Métodos para inhibir bacteriana Pyomelanin Producción y determinar el correspondiente aumento en la sensibilidad al estrés oxidativo

Los objetivos generales de los siguientes experimentos son determinar los efectos del NTBC sobre la producción de p melanina y la sensibilidad al estrés oxidativo, así como las concentraciones mínimas inhibitorias de antibióticos o CIM. Esto se logra añadiendo NTBC a cultivos bacterianos para determinar la concentración que reduce la producción de p melanina como segundo paso. Los cultivos bacterianos se tratan con NTBC y antibióticos, lo que permitirá al usuario determinar si el tratamiento con NTBC tiene un efecto sobre las CIM de los antibióticos.

Los cultivos tratados con NTPC se exponen a peróxido de hidrógeno con el fin de determinar la sensibilidad al estrés oxidativo. Los resultados obtenidos muestran que el tratamiento de bacterias génicas con NTPC conduce a una reducción en la producción de pigmento y un aumento en la sensibilidad al estrés oxidativo, sin tener efecto sobre los MIC de antibióticos basados en la respuesta al estrés oxidativo, según las placas de puntos y los ensayos de MIC en microplacas, respectivamente. La principal ventaja de la técnica de placas de puntos para estrés oxidativo frente a métodos existentes como los recuentos de viabilidad y los ensayos de difusión en disco es que se pueden utilizar concentraciones más bajas de peróxido de hidrógeno, en lugar de las altas concentraciones empleadas en otros ensayos. Por lo general, las personas nuevas en nuestro método para determinar los MIC de antibióticos tendrán dificultades porque la falta de precisión en la técnica de pipeteo introduce variabilidad entre réplicas.

Esta variabilidad puede dificultar la determinación precisa del antibiótico. MIC Un día antes del ensayo de MIC. Prepare cultivos de las cepas que se van a probar en LB con y sin.

Dos nitro, cuatro trior etil bencenoil uno tres Ciclohexano Diona, o NTBC. Esta demostración utiliza el nivel representativo de 300 micromolar de NTBC. El método de titulación para determinar la concentración adecuada de NTBC se describe en el texto del protocolo: incubar las culturas durante la noche a 37 grados Celsius con aeración al día siguiente.

Prepare soluciones maestras de LB con NTBC y LB con DMSO para el ensayo de MIC para probar un antibiótico en una cepa a 600 micromoles de NTBC por dos mililitros de LB y mezcle. Para preparar la solución maestra de NTBC. Se añade NTBC a una concentración de 600 micromoles porque se diluirá dos veces cuando se agregue el inóculo.

Para obtener una concentración final de 300 micromolares, añada un volumen equivalente del vehículo DMSO a dos mililitros de LB y mezcle para preparar la solución madre de NO NTBC. Estas dos soluciones madres se utilizarán para crear soluciones stock de antibióticos, así como para preparar la serie de diluciones en placas de 96 pocillos. A continuación, prepare las soluciones de antibiótico en las soluciones madres de LB más NTBC o LB más DMSO.

Prepare la solución stock de gentamicina más o menos NTBC a 64 microgramos por mililitro. Elabore la solución stock de kanamicina más o menos NTBC a 256 microgramos por mililitro. Prepare la solución stock de tobramicina más o menos NTB a ocho microgramos por mililitro.

Después de preparar las dos soluciones de antibióticos, añada 100 microlitros de cada solución de antibiótico a cuatro pocillos en una placa de 96 pocillos en la fila A. Por ejemplo, la gentamicina debe colocarse en los pocillos A1 a A4, la kanamicina en los pocillos A5 a A8, y la tobramicina en los pocillos A9 a A12. Añada 50 microlitros de la solución maestra de LB más NTBC o LB más DMSO a las filas B a H de la placa de 96 pocillos, asegurándose de que una placa contenga LB más NTBC y la otra contenga LB más DMSO. Utilizando un micropipeteador, realice diluciones seriadas por duplicación de los antibióticos transfiriendo 50 microlitros de la solución desde la fila A a la fila B. Mezcle la solución, cambie las puntas del pipeteador y transfiera 50 microlitros de la solución desde la fila B a la fila C. Repita este procedimiento para las filas restantes hasta diluir la fila G. Retire 50 microlitros de la solución de esa fila y deseche.

Utilice la fila H como control sin antibiótico para el crecimiento bacteriano. Recupere los cultivos nocturnos después de lavar todos los cultivos para eliminar la laninina presente en el medio, mida la DO 600 de los cultivos y diluya los cultivos nocturnos en LB utilizando un micropipeteador multicanal.

Añada 50 microlitros de la cultivo bacteriano diluido a los pozos adecuados. Añada bacterias a tres pozos para cada cepa y concentración de antibiótico. Añada 50 microlitros de LB al cuarto pozo para que sirva como control de contaminación bacteriana.

Cubra las placas de 96 pocillos con perfil e incube aproximadamente 24 horas a 37 grados Celsius al día siguiente. Examine visualmente las placas en busca de crecimiento bacteriano en los pocillos. La CMI es la concentración más baja de antibiótico en la que no se observa crecimiento bacteriano en las tres réplicas de cada cepa.

Para comenzar este procedimiento, prepare cultivos nocturnos de las cepas que se van a probar en LB con y sin NTBC, como se mostró anteriormente, el día siguiente. Prepare APL de LB conteniendo peróxido de hidrógeno como agente de estrés oxidativo. Primero derrita los frascos de agar LB y enfríe el medio a aproximadamente 50 grados Celsius a temperatura ambiente.

A continuación, agregue peróxido de hidrógeno directamente al medio enfriado en las concentraciones deseadas. Agite el matraz para mezclar una gama de concentraciones de peróxido de hidrógeno desde cero hasta uno. Milimolar es un buen punto de partida.

Vierta inmediatamente las placas y flamee la superficie para eliminar las burbujas. El rendimiento es de cuatro placas por cada 100 mililitros de agar LB. Marque las placas con la concentración de peróxido de hidrógeno.

Coloque las placas descubiertas en una cabina de flujo biológico con el ventilador encendido durante 30 minutos para eliminar la humedad excesiva de las placas. Las placas deben usarse el mismo día. Se preparan mientras las placas se secan, lave y mida.

El OD 600 de los cultivos nocturnos normaliza el OD 600 de todos los cultivos nocturnos al valor más bajo del conjunto de cepas que se están probando. Para hacer esto, determine el volumen de cultivo necesario para diluir el cultivo hasta el OD 600 más bajo en un volumen total de un mililitro. Por ejemplo, si un cultivo tiene un OD 600 de tres y el OD 600 más bajo del conjunto de cepas es 2,5, realice el siguiente cálculo, lo que dará como resultado 0,833 mililitros como el volumen de cultivo necesario; coloque 0,833 mililitros de cultivo en un tubo microfuga.

A continuación, calcule la cantidad de LB más NTBC o LB más DMSO necesaria para llevar el volumen del cultivo a un mililitro. En este ejemplo, la cantidad sería de 0,167 mililitros; mezcle mediante vortex para mantener los cultivos en una concentración constante de NTBC o DMSO. Realice diluciones seriadas de diez veces de los cultivos normalizados de la noche anterior en PBS más NTBC o PBS más DMSO. Prepare soluciones stock de PBS más NTBC y PBS más DMSO, ampliando o reduciendo la escala según la cantidad de cepas que se prueben. Para un conjunto de diluciones de una cepa, agregue 300 micromolar de NTBC o un volumen equivalente de DMSO a PBS teal, hasta un volumen total de 720 microlitros. Añada 90 microlitros de PBS más NTBC o PBS más DMSO a los tubos microcentrífugos correspondientes etiquetados para las diluciones seriadas de 10 a la menos uno hasta 10 a la menos siete.

Añada 10 microlitros de cultivo al tubo de dilución adecuado de 10 a la menos uno, mezcle mediante vortex y transfiera 10 microlitros de la dilución 10 a la menos uno al tubo de dilución 10 a la menos dos. Cambiando las puntas de pipeta entre cada dilución, repita hasta que se hayan realizado todas las diluciones. Inocule por duplicado cinco microlitros de las diluciones desde 10 a la menos tres hasta 10 a la menos siete sobre placas de LV más peróxido de hidrógeno.

Para cada cepa, utilice una punta de pipeta diferente. Si se siembran puntos desde la dilución más baja hasta la más alta, no incline ni gire la placa hasta que el líquido se haya secado completamente sobre la placa. Incube las placas a 37 grados Celsius durante 24 a 48 horas, según la cepa.

Una vez que hayan aparecido colonias de buen tamaño, fotografíe las placas utilizando una cámara CCD colocada sobre un transiluminador. Se realizaron titulaciones con NTBC para determinar si este compuesto era capaz de reducir la producción de melanina p en p aerogen y para identificar la concentración de NTBC que elimina o reduce la producción de melanina p, con el fin de utilizarla en ensayos adicionales como se muestra aquí. El NTBC redujo la producción de melanina PY de manera dependiente de la dosis en productores de melanina p, pero no tuvo ningún efecto sobre la producción de pigmento en cepas que no producen melanina p.

Esta tabla muestra los resultados del ensayo de CMI para diferentes cepas de p aerogen tratadas con y sin NTBC y varios antibióticos. Las CMI se registraron como la concentración más baja del antibiótico que inhibió el crecimiento bacteriano. El tratamiento con NDBC no tuvo efecto sobre las CMI de los antibióticos para las cepas analizadas. Se realizó un ensayo en placa de puntos para evaluar la respuesta al estrés oxidativo en cepas productoras y no productoras de melanina de PIO tratadas con y sin NDBC.

La placa con cero milimolar de peróxido de hidrógeno mostró que todas las cepas se diluyeron adecuadamente y se observó un aumento en la sensibilidad al estrés oxidativo cuando las bacterias productoras de melanina PIO fueron tratadas con NTBC; las cepas que no producen melanina PIO fueron más sensibles al estrés oxidativo que las cepas que producen melanina p. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo determinar los efectos del tratamiento con NTBC sobre la producción de melanina PIO mediante la evaluación de la sensibilidad al estrés oxidativo y las CMI de antibióticos.