Name: Métodos para inhibir bacteriana Pyomelanin Producción y determinar el correspondiente aumento en la sensibilidad al estrés oxidativo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Aprende a inhibir la producción de piomelanina bacteriana con NTBC y evalúa el aumento de sensibilidad al estrés oxidativo mediante ensayos de placas con peróxido de hidrógeno.

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Los autores agradecen a Dara Frank y Carrie Harwood por su generosa contribución de cepas. La Fundación de Investigación de Milwaukee de la Universidad de Wisconsin posee la patente n.º 8.354.451; con afirmaciones ampliamente dirigidas a tratar o inhibir la progresión de la infección de un microorganismo en un paciente mediante la administración de un compuesto inhibidor de la 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenasa como la 2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-ciclohexanediona (NTBC). Los inventores son Graham Moran y Pang He. Esta investigación fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud (R00-GM083147). La biblioteca de transposones mutantes P. aeruginosa de la Universidad de Washington cuenta con el apoyo de la DK089507 P30 de los NIH.

1. Preparación de medios de cultivo, antibióticos, y 2- [2-nitro-4- (trifluorometil) benzoil] -1,3-ciclohexanodiona (NTBC) <ol><li> Hacer caldo LB (1% triptona, extracto de levadura 0,5%, 0,25% de NaCl en H 2 O) y alícuota en volúmenes apropiados. Esterilizar en autoclave. Almacenar a temperatura ambiente. </li><li> Hacer 100 ml de LB agar (1% triptona, extracto de levadura 0,5%, 0,25% de NaCl, 1,5% de agar en H 2 O) en matraces de 250 ml. Esterilizar en autoclave y almacenar a temperatura ambiente. Asegúrese de que el agar se derrita antes de verter en placas. NOTA: Los frascos que contienen 100 ml de agar LB producirá 4 platos. La cantidad de agar LB puede ser alterado para que se corresponda con el número de placas necesarias para el ensayo. </li><li> Hacer PBS (NaCl 137 mM, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4) 16. Esterilizar en autoclave o filtración y se almacena a temperatura ambiente. </li><li> Preparar las soluciones madre de antibióticos para la gentamicina, kanamicina, und tobramicina. <ol><li> Preparar las concentraciones de valores antibióticos apropiados para P. aeruginosa cepas que contienen 100 mg / ml de gentamicina, 30 mg / ml de kanamicina, y 10 mg / ml de tobramicina. Disolver los antibióticos en el agua, esterilizar filtro (0,2 micras), y se almacena a 4 ° C. Alterar los antibióticos y concentraciones dependiendo de la bacteria estudiada. </li></ol></li><li> Preparar las soluciones madre NTBC. Disolver 10 mg de NTBC en 400 l de DMSO. Esto produce una concentración de 75,9 mM NTBC. Tienda soluciones NTBC acciones a -20 ° C. Soluciones Descongelar a temperatura ambiente, según sea necesario. NOTA: Diferentes fuentes de NTBC tienen diferencias en la solubilidad. Determinar el vehículo apropiado en el que se disuelva el NTBC basado en las recomendaciones del fabricante y ajuste Paso 1.5 en consecuencia. </li></ol> 2. NTBC titulaciones de Cepas bacterianas <ol><li> Establecer cultivos de una noche de las cepas a ensayar. Añadir 2 ml de LB tubo de ensayo de caldo de 16 x 150 mms (uno por cepa) y inoculan con 1 aislada colonia de cada cepa. Incubar durante la noche a 37 ° C con aireación en un rotador de cultivo de tejidos en una incubadora de aire. </li><li> El día siguiente, se preparan titulaciones de NTBC en caldo LB. Utilice un rango inicial de 0 a 900 mM NTBC desde diferentes cepas tienen diferencias en la sensibilidad a la NTBC. <ol><li> Añadir 1 ml de caldo LB a 4 a 5 tubos de ensayo (16 x 150 mm) por cepa. </li><li> Añadir la solución madre NTBC (75,9 mM) a los tubos de ensayo (16 x 150 mm) en un intervalo de concentraciones. Ver Tabla 1 para las concentraciones NTBC y volúmenes de valores correspondientes a añadir a 1 ml de caldo LB. </li></ol></li><li> Mida la OD 600 de los cultivos de una noche. Lávese las culturas antes de tomar OD 600 lecturas para eliminar pyomelanin presente en los medios de comunicación. <ol><li> Lávese las culturas mediante la centrifugación de 1 ml de la cultura en una microcentrífuga a 16.000 xg durante 2 min. Eliminar el sobrenadante y las células sedimentadas vagamente conuna micropipeta y resuspender el sedimento celular sólida en 1 ml de LB. </li></ol></li><li> Inocular los tubos de titulación a una DO 600 0,05. Calcular la cantidad de cultivo se lavó necesaria para inocular los tubos. NOTA: Utilice las culturas lavadas para inoculaciones desde pyomelanin no debe estar presente. </li><li> Incubar los tubos de titulación durante aproximadamente 24 horas a 37 ° C con aireación usando un cultivo de tejido de los rotadores en una incubadora de aire. </li><li> Fotografiar los tubos de valoración y comparación de la producción de pigmento dentro y entre las cepas para determinar la cantidad de NTBC utilizar para los ensayos de MIC y el estrés oxidativo. Utilice OD 600 lecturas para determinar la cantidad de pyomelanin en la celda sobrenadante del cultivo libre y para determinar la densidad celular. NOTA: La relación de OD 600 de pyomelanin en el sobrenadante del cultivo de células se puede calcular para cuantificar las diferencias en la producción pyomelanin después del tratamiento con NTBC. </li></ol> 3. antibióticos inhibi mínimoConcentración (MIC) Ensayo tory en placas de 96 pocillos <ol><li> Establecer cultivos de una noche de las cepas a ensayar en LB con y sin NTBC. NOTA: Este protocolo se describe utilizando el nivel representativo de 300 M NTBC. El nivel apropiado de NTBC para ser utilizado se determina en el paso 2.6. <ol><li> Añadir 300 mM NTBC a 2 ml LB. Añadir un volumen equivalente de vehículo (DMSO) a 2 ml de LB para la condición no NTBC. </li><li> El uso de palillos de dientes estériles, inocular tubos con una colonia aislada de bacterias. Habrá una cultura con NTBC y una cultura sin NTBC para cada cepa. Incubar durante la noche a 37 ° C con aireación usando un cultivo de tejido de los rotadores en una incubadora de aire. </li></ol></li><li> Al día siguiente, hacer que las soluciones magistrales LB + DMSO LB + NTBC y para configurar el ensayo MIC. Añadir NTBC a una concentración de 600 mM como este se diluirá doble cuando se añade inóculo, produciendo una concentración final de 300 mM. <ol><li> Para probar un solo antibiótica de una cepa, añadir 600 M NTBC a 2 ml de LB y mezclar para que la solución principal NTBC. Añadir un volumen equivalente de vehículo (DMSO) a 2 ml de LB y se mezcla para hacer la solución ningún maestro NTBC. Utilice estas soluciones para crear soluciones madre de antibióticos, así como para la creación de la serie de dilución en placas de 96 pocillos. NOTA: Las formulaciones de solución maestros darán solución adicional para tener en cuenta los errores de pipeteo. Las soluciones magistrales se pueden escalar hacia arriba o hacia abajo según sea necesario en función de la cantidad de antibióticos y cepas probadas. </li></ol></li><li> Preparar las soluciones de antibióticos en las soluciones magistrales LB + NTBC o LB + DMSO. NOTA: La concentración de antibiótico en estas soluciones debería ser el doble de la concentración final deseada. Suficiente solución se debe hacer para transferir 100 l de cuatro pozos en una placa de 96 pocillos. <ol><li> Preparar gentamicina +/- NTBC solución madre a los 64 mg / ml. Para hacer esta solución, añadir 0,288 l de Stock gentamicina (100 mg / ml) para 450l LB + NTBC o solución maestro LB + DMSO. NOTA: La concentración máxima de gentamicina para P. aeruginosa PAO1 es 32 mg / ml. </li><li> Haga la kanamicina +/- NTBC solución madre a 256 g / ml. Para que esta solución, añadir 3,84 l de kanamicina social (30 mg / ml) a 450 mu l LB + NTBC o LB + DMSO soluciones magistrales. NOTA: La concentración máxima de kanamicina para P. aeruginosa PAO1 es 128 g / ml. </li><li> Preparar tobramicina +/- NTBC solución madre a 8 mg / ml. Para que esta solución, añadir 0,36 l de tobramicina social (10 mg / ml) a 450 mu l LB + NTBC o LB + DMSO soluciones magistrales. NOTA: Para P. aeruginosa PAO1, la concentración máxima de tobramicina es 4 mg / ml. NOTA: Los antibióticos y concentraciones se pueden ajustar para las bacterias a ensayar. </li></ol></li><li> Añadir 100 l de cada solución de antibiótico 2x para cuatro pozos en una placa de 96 pocillos. Coloque estas soluciones en la fila A. Para example, gentamicina debe ser colocado en A1 a A4, kanamicina debe ser colocado en A5 a A8, y tobramicina debe ser colocado en A9 a través de A12. Ver Figura 1A para un diagrama de una placa de 96 pocillos de configurar. NOTA: Múltiples antibióticos pueden ser probados en un plato, pero sólo una cepa debe ser probado por placa para eliminar el potencial de contaminación cruzada de otras cepas. </li><li> Añadir 50 l de la solución maestro LB + NTBC o LB + DMSO a las filas B a H de la placa de 96 pocillos. Asegúrese de que un plato es LB + NTBC y una placa es LB + DMSO. Ver Figura 1A. <ol><li> Utilice LB + NTBC para los antibióticos en LB + NTBC. Utilice LB + DMSO para los antibióticos en LB + DMSO. </li></ol></li><li> Usando una micropipeta realizar dos diluciones seriadas dobles de los antibióticos mediante la transferencia de 50 l de la solución de la fila A a la fila B. Mezcle la solución, cambiar las puntas de pipeta y transferir 50 l de la solución de la línea B de la fila C. Repita el procedimiento para el remainifilas NG. Después de diluir la fila G, retirar 50 l de la solución de esa fila y descarte. Utilice la fila H como un control de antibióticos para el crecimiento bacteriano. Ver Figura 1B. NOTA: Cada Un pozo en filas a G ahora contiene 50 l de antibióticos en LB + NTBC o LB + DMSO a 2X la concentración final deseada. Fila H contiene LB + NTBC o LB + DMSO sin antibióticos. </li><li> Mida la OD 600 de los cultivos de una noche. Lave todas las culturas antes de tomar OD 600 lecturas para eliminar pyomelanin presente en los medios de comunicación. <ol><li> Lávese las culturas mediante la centrifugación de 1 ml de la cultura en una microcentrífuga a 16.000 xg durante 2 min. Eliminar el sobrenadante con una micropipeta y resuspender el botón celular en 1 ml de LB. </li></ol></li><li> Diluir los cultivos de una noche de 2.75x10 5 UFC / ml en LB. NOTA: Supongamos que un OD 600 unidad es el equivalente de 1x10 9 UFC / ml para P. aeruginosa. OD / a conversiones ml CFU puede ser different en otras bacterias. </li><li> Añadir 50 l de cultivo bacteriano diluido al pocillo apropiado. NOTA: Los cultivos cultivados en NTBC deben añadirse a los pocillos que contienen NTBC y culturas crecido en DMSO deben añadirse a los pocillos que contienen DMSO. Ver Figura 1B. <ol><li> Añadir bacterias para tres pozos para cada cepa y la concentración de antibiótico. Añadir 50 l de LB a la cuarta bien para actuar como un control para la contaminación bacteriana. Ver Figura 1B. </li><li> Utilice una micropipeta multicanal para inocular los pozos. Asegúrese de que la pipeta consejos son cerca de la parte inferior de los pozos cuando se añade inóculo para evitar la contaminación de los pozos vecinos. NOTA: La adición de cultivo bacteriano a los pozos diluirá las concentraciones de antibióticos y NTBC doble. </li></ol></li><li> Cubrir las placas de 96 pocillos con parafilm y se incuba aproximadamente 24 horas a 37 ° C. Incubar las placas de 96 pocillos de forma estática, en una incubadora de aire. </li><li> Examinarlas placas para el crecimiento bacteriano en los pocillos. El MIC es la concentración más baja de antibiótico en el que no se observa crecimiento bacteriano para las tres repeticiones de cada cepa. <ol><li> Examine visualmente la placa para el crecimiento o leer mediante un conjunto lector de placas a OD 600. </li></ol></li></ol> Ensayo Placa 4. Punto de Estrés Oxidativo Respuesta <ol><li> Establecer cultivos de una noche de las cepas a ensayar en LB con y sin NTBC como se describe en el paso 3.1. </li><li> Al día siguiente, se preparan placas de agar LB que contenían H 2 O 2 como un factor de estrés oxidativo. Una gama de H 2 O 2 concentraciones de 0 a 1 mm es un buen punto de partida. <ol><li> Derretir los frascos de agar LB. Frescos medios a aproximadamente 50 ° C a la temperatura ambiente. </li><li> Añadir H 2 O 2 directamente a los medios de comunicación enfriados a las concentraciones deseadas. Frascos del remolino para mezclar. Ver Tabla 2 para las concentraciones de H 2 O 2y los volúmenes de H 2 O 2 concentrada para agregar. Estos valores se basan en 100 ml de LB agar. </li><li> Vierta platos inmediatamente después de la adición de H 2 O 2 y la llama de la superficie para eliminar las burbujas. El rendimiento es de 4 placas por cada 100 ml de agar LB. Marque las placas con la concentración de H 2 O 2. </li><li> Colocar las placas descubiertos en una campana de flujo biológica con el ventilador funcionando durante 30 min para eliminar el exceso de humedad de las placas. NOTA: Utilice las placas el mismo día que se preparan. El no hacerlo puede resultar en datos inconsistentes. NOTA: los factores de estrés oxidativo como el paraquat pueden ser sustituidos por H 2 O 2 en este ensayo. Las concentraciones utilizadas para otros factores de estrés oxidativo puede ser diferente de los utilizados para H 2 O 2. </li></ol></li><li> Lavar y medir el OD 600 de los cultivos de una noche como se describe en el paso 3.7. </li><li> Normalizar el OD 600 de todo el cu nocheltures al valor más bajo para el conjunto de cepas están probando. P. aeruginosa en general, tiene un OD 600 de aproximadamente 2,5 cuando se desarrolló durante la noche en LB + NTBC o LB + DMSO. <ol><li> Determinar el volumen de cultivo necesario para diluir la cultura al más bajo OD 600 en un volumen total de 1 ml. Por ejemplo, si una cultura tiene una DO 600 de 3 y el más bajo OD 600 para el conjunto de las cepas es 2.5, realice el siguiente cálculo: (2,5) (1 ml) = (3) (x). x = 0,833 ml. Se colocarán 0,833 ml de cultivo en un tubo de microcentrífuga. </li><li> Calcular la cantidad de LB + NTBC (300 mM) o LB + DMSO necesario para llevar el volumen a 1 ml de cultivo. Para el ejemplo en el paso 4.4.1, la cantidad de LB + NTBC o LB + DMSO añade al cultivo sería 0,167 ml (1 ml de volumen total de 0.833 ml - Cultura). Hacer que las soluciones stock de LB + NTBC y LB + DMSO a utilizar para estas diluciones basado en el volumen necesario para diluir todas las cepas. </li><li> Mezclar la cultura y LB + NTBC o LB + DMSO mediante agitación con vórtex. </li></ol></li><li> Para mantener los cultivos en una concentración constante de NTBC o DMSO, realizar diluciones en serie de diez veces de los cultivos de una noche normalizados en PBS + NTBC o PBS + DMSO. <ol><li> Haga soluciones madre de PBS + NTBC y PBS + DMSO. Para un conjunto de diluciones de una cepa, mezclar 300 mM NTBC o un volumen equivalente de DMSO con PBS para dar un volumen total de 720 l. Escala estas poblaciones hacia arriba o abajo dependiendo del número de cepas se ponen a prueba. </li><li> Tubos de microcentrífuga Etiqueta para 10 -1 a través de diluciones 10 -7 serie. Añadir 90 l de PBS + NTBC o PBS + DMSO a los tubos apropiados. Utilice PBS + NTBC para las cepas cultivadas en LB + NTBC y utilizar PBS + DMSO para las cepas cultivadas en LB + DMSO. </li><li> Añadir 10 l de la cultura al tubo de dilución 10 -1 apropiado. Mezclar mediante agitación y la transferencia de 10 l de la dilución 10 -1 al tubo de dilución 10 -2. Repita hasta que todas las diluciones han sido performó. Cambie puntas de pipeta entre las diluciones. </li></ol></li><li> Spot 5 l de la 10 -3 a través de 10 -7 diluciones en LB + H 2 O 2 placas por duplicado para cada cepa. Utilice una punta de pipeta si se colocan puntos de la mayoría diluir al menos diluido (10 -7 a 10 -3). No incline o inclinar la placa hasta que el líquido se haya secado en la placa. </li><li> Incubar las placas durante 24-48 horas a 37 ° C (incubadora de aire), dependiendo de la cepa. NOTA: P. aeruginosa PAO1 tendrá buenas colonias de tamaño en LB después de 24 h de incubación. Incubar las cepas hasta que tienen colonias de aproximadamente el mismo tamaño que PAO1. </li><li> Fotografiar las placas utilizando una cámara CCD por encima de un transiluminador. Opcionalmente, editar las fotos para el contraste y la cosecha al mismo tamaño. Contar el número de colonias en cada punto para determinar cambios en la sensibilidad al estrés oxidativo. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El método de titulación de NTBC descrito en este protocolo permitirá al usuario determinar si NTBC puede reducir o eliminar la producción de piomelanina en bacterias y determinar la concentración de NTBC requerida. El paso más crítico en el ensayo de valoración de NTBC es determinar el rango de concentraciones de NTBC que se utilizarán en el ensayo. Diferentes cepas de P. aeruginosa tienen diferentes sensibilidades a NTBC, y las cepas de laboratorio pueden ser más sensibles a NTBC que los aislados clínicos1...

Pseudomonas aeruginosa es una bacteria Gram negativa que produce una variedad de pigmentos, incluida la piomelanina, un pigmento marrón rojizo que ayuda a proporcionar protección contra el estrés oxidativo1-4 y se une a una variedad de compuestos, incluidos los antibióticos aminoglucósidos5-7. La producción de piomelanina está causada por un defecto en la vía del catabolismo de la tirosina4,8, ya sea a través de deleciones o mutaciones del gen que codifica la homogentisa 1,2-dioxigenasa (HmgA)1,9 o a través de desequilibrios en las diversas enzimas de la vía10. El homogentizado se acumula debido a la inactivación de la HmgA, y se secreta y oxida para formar piomelanina11. La producción de piomelanina puede ser abolida o reducida de una manera dependiente de la dosis mediante el tratamiento con el herbicida 2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-ciclohexanediona (NTBC)12, que inhibe la 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (Hpd) en la vía del catabolismo de tirosina13. La Hpd es necesaria para la formación de homogentizado y, por lo tanto, de piomelanina11. 
Describimos en detalle tres técnicas que fueron importantes en nuestros estudios sobre el tratamiento con NTBC de las cepas productoras de piomelanina de P. aeruginosa. Estas técnicas incluyen la titulación de NTBC para determinar las concentraciones que suprimirán o reducirán la producción de piomelanina en las cepas productoras de piomelanina de laboratorio y clínicas, la determinación de la concentración inhibitoria mínima (MIC) de los antibióticos cuando las bacterias se tratan con NTBC y la sensibilidad resultante al estrés oxidativo con el tratamiento con NTBC.
El ensayo de valoración que desarrollamos tiene dos propósitos. En primer lugar, el ensayo permitirá al usuario determinar si el NTBC puede abolir o reducir la producción de piomelanina en la bacteria que se está estudiando y en qué concentraciones. Esto permitirá al usuario determinar la sensibilidad al NTBC, ya que diferentes cepas de bacterias pueden tener diferentes sensibilidades a este compuesto, como se observó en P. aeruginosa12. En segundo lugar, el ensayo de titulación de NTBC permitirá al usuario determinar la concentración adecuada de NTBC para usar en ensayos posteriores, como MIC de antibióticos y ensayos de respuesta al estrés oxidativo, si el objetivo es abolir o reducir la producción de piomelanina y determinar los efectos de la reducción de pigmentos. 
El ensayo de titulación funciona porque se puede observar una diferencia visible en la producción de piomelanina en las cepas tratadas con NTBC y las diferencias en la producción de piomelanina dependen de la dosis12. Además, esta técnica se puede aplicar al estudio de otros compuestos que pueden eliminar o mejorar la producción de pigmentos en las bacterias.
Las CMI de antibióticos se utilizan para determinar la sensibilidad de las bacterias a los antibióticos. Existen varios métodos para determinar los MIC, incluyendo las placas de dilución en agar y las diluciones en caldo14. Las diluciones de caldo se pueden realizar en pequeños tubos de ensayo o en una placa de microtitulación de 96 pocillos. El método de la placa de microtitulación para la determinación de la CMI descrito en este documento permitirá al usuario probar una amplia gama de antibióticos utilizando un mínimo de recursos. El ensayo proporciona reproducibilidad, así como flexibilidad en el número de antibióticos y cepas analizadas por este método. Además, con la incorporación de NTBC en el ensayo, el usuario puede determinar si la eliminación o reducción de la producción de piomelanina altera la sensibilidad a los antibióticos en las bacterias productoras de piomelanina.
La respuesta bacteriana al estrés oxidativo se puede probar de varias maneras. Los métodos más comunes descritos son los recuentos viables de bacterias sometidas a estrés oxidativo durante un período de tiempo1, o los ensayos de difusión en disco de estrés oxidativo15. Estos métodos tienden a utilizar altas concentraciones de estresores oxidativos para examinar los efectos del estrés oxidativo en las bacterias y los resultados pueden ser bastante variables entre las réplicas biológicas. El ensayo de conteo viable también tiende a usar más placas de agar que los otros métodos. El ensayo de placa puntual que describimos utiliza bajas concentraciones deH2O2 y permite al usuario probar la respuesta al estrés oxidativo de múltiples cepas utilizando un mínimo de placas. El ensayo también es consistentemente reproducible entre réplicas técnicas y biológicas. Dado que la piomelanina está implicada en la resistencia al estrés oxidativo, la incorporación de NTBC en el ensayo permite al usuario determinar los efectos de la eliminación de la producción de piomelanina sobre la resistencia al estrés oxidativo.

<table><tbody><tr><td>2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-ciclohexanediona (NTBC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0269-50mg</td><td>También llamado nitisinona.&nbsp; Soluble en DMSO.</td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763-100ML</td><td>30 % en peso en H2O.&nbsp; Estabilizado.</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Oro Bio</td><td>G-400-100</td><td>Soluble en H2O.&nbsp; Filtro esterilizante.</td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td>Soluble en H2O.&nbsp; Filtro esterilizante.</td></tr><tr><td>Tobramicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4014-100MG</td><td>Soluble en H2O.&nbsp; Filtro esterilizante.</td></tr></tbody></table>

métodos para inhibir bacteriana pyomelanin producción y determinar el correspondiente aumento en la sensibilidad al estrés oxidativo

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

La piomelanina es un pigmento extracelular de color marrón rojizo producido por varias especies bacterianas y fúngicas. Este pigmento se deriva de la vía del catabolismo de la tirosina y contribuye a aumentar la resistencia al estrés oxidativo. La producción de piomelanina en Pseudomonas aeruginosa se reduce de manera dependiente de la dosis mediante el tratamiento con 2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-ciclohexanediona (NTBC). Describimos un método de titulación que utiliza múltiples concentraciones de NTBC para determinar la concentración del fármaco que reducirá o suprimirá la producción de piomelanina en las bacterias. El método de valoración tiene un resultado fácilmente cuantificable, una reducción visible en la producción de pigmento con el aumento de las concentraciones de fármacos. También describimos un método de placa de microtitulación para analizar la concentración mínima inhibitoria (CMI) de antibióticos en bacterias. Este método utiliza un mínimo de recursos y puede ampliarse fácilmente para probar varios antibióticos en una placa de microtitulación para una cepa de bacterias. El ensayo MIC se puede adaptar para probar los efectos de los compuestos no antibióticos en el crecimiento bacteriano en concentraciones específicas. Finalmente, describimos un método para probar la sensibilidad bacteriana al estrés oxidativo mediante la incorporación de H2O2 en placas de agar y la detección de múltiples diluciones de bacterias en las placas. La sensibilidad al estrés oxidativo está indicada por las reducciones en el número y tamaño de las colonias para las diferentes diluciones en placas que contienenH2O2 en comparación con un control sinH2O2. El ensayo de placa puntual de estrés oxidativo utiliza un mínimo de recursos y bajas concentraciones deH2O2. Es importante destacar que también tiene una buena reproducibilidad. Este ensayo de placa puntual podría adaptarse para probar la sensibilidad bacteriana a varios compuestos mediante la incorporación de los compuestos en placas de agar y la caracterización del crecimiento bacteriano resultante.

Titulaciones NTBC Las titulaciones NTBC se utilizaron para determinar si NTBC fue capaz de reducir la producción de pyomelanin en P. aeruginosa, y también identificar la concentración de NTBC que elimina o reduce la producción pyomelanin para uso en ensayos adicionales. Es posible que haya variaciones en los niveles de pyomelanin producido en diferentes repeticiones, pero las tendencias generales permanecer constante. El ensayo de valoración NTBC también podría ser modifica...

La producción de piomelanina bacteriana resulta en una mayor resistencia al estrés oxidativo y a la virulencia. Informamos sobre las técnicas que se pueden utilizar para determinar la inhibición de la producción de piomelanina y analizar el aumento resultante en la sensibilidad al estrés oxidativo en las bacterias, así como determinar la concentración mínima inhibitoria (MIC) del antibiótico.

Métodos para inhibir bacteriana Pyomelanin Producción y determinar el correspondiente aumento en la sensibilidad al estrés oxidativo

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Los objetivos generales de los siguientes experimentos son determinar los efectos del NTBC sobre la producción de p melanina y la sensibilidad al estrés oxidativo, así como las concentraciones mínimas inhibitorias de antibióticos o CIM. Esto se logra añadiendo NTBC a cultivos bacterianos para determinar la concentración que reduce la producción de p melanina como segundo paso. Los cultivos bacterianos se tratan con NTBC y antibióticos, lo que permitirá al usuario determinar si el tratamiento con NTBC tiene un efecto sobre las CIM de los antibióticos.Los cultivos tratados con NTPC se exponen a peróxido de hidrógeno con el fin de determinar la sensibilidad al estrés oxidativo. Los resultados obtenidos muestran que el tratamiento de bacterias génicas con NTPC conduce a una reducción en la producción de pigmento y un aumento en la sensibilidad al estrés oxidativo, sin tener efecto sobre los MIC de antibióticos basados en la respuesta al estrés oxidativo, según las placas de puntos y los ensayos de MIC en microplacas, respectivamente. La principal ventaja de la técnica de placas de puntos para estrés oxidativo frente a métodos existentes como los recuentos de viabilidad y los ensayos de difusión en disco es que se pueden utilizar concentraciones más bajas de peróxido de hidrógeno, en lugar de las altas concentraciones empleadas en otros ensayos. Por lo general, las personas nuevas en nuestro método para determinar los MIC de antibióticos tendrán dificultades porque la falta de precisión en la técnica de pipeteo introduce variabilidad entre réplicas.Esta variabilidad puede dificultar la determinación precisa del antibiótico. MIC Un día antes del ensayo de MIC. Prepare cultivos de las cepas que se van a probar en LB con y sin.Dos nitro, cuatro trior etil bencenoil uno tres Ciclohexano Diona, o NTBC. Esta demostración utiliza el nivel representativo de 300 micromolar de NTBC. El método de titulación para determinar la concentración adecuada de NTBC se describe en el texto del protocolo: incubar las culturas durante la noche a 37 grados Celsius con aeración al día siguiente.Prepare soluciones maestras de LB con NTBC y LB con DMSO para el ensayo de MIC para probar un antibiótico en una cepa a 600 micromoles de NTBC por dos mililitros de LB y mezcle. Para preparar la solución maestra de NTBC. Se añade NTBC a una concentración de 600 micromoles porque se diluirá dos veces cuando se agregue el inóculo.Para obtener una concentración final de 300 micromolares, añada un volumen equivalente del vehículo DMSO a dos mililitros de LB y mezcle para preparar la solución madre de NO NTBC. Estas dos soluciones madres se utilizarán para crear soluciones stock de antibióticos, así como para preparar la serie de diluciones en placas de 96 pocillos. A continuación, prepare las soluciones de antibiótico en las soluciones madres de LB más NTBC o LB más DMSO.Prepare la solución stock de gentamicina más o menos NTBC a 64 microgramos por mililitro. Elabore la solución stock de kanamicina más o menos NTBC a 256 microgramos por mililitro. Prepare la solución stock de tobramicina más o menos NTB a ocho microgramos por mililitro.Después de preparar las dos soluciones de antibióticos, añada 100 microlitros de cada solución de antibiótico a cuatro pocillos en una placa de 96 pocillos en la fila A. Por ejemplo, la gentamicina debe colocarse en los pocillos A1 a A4, la kanamicina en los pocillos A5 a A8, y la tobramicina en los pocillos A9 a A12. Añada 50 microlitros de la solución maestra de LB más NTBC o LB más DMSO a las filas B a H de la placa de 96 pocillos, asegurándose de que una placa contenga LB más NTBC y la otra contenga LB más DMSO. Utilizando un micropipeteador, realice diluciones seriadas por duplicación de los antibióticos transfiriendo 50 microlitros de la solución desde la fila A a la fila B. Mezcle la solución, cambie las puntas del pipeteador y transfiera 50 microlitros de la solución desde la fila B a la fila C. Repita este procedimiento para las filas restantes hasta diluir la fila G. Retire 50 microlitros de la solución de esa fila y deseche.Utilice la fila H como control sin antibiótico para el crecimiento bacteriano. Recupere los cultivos nocturnos después de lavar todos los cultivos para eliminar la laninina presente en el medio, mida la DO 600 de los cultivos y diluya los cultivos nocturnos en LB utilizando un micropipeteador multicanal.Añada 50 microlitros de la cultivo bacteriano diluido a los pozos adecuados. Añada bacterias a tres pozos para cada cepa y concentración de antibiótico. Añada 50 microlitros de LB al cuarto pozo para que sirva como control de contaminación bacteriana.Cubra las placas de 96 pocillos con perfil e incube aproximadamente 24 horas a 37 grados Celsius al día siguiente. Examine visualmente las placas en busca de crecimiento bacteriano en los pocillos. La CMI es la concentración más baja de antibiótico en la que no se observa crecimiento bacteriano en las tres réplicas de cada cepa.Para comenzar este procedimiento, prepare cultivos nocturnos de las cepas que se van a probar en LB con y sin NTBC, como se mostró anteriormente, el día siguiente. Prepare APL de LB conteniendo peróxido de hidrógeno como agente de estrés oxidativo. Primero derrita los frascos de agar LB y enfríe el medio a aproximadamente 50 grados Celsius a temperatura ambiente.A continuación, agregue peróxido de hidrógeno directamente al medio enfriado en las concentraciones deseadas. Agite el matraz para mezclar una gama de concentraciones de peróxido de hidrógeno desde cero hasta uno. Milimolar es un buen punto de partida.Vierta inmediatamente las placas y flamee la superficie para eliminar las burbujas. El rendimiento es de cuatro placas por cada 100 mililitros de agar LB. Marque las placas con la concentración de peróxido de hidrógeno.Coloque las placas descubiertas en una cabina de flujo biológico con el ventilador encendido durante 30 minutos para eliminar la humedad excesiva de las placas. Las placas deben usarse el mismo día. Se preparan mientras las placas se secan, lave y mida.El OD 600 de los cultivos nocturnos normaliza el OD 600 de todos los cultivos nocturnos al valor más bajo del conjunto de cepas que se están probando. Para hacer esto, determine el volumen de cultivo necesario para diluir el cultivo hasta el OD 600 más bajo en un volumen total de un mililitro. Por ejemplo, si un cultivo tiene un OD 600 de tres y el OD 600 más bajo del conjunto de cepas es 2,5, realice el siguiente cálculo, lo que dará como resultado 0,833 mililitros como el volumen de cultivo necesario; coloque 0,833 mililitros de cultivo en un tubo microfuga.A continuación, calcule la cantidad de LB más NTBC o LB más DMSO necesaria para llevar el volumen del cultivo a un mililitro. En este ejemplo, la cantidad sería de 0,167 mililitros; mezcle mediante vortex para mantener los cultivos en una concentración constante de NTBC o DMSO. Realice diluciones seriadas de diez veces de los cultivos normalizados de la noche anterior en PBS más NTBC o PBS más DMSO. Prepare soluciones stock de PBS más NTBC y PBS más DMSO, ampliando o reduciendo la escala según la cantidad de cepas que se prueben. Para un conjunto de diluciones de una cepa, agregue 300 micromolar de NTBC o un volumen equivalente de DMSO a PBS teal, hasta un volumen total de 720 microlitros. Añada 90 microlitros de PBS más NTBC o PBS más DMSO a los tubos microcentrífugos correspondientes etiquetados para las diluciones seriadas de 10 a la menos uno hasta 10 a la menos siete.Añada 10 microlitros de cultivo al tubo de dilución adecuado de 10 a la menos uno, mezcle mediante vortex y transfiera 10 microlitros de la dilución 10 a la menos uno al tubo de dilución 10 a la menos dos. Cambiando las puntas de pipeta entre cada dilución, repita hasta que se hayan realizado todas las diluciones. Inocule por duplicado cinco microlitros de las diluciones desde 10 a la menos tres hasta 10 a la menos siete sobre placas de LV más peróxido de hidrógeno.Para cada cepa, utilice una punta de pipeta diferente. Si se siembran puntos desde la dilución más baja hasta la más alta, no incline ni gire la placa hasta que el líquido se haya secado completamente sobre la placa. Incube las placas a 37 grados Celsius durante 24 a 48 horas, según la cepa.Una vez que hayan aparecido colonias de buen tamaño, fotografíe las placas utilizando una cámara CCD colocada sobre un transiluminador. Se realizaron titulaciones con NTBC para determinar si este compuesto era capaz de reducir la producción de melanina p en p aerogen y para identificar la concentración de NTBC que elimina o reduce la producción de melanina p, con el fin de utilizarla en ensayos adicionales como se muestra aquí. El NTBC redujo la producción de melanina PY de manera dependiente de la dosis en productores de melanina p, pero no tuvo ningún efecto sobre la producción de pigmento en cepas que no producen melanina p.Esta tabla muestra los resultados del ensayo de CMI para diferentes cepas de p aerogen tratadas con y sin NTBC y varios antibióticos. Las CMI se registraron como la concentración más baja del antibiótico que inhibió el crecimiento bacteriano. El tratamiento con NDBC no tuvo efecto sobre las CMI de los antibióticos para las cepas analizadas. Se realizó un ensayo en placa de puntos para evaluar la respuesta al estrés oxidativo en cepas productoras y no productoras de melanina de PIO tratadas con y sin NDBC.La placa con cero milimolar de peróxido de hidrógeno mostró que todas las cepas se diluyeron adecuadamente y se observó un aumento en la sensibilidad al estrés oxidativo cuando las bacterias productoras de melanina PIO fueron tratadas con NTBC; las cepas que no producen melanina PIO fueron más sensibles al estrés oxidativo que las cepas que producen melanina p. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo determinar los efectos del tratamiento con NTBC sobre la producción de melanina PIO mediante la evaluación de la sensibilidad al estrés oxidativo y las CMI de antibióticos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

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Métodos para inhibir bacteriana Pyomelanin Producción y determinar el correspondiente aumento en la sensibilidad al estrés oxidativo (Video) | JoVE Journal

Métodos para inhibir bacteriana Pyomelanin Producción y determinar el correspondiente aumento en la sensibilidad al estrés oxidativo

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