Medición de TCR-pMHC Encuadernación In Situ Usando un ensayo de microscopía basada en FRET

En este vídeo, mostraremos cómo medir la cinética entre el receptor de antígeno de la célula T y el complejo mayor de histocompatibilidad cargado de péptidos o PMHC en C dos que se encuentra dentro de la sinapsis inmunológica entre una célula T y una hoja lipídica soportada plana. Le guiaremos brevemente a través de aspectos importantes de la producción de proteínas y la verificación de la integridad funcional de la lámina lipídica mediante mediciones de flujo de calcio. Para obtener información más detallada sobre cómo preparar la lámina lipídica y cómo configurar un microscopio de fluorescencia de una sola molécula, consulte nuestra contribución paralela En el Journal of Visualized Experiments, explicaremos en detalle cómo realizar y analizar mediciones de transferencia de energía de primera o resonancia en un error y a nivel de una sola molécula.

Para deducir la cinética de la unión del receptor sináptico de células T PMHC para explicar nuestra estrategia basada en trastes utilizada en nuestro enfoque general, comenzamos con la estructura cristalina del receptor de células T o TCR aquí en azul a medida que se une a su antígeno, la molécula MHC cargada de péptidos o PMHC que se muestra en amarillo y rojo. También introducimos un fragmento de cadena única de los dominios variables de un anticuerpo reactivo al receptor beta de células T denominado age 57. Para las mediciones cuantitativas basadas en fre, es obligatorio marcar tanto el donante de fre, en nuestro caso, el fragmento de cadena simple, como el receptor de fre, el PMHC de una manera específica del sitio.

Esto es factible para las proteínas recombinantes a través de la introducción de una cisteína no aireada, que luego se puede unir covalentemente a la fuerza fluorada conjugada de los ácaros. Como se muestra, conectamos el donante alimentado Alexa Fluor 5 5 5 o el lado tres al fragmento de cadena única y al aceptor de trastes. Alexa fluye 6, 4, 7 o SI cinco al extremo C del péptido unido al MHC.

La distancia Indy como se muestra en esta estructura compuesta es de aproximadamente 41 angstrum, incluso menos que el primer radio, la distancia de la mitad de la transferencia de energía máxima entre los dos tintes. En nuestros experimentos, empleamos bilares lipídicos planas, soportadas por vidrio, como células presentadoras de antígenos sustitutas. Estos se funcionalizan con PMXC, la molécula de aherencia B seven one y la molécula de adhesión I chem one.

De esta manera, las imágenes se pueden realizar en modo de fluorescencia de reflexión interna total, que ilumina la fuerza de fluor muy cerca de la interfaz, reduciendo así sustancialmente el fondo celular. El traste solo es detectable cuando los TCR etiquetados con un solo fragmento de cadena se acoplan mediante PM hcs incrustados en la capa. Esto nos permite visualizar la unión T-C-R-P-M-H-C y luego calcular la cinética de unión en C dos genes histo correctamente plegados Tact.

Las porciones extracelulares de P seven one e I chem one se purifican a partir de sobrenadantes de cultivos de células de insectos infectados con el virus BUC correspondiente. La purificación se realiza en tres pasos, comenzando con una cromatografía de afinidad anti aros de níquel, seguida de una cromatografía de intercambio de hierro y exclusión por tamaño. Los heterodímeros de clase dos de Histo tag MHC se expresan en ecoli como cuerpos de inclusión y se repliegan in vitro a cuatro grados centígrados y la presencia de un péptido de retención de espacio a través de una dilución rápida en tampón redox.

El péptido del soporte del espacio se escindirá posteriormente mediante la exposición a la luz ultravioleta. Complejos de PMHC debidamente plegados y luego purificados y concentrados en el soporte de espacio. El péptido se escinde y se sustituye a pH 5,2 con el péptido fluorescente.

El producto final es purificado del tamaño del stand. El fragmento de cadena única se expresa con una cisteína no aireada como cuerpos de inclusión en E. coli repletos in vitro a través de diálisis escalonada y purificados por tamaño. A continuación, se etiqueta a través de su cisteína no aireada con un tinte conjugado maide y se purifica el tamaño. Otra vez.

Todas las proteínas recombinantes se dializan finalmente contra el PBS que contiene un 50% de glicerol concentrado en un miligramo de proteína por mililitro y comienza a largo plazo a menos 20 grados centígrados. Utilice la relación métrica URA dos colorantes para medir los niveles de calcio intracelular en las células T como medio para verificar la potencia estimuladora de la capa lipídica. Cargue el blast de células T con el éster URA 2:00 AM.

Este compuesto ingresa a las células a través de su mátula AM, pero luego queda atrapado dentro a través de la acción de las esterasas, que escindin la parte AM. Agregue fira 2:00 AM a aproximadamente 3 millones de células T a una concentración final de cinco micrómetros MO por litro. Transfiera las células de la placa de 24 pocillos a un tubo nuevo e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Lave las células una vez en un tampón de imagen que contiene solución salina tamponada de Hanks que incluye calcio y magnesio y 1% de albúmina. Para controlar el calcio intracelular, utilice un sistema automatizado de microscopio invertido con capacidad UV. Inicie el protocolo de temporización y agregue menos dos células T cargadas a la bicapa lipídica funcionalizada colocada en foco en la etapa del microscopio, adquiera en intervalos de tiempo regulares, una imagen DIC y dos imágenes fluorescentes excitadas con luz UV de 340 y 380 nanómetros.

Inmediatamente después de hacer contacto con la bicapa, las células T adoptan niveles elevados de calcio según la lectura de la proporción de URA dos a los 15 minutos de la ejecución. Agregue un anticuerpo bloqueante a las células que sature todos los antígenos PMHC. Como consecuencia, los niveles de calcio intracelular descienden hasta los del estado no activado, que sirven posteriormente como referencia.

Tan pronto como los niveles presentes de anticuerpos bloqueadores disminuyen a un valor, que refleja el estado no activado, que normalizamos a uno para las mediciones de trastes, las células T deben teñirse con una sonda de traste de fragmento de cadena única reactiva TCR para cada experimento, transferir aproximadamente 1 millón de células a un tubo y girarlas a 400 G. Decantar los medios y drenar las gotas de medios restantes. Pegar a las paredes interiores con una toalla de papel. Esto asegura un volumen de incubación mínimo de unos 30 microlitros que mencioné anteriormente.

El frete se almacena a una concentración de un miligramo por mililitro y un 50% de glicerol a menos 20 grados centígrados. Está específicamente marcado con Alexa, gripe de 5, 5 5, también tres En una proporción de proteína dito de uno a 0,3 microlitros de la sonda a las células. Agite el pellet con cuidado varias veces e incube las células durante 20 minutos en hielo.

Lave las células con un tampón de imagen helado. Repita este procedimiento de lavado una vez. La incubación y el almacenamiento por centrifugación a baja temperatura garantizan que las células T no interioricen la sonda fluorescente mientras están expuestas a ella.

Esto daría lugar a una fluorescencia de fondo elevada. Además, las células T no pierden la sonda en el frío durante el lavado y el almacenamiento antes de colocar la cámara de contención bilar en el intercambio de la etapa del microscopio. El PBS sucesivamente con tampón de imagen evita a toda costa la exposición de la bicapa al aire, ya que esto la destruiría.

Para reducir el fondo celular, empleamos iluminación de césped. Para ello, colocamos el haz de excitación en un ángulo crítico en el que se produce una reflexión interna total. Apague la excitación, encienda la luz amplia y agregue la célula T a la cámara ltec y deje que se asiente en la hoja lipídica.

Encienda la excitación y enfoque una iluminación que no sea de césped. La membrana celular se observa como un anillo a lo largo del eje óptico en cada plano focal en el césped, solo se observa la membrana basal en contacto con la bicapa. Los planos focales superiores ya no están excitados y, por lo tanto, no son visibles.

El protocolo de temporización comienza con las pilas de excitación rojas y verdes para obtener imágenes de PMHC y TCR, seguidas de un pulso de lejía roja para ablacionar el aceptor P-M-H-C-F. Un pulso verde para obtener imágenes del TCR después del blanqueo del aceptor de grasa F, y un pulso rojo para verificar los experimentos de ablación del aceptor F se realizan en una escala de tiempo de menos de un segundo con el retraso más corto posible entre el primer y el segundo pulso verde. Opcionalmente, se puede obtener una imagen DIC al principio, la división de imágenes en dos colores permite la detección simultánea del canal del donante alimentado y del receptor alimentado.

La excitación del aceptor alimentado muestra la acumulación de P HCS en la sinapsis de las células T. Esta imagen preble verifica la presencia de pmcs e indica la unión de PMHC ya mediada por TCR. Excitante. El donante alimentado da lugar a imágenes en ambos canales.

La señal del canal donante alimentado se reduce en cierta medida en intensidad debido a la transferencia de energía al canal F aceptado. La señal del canal aceptado por trastes se compone de sangrado de trastes a través del donante alimentado y excitación cruzada del aceptor de trastes. De todos modos, esta imagen no se utilizará para el análisis.

En el protocolo actual. Una pila rápida de lejía sigue y elimina toda la fuerza fluorada aceptada por F. La intensidad de la imagen del donante de F Fed después del blanqueo aceptable por trastes ahora se recupera a niveles más altos sin pérdida de intensidad en el canal de fres.

La siguiente expectativa del aceptador de trastes verifica el blanqueo completo del aceptor de grasa F. Echemos un vistazo a la sinapsis para cuantificar la recuperación de los donantes alimentados. Determine la intensidad media del fondo, una constante, independientemente del aceptor de frecuencia.

A continuación, el fotoblanqueo determina la intensidad media de la sinapsis y la de un grupo TCR representativo. A continuación, se calcula el rendimiento de los trastes normalizando la diferencia antes y después de la ablación del aceptor f. En nuestro ejemplo, medimos el 16%fret para toda la sinapsis y el 26%fret para el representante.

Los rendimientos de los trastes del grupo TCR se convertirán posteriormente en ocupaciones TCR, lo que dará lugar a datos de una sola molécula constante de disociación sináptica bidimensional. Sírvanos para deducir la cinética de la unión del péptido TCR sináptico MHC para experimentos de amenaza de una sola molécula F. Utilizamos los mismos reactivos y la misma estrategia de trabajo que antes.

Sin embargo, para asegurarnos de que realmente observamos la interacción entre un solo TCR y un solo péptido MHC, elegimos cumplir con el siguiente criterio. Un evento candidato para una sola molécula fre tiene que coincidir coloquialmente con la molécula aceptora o donante fre. Aquí empleamos una sola PMHC como molécula aceptora de fre para verificar la naturaleza de una sola molécula del evento fre observado, pero lo contrario racional.

El uso de aceptores alimentados en los botones superiores y donantes Fred y botones bajos es sin duda una opción. Por lo general, exponemos células T que entran en contacto con una lápida estimuladora con una excitación de 514 y 647 nanómetros, la excitación del donante y del aceptor secuencial y repetitiva con un retraso mínimo de un milisegundo es seguida por un tiempo de retardo. Eso se puede variar de acuerdo con los requisitos del experimento.

Para obtener una señal fluorescente lo suficientemente fuerte para la detección de una sola matriz dentro de los milisegundos posteriores a la excitación, necesitamos aplicar altas densidades de potencia de excitación que oscilan entre uno y cinco kilovatios por centímetro cuadrado. Debido al fotoblanqueo, el número de moléculas visibles del aceptor de trastes PMHC cae rápidamente a un nivel en el que la fuerza fluorada del aceptor de un solo traste se hace distinguible en una bicapa que contiene 30 o más PMCS marcados por micra cuadrada. Aquí se muestra un ejemplo para un retraso de tiempo total de 42 milisegundos.

Un solo evento de traste marcado con el círculo rojo se hace visible en el segundo y tercer punto de tiempo. Se colocaliza con una sola molécula S cinco marcada con un círculo verde. En este ejemplo, el evento de traste observable tiene una longitud de traza de dos, recopile más trazas de traste de una sola molécula como se muestra en la tabla en unas 128 trazas.

A continuación, calcule la suma acumulada complementaria de las trazas como se muestra en los números verdes y normalícelas como se muestra, trace los valores normalizados y ajústelos con una función monoexponencial. El valor esperado es de poco más de 1,5 marcos temporales. Este valor depende del péptido TCR, la unión al MHC y el fotoblanqueo para poder discriminar entre estas dos contribuciones, por lo que el valor esperado debe calcularse para al menos tres momentos diferentes.

Los retrasos ahora trazan todos los valores esperados con respecto a sus respectivos retrasos de tiempo y ajustan los puntos de datos a la función que se muestra que contiene la duración aquí. 2,12 segundos y el valor esperado para PHOTOBLEACHING f Fred. La recuperación del donante después del blanqueo aceptable de F Fred, como se muestra aquí y con más detalle antes, se puede utilizar para determinar en unos pocos pasos las constantes de disociación bidimensionales ya que son efectivas dentro de la sinapsis inmunológica.

Aquí centramos nuestro análisis en la interacción de TCR y los clústeres de TCR donde la unión T-C-R-P-M-H-C es más prominente. Como se hace evidente a partir de las mediciones mostradas, los rendimientos de F FRED varían sustancialmente. Para clústeres TCR individuales.

La multiplicación de los rendimientos de F fred por el factor de proporcionalidad C da lugar a la ocupación de TCR. Un término que describe la relación entre el número de TCR unidos a PMHC y su número total C debe determinarse una vez para un conjunto específico de pares de fre y el sistema FRE empleado. Hacia el final de esta presentación, explicaremos con más detalle cómo determinar C, por ejemplo, lo que implica SI tres y SI cinco colocados específicamente en el fragmento de anticuerpo reactivo de cadena simple TCR R y el extremo C del péptido unido al MHC. Equivale a aproximadamente dos constantes de disociación sinápticas, bidimensionales que se pueden calcular a partir de la ocupación TCR denominada A y la densidad inicial de pmcs presentes en la hoja lipídica.

La relación mostrada se deriva de la ley de la acción de masas y se explica con más detalle en el artículo que acompaña a esta película. En nuestro ejemplo, la densidad inicial de pmcs asciende a 30 moléculas por micra cuadrada. Llegamos a una distribución de kds 2D, que son eficaces en la sinapsis de las células T con un valor medio de unas 34 moléculas por micra cuadrada.

La distribución de la tasa de encendido se puede calcular a partir de la distribución sináptica 2D de KD y la correspondiente tasa de apagado aquí, 0,41 por segundo según se determina mediante el análisis de trazas de traste de una sola molécula a 24 grados Celsius. El valor medio es de aproximadamente 0,01 micras cuadradas por molécula en segundo. En resumen, las mediciones de la amenaza de F entre el TCR y el péptido MHC permiten un análisis exhaustivo de todos los parámetros cinéticos que describen la dinámica de reacción en C dos.

En principio, esta metodología puede generalizarse al análisis de las interacciones de otros ligandos receptores, ya que podrían ser parte integral del reconocimiento de las células. Por último, pero no menos importante, discutimos cómo derivar experimentalmente la constante C, que es necesaria para convertir los rendimientos de grasa en ocupaciones de TCR. Este procedimiento debe realizarse solo una vez.

La constante C determinada se puede emplear para todos los experimentos posteriores en los que se aplica el mismo sistema de trastes con los mismos cuatro flúores. En este procedimiento, transmitimos en esencia los rendimientos de trastes medidos en grupos TCR individuales a través de la recuperación del donante después del fotoblanqueo del aceptor a los valores de intensidad correspondientes detectados en el canal de traste sensibilizado. Como se discutió anteriormente, el rendimiento del traste se determina a partir de las imágenes del canal donante de trastes corregidas en fondo antes y después de la ablación del aceptor de trastes.

El canal de traste sensibilizado debe alinearse con el canal donante F y X e Y y corregirse para el fondo. El donante de Fred sangra y Fred acepta la excitación cruzada como se muestra aquí. En el artículo se proporciona una descripción detallada de cómo corregir la hemorragia del donante de Fred y la excitación cruzada de aceptación de Fred.

Acompañando este video, ahora calcule para cada clúster TCR la relación entre la señal de error de la imagen de traste corregida y la imagen donante de traste corregida correspondiente. Determine la señal promedio corregida para donantes de traste único y eventos de traste de molécula única y calcule la proporción. A continuación, se obtiene la ocupación del TCR multiplicando ambas proporciones.

Ahora, represente los rendimientos de trastes determinados para los clústeres de TCR individuales en comparación con sus ocupaciones de TCR. A continuación, C se determina mediante una regresión lineal, como se muestra aquí. En nuestro ejemplo, equivale a una segunda ronda.

Después de ver este video, debería poder utilizar una bicapa lipídica funcionalizada por proteínas en combinación con microscopía de fluorescencia de molécula única para medir la cinética de unión sináptica entre PMHC y TCR. Se discutieron todos los pasos necesarios, incluida la producción de proteínas, el etiquetado de células T y las mediciones finales de los trastes. Además, se mostró en detalle el análisis de imágenes que arrojó curvas de activación de células T y valores de trastes.

Por último, se ha mostrado la metodología que subyace a la determinación de las tasas cinéticas de encendido y apagado. En principio, se puede utilizar un enfoque análogo para determinar otras interacciones de ligandos de receptores sinápticos, aunque podrían ser necesarias las modificaciones adecuadas.