrés oxidativo

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

La piomelanina es un pigmento extracelular de color marrón rojizo producido por varias especies bacterianas y fúngicas. Este pigmento se deriva de la vía del catabolismo de la tirosina y contribuye a aumentar la resistencia al estrés oxidativo. La producción de piomelanina en Pseudomonas aeruginosa se reduce de manera dependiente de la dosis mediante el tratamiento con 2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-ciclohexanediona (NTBC). Describimos un método de titulación que utiliza múltiples concentraciones de NTBC para determinar la concentración del fármaco que reducirá o suprimirá la producción de piomelanina en las bacterias. El método de valoración tiene un resultado fácilmente cuantificable, una reducción visible en la producción de pigmento con el aumento de las concentraciones de fármacos. También describimos un método de placa de microtitulación para analizar la concentración mínima inhibitoria (CMI) de antibióticos en bacterias. Este método utiliza un mínimo de recursos y puede ampliarse fácilmente para probar varios antibióticos en una placa de microtitulación para una cepa de bacterias. El ensayo MIC se puede adaptar para probar los efectos de los compuestos no antibióticos en el crecimiento bacteriano en concentraciones específicas. Finalmente, describimos un método para probar la sensibilidad bacteriana al estrés oxidativo mediante la incorporación de H2O2 en placas de agar y la detección de múltiples diluciones de bacterias en las placas. La sensibilidad al estrés oxidativo está indicada por las reducciones en el número y tamaño de las colonias para las diferentes diluciones en placas que contienenH2O2 en comparación con un control sinH2O2. El ensayo de placa puntual de estrés oxidativo utiliza un mínimo de recursos y bajas concentraciones deH2O2. Es importante destacar que también tiene una buena reproducibilidad. Este ensayo de placa puntual podría adaptarse para probar la sensibilidad bacteriana a varios compuestos mediante la incorporación de los compuestos en placas de agar y la caracterización del crecimiento bacteriano resultante.

Titulaciones NTBC Las titulaciones NTBC se utilizaron para determinar si NTBC fue capaz de reducir la producción de pyomelanin en P. aeruginosa, y también identificar la concentración de NTBC que elimina o reduce la producción pyomelanin para uso en ensayos adicionales. Es posible que haya variaciones en los niveles de pyomelanin producido en diferentes repeticiones, pero las tendencias generales permanecer constante. El ensayo de valoración NTBC también podría ser modifica...

La producción de piomelanina bacteriana resulta en una mayor resistencia al estrés oxidativo y a la virulencia. Informamos sobre las técnicas que se pueden utilizar para determinar la inhibición de la producción de piomelanina y analizar el aumento resultante en la sensibilidad al estrés oxidativo en las bacterias, así como determinar la concentración mínima inhibitoria (MIC) del antibiótico.

Métodos para inhibir bacteriana Pyomelanin Producción y determinar el correspondiente aumento en la sensibilidad al estrés oxidativo

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Los objetivos generales de los siguientes experimentos son determinar los efectos del NTBC sobre la producción de p melanina y la sensibilidad al estrés oxidativo, así como las concentraciones mínimas inhibitorias de antibióticos o CIM. Esto se logra añadiendo NTBC a cultivos bacterianos para determinar la concentración que reduce la producción de p melanina como segundo paso. Los cultivos bacterianos se tratan con NTBC y antibióticos, lo que permitirá al usuario determinar si el tratamiento con NTBC tiene un efecto sobre las CIM de los antibióticos.Los cultivos tratados con NTPC se exponen a peróxido de hidrógeno con el fin de determinar la sensibilidad al estrés oxidativo. Los resultados obtenidos muestran que el tratamiento de bacterias génicas con NTPC conduce a una reducción en la producción de pigmento y un aumento en la sensibilidad al estrés oxidativo, sin tener efecto sobre los MIC de antibióticos basados en la respuesta al estrés oxidativo, según las placas de puntos y los ensayos de MIC en microplacas, respectivamente. La principal ventaja de la técnica de placas de puntos para estrés oxidativo frente a métodos existentes como los recuentos de viabilidad y los ensayos de

methods-to-inhibit-bacterial-pyomelanin-production-determine

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra un ensayo de placa puntual diseñado para evaluar las respuestas al estrés oxidativo de las cepas bacterianas. Algunas cepas producen piomelanina, un pigmento antioxidante. Por el contrario, las cepas tratadas con un agente de prueba, que conducen a una reducción de la producción de piomelanina, exhiben una mayor susceptibilidad al estrés oxidativo, lo que resulta en una disminución de la viabilidad celular en comparación con las cepas productoras de piomelanina.

Un ensayo de placa puntual para evaluar las respuestas al estrés oxidativo en cepas bacterianas

Este video muestra un método basado en placas de microtitulación para determinar la Concentración Inhibitoria Mínima (MIC) de antibióticos de prueba contra bacterias. Al añadir una suspensión del patógeno bacteriano Pseudomonas aeruginosa a una placa de microtitulación que contiene diluciones en serie de un antibiótico de prueba y un inhibidor de la producción de piomelanina por parte de las bacterias, se mide la densidad óptica de los pocillos para calcular la concentración inhibitoria mínima...

Un método de microtitulación en placa para evaluar la concentración mínima inhibitoria de un antibiótico

Este manuscrito describe el uso de reporteros fluorógenos genéticamente codificados en una aplicación de imágenes de células vivas para el examen de estrés oxidativo inducido por xenobióticos. Este enfoque experimental ofrece inigualable resolución espaciotemporal, la sensibilidad y especificidad evitando muchas de las deficiencias de los métodos convencionales usados para la detección de estrés oxidativo toxicológica.

Enfoques de evaluación de estrés oxidativo toxicológico mediante sensores codificados genéticamente fluorógenos la proyección de imagen

El objetivo de este protocolo es espectrofotometría monitor plasma trans membrana transporte de electrones utilizando aceptadores del electrón extracelular y analizar las interacciones enzimáticas que pueden ocurrir con estos aceptadores del electrón extracelular.

Medición de transporte de electrones membrana Trans-Plasma por C2C12 miotubos

Se describen tres métodos experimentales para la evaluación de la actividad de hipopigmentación de químicos in vitro: cuantificación del contenido 2) melanina y actividad tirosinasa 1) celular y 3) medición de la melanina por análisis de imagen y coloración celular melanina.

Cuantificación de hipopigmentación de la actividad In Vitro

El objetivo de este protocolo es inducir la producción transitoria in vivo de niveles no letales de especies reactivas de oxígeno (ROS) en la piel del ratón, promoviendo aún más las respuestas fisiológicas en el tejido.

Estimulación de nichos de células madre y regeneración de tejidos en piel de ratón mediante fotogeneración in situ dependiente de protoporfirina IX conmutable de especies reactivas de oxígeno

Presentamos un protocolo para el desarrollo y uso de un modelo de estrés oxidativo mediante el tratamiento de células epiteliales pigmentarias de la retina con H2O2,analizando la morfología celular, la viabilidad, la densidad, el glutatión y el nivel de UCP-2. Es un modelo útil para investigar el efecto antioxidante de las proteínas secretadas por las células transfectadas por transposones para tratar la degeneración neurorretiniana.

Inducción y análisis del estrés oxidativo en células epiteliales pigmentarias de la retina humana transfectadas por transposones de la bella durmiente

Aquí, presentamos un protocolo para inactivar bacterias patógenas con especies reactivas de oxígeno producidas durante la fotólisis del mononucleótido de flavina (FMN) bajo irradiación de luz azul y violeta de baja intensidad. Se ha demostrado que la fotólisis FMN es un método simple y seguro para procesos sanitarios.

Inactivación de patógenos mediante fotólisis con luz visible de riboflavina-5′-fosfato

Un protocolo estandarizado para inducir la senescencia prematura en HNM utilizando tBHP, protocolos estandarizados para analizar marcadores clave de senescencia, incluyendo la detención del crecimiento, la actividad SA-β-galactosidasa y los factores SASP.

Un protocolo estandarizado para inducir la senescencia prematura inducida por estrés en melanocitos humanos primarios utilizando hidroperóxido de tert-butil

Durante el proceso de infección, un paso clave es la adhesión de los patógenos con las células huésped. En la mayoría de los casos este paso la adhesión se produce en presencia de la tensión mecánica generada por el flujo de líquidos. Se describe una técnica que presenta el esfuerzo cortante como un parámetro importante en el estudio de la adhesión bacteriana.

La introducción de la tensión de cizallamiento en el Estudio de la adhesión bacteriana

Aprende a inhibir la producción de piomelanina bacteriana con NTBC y evalúa el aumento de sensibilidad al estrés oxidativo mediante ensayos de placas con peróxido de hidrógeno.

Métodos para inhibir bacteriana Pyomelanin Producción y determinar el correspondiente aumento en la sensibilidad al estrés oxidativo (Video) | JoVE Journal

Métodos para inhibir bacteriana Pyomelanin Producción y determinar el correspondiente aumento en la sensibilidad al estrés oxidativo

Explorar más videos