Name: Medición de TCR-pMHC Encuadernación In Situ Usando un ensayo de microscopía basada en FRET (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 5 s
Description: Aprende a medir la cinética de unión TCR-pMHC in situ mediante microscopía FRET en la sinapsis inmunológica. Este método cuantifica afinidad, velocidades de asociación y disociación a nivel de molécula única.

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MA fue apoyado por una beca de Schrödinger del Fondo austríaco Ciencia (FWF, J3086-B11) y gracias al Max-Planck-Sociedad para el apoyo financiero y administrativo. GS y JH fueron apoyados por el Fondo de Ciencia y Tecnología de Viena (WWTF, LS13-030).

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Los autores declaran que no tienen ningún interés financiero contrapuesto.

La medición de las interacciones proteína-proteína in situ es muy deseable, especialmente cuando se trata de interacciones de baja afinidad tales como TCR-pMHC de unión 11. Esto se debe a que la tasa en, así como la estabilidad de tales interacciones se ven influidas significativamente por las circunstancias particulares en las que la unión se lleva a cabo. Enfoques de imagen basados ​​en FRET mínimamente invasivos son, pues, en principio, perfectamente adecuado para este tipo de tareas, sin embargo, implican una serie de obstáculos que primero se deben superar. El ruido generado por la autofluorescencia celular limita la sensibilidad de las mediciones y por lo tanto se debe mantener en un mínimo. Microscopía TIRF sirve esta necesidad muy bien 12, sino que requiere la funcionalización de vidrio toboganes, idealmente en forma de un plano de lípidos bicapa apoyado por el vidrio decorado con proteínas de elección 13-15. Otra ventaja de un enfoque en parte reconstituyente es que los socios de FRET-bicapa residente recombinantes pueden ser mucho mel mineral fácilmente etiquetados en un sitio específico de manera cuantitativa y racional con fluoróforos más pequeños y más brillantes de lo que sería posible con proteínas expresadas en la superficie de células. TCR etiquetados con SCF recombinante V s, que no influyen en el reconocimiento de células T, como se ha probado previamente 2. Además, la composición de proteínas de la SLB, por ejemplo la densidad de pMHCs y la elección de factores accesorios se puede ajustar a las propias necesidades específicas. Hemos realizado previamente experimentos con diferentes densidades de pMHCs estimulantes, pero no hemos detectado diferencias significativas en 2D-k off y 2D-K D 2. Hasta ahora aquí el reconocimiento de moléculas del MHC de clase II se ha tratado solamente, principalmente debido a la naturaleza de su hendidura de unión de péptidos, que está abierto en ambos extremos y por lo tanto tiene capacidad para péptidos más grandes, incluyendo un enlazador para la unión fluoróforo. En algunos casos como enfoque también podría funcionar para el etiquetado MHC class I moléculas 16, pero mucho cuidado se debe tomar para verificar su uso en experimentos. La sensibilidad de las células T hacia antígenos, que pueden ser medidas a través de ensayos de proliferación de células T, así como el cinética de unión a pMHC-TCR como se mide in vitro por resonancia de plasmón de superficie no debe ser afectada por la adición del enlazador y fluoróforo a el péptido. Alternativamente, las moléculas MHC de clase I puede marcarse a sí mismos de una manera específica de sitio con la introducción de una cisteína no apareado dentro de la secuencia de la cadena pesada (observaciones no publicadas). Con el uso de sondas moleculares apropiados cualquier interacción proteína-proteína sináptica puede en principio ser estudiado de una manera descrita en este documento. Dichas sondas, por ejemplo, SCF V s o proteínas diseñadas Ankyrin Repetir (DARPins) 17, deben ser monovalentes y deben unirse a su objetivo de forma estable sin afectar a la interacción de los intereses. Por supuesto, informatio estructuraln es altamente deseable para el diseño racional de la sonda pero no es absolutamente necesario. Al establecer un nuevo par de socios FRET, se recomienda para registrar y analizar FRET en mayor primero. Los sitios de fijación de la etiqueta se pueden variar considerablemente para maximizar la señal de FRET y también para verificar que los rendimientos medidos FRET difieren en función de la distancia entre tinte. Una vez que el sistema está optimizado, sola molécula FRET señales pueden ser grabadas mediante la limitación del etiquetado de la pareja FRET alta abundancia a 10-30% y blanqueo de la pareja FRET baja abundancia hasta que moléculas individuales se pueden resolver en el campo de la iluminación. Por último, pero no menos importante, hay que señalar que SLBS aproximar algunos, pero no todos los aspectos de una membrana plasmática fisiológica. Cualidades tales como curvatura de la membrana y la flexibilidad, la compartimentación de dominio, los reordenamientos del citoesqueleto y la motilidad celular, así como una alta variedad de proteínas de la membrana expresada en la superficie no están representados por SLBS pero podrían influir en tse procesa bajo investigación. Tendrá que ser invertido para establecer modalidades de imagen que permiten monitoreo interacciones proteína-proteína con resolución única molécula en las sinapsis fisiológicas, que son inaccesibles a las imágenes TIRF mucho esfuerzo.

Una comprensión más fundamental de cómo las células T reconocen los antígenos requiere que mira en el lugar correcto, es decir, dentro de la sinapsis inmunológica formada entre la célula T y el APC. Aquí, la cinética de unión molecular no sólo están determinadas por las propiedades bioquímicas inherentes de los compañeros de interacción involucrados, pero dependerá en gran medida de parámetros celulares, que incluyen fuerzas celulares, la arquitectura de la membrana y las interacciones laterales entre proteínas de la membrana así como las limitaciones geométricas-sinapsis específica 3. Enfoques bioquímicos están limitados en poder de resolución, ya que requieren la interrupción de al menos una de las membranas sinápticas implicadas. Por este motivo se ha desarrollado una metodología de formación de imágenes basada en FRET para monitorear la unión del TCR a pMHCs antigénicos 2. Aquí las células T están decoradas con un recombinante y el sitio específicamente etiquetados fragmento de anticuerpo de cadena simple-TCRβ reactiva (SCF V) y se enfrentaron con el plan<html> bicapas ar apoyado por el vidrio de lípidos (SLBS), que albergan MHC moléculas clase II cargadas con un péptido antigénico marcado con fluorescencia, moléculas coestimuladoras y proteínas de adhesión. Unión sináptica entre marcado tinte TCR y marcado con tinte resultados pMHC en FRET, que pueden ser monitoreados en un mayor y el nivel de moléculas individuales por Total Interna Fluorescencia de Reflexión (TIRF) microscopía. En este artículo se explica en detalle cómo utilizar SLBS para ensayar las sinapsis de células T, verificar su integridad a través de un ensayo de flujo de calcio de células T funcional, conducta FRET mediciones a granel y con sensibilidad única molécula, y analizar los datos adquiridos. Las recomendaciones se ofrecen para la producción de proteínas adecuadamente conformados necesarios para funcionalización bicapa. Para obtener información más específica acerca de la formación de bicapa y la configuración de un microscopio TIRF adecuada consulte a un acceso público JoVe publicación adicionales publicados espalda con espalda 4. tienda &quot;&gt; Naturaleza de SLBS SLBS funcionalizables se pueden generar fácilmente a partir de vesículas unilamelares (SUV) que contienen los dos lípidos-2-oleoil-sn-gylcero-3-fosfocolina 1-palmitoil (corto: POPC, 90-99%) y sn-1,2 dioleoyl- - glicero-3 - {[N (5-amino-1-carboxipentil) iminodiacético ácido] succinil} (corto: DGS NTA-Ni, 10.01%). Todo terrenos repartidos en portaobjetos de vidrio limpios para formar una bicapa plana contigua 4. DGS-NTA-Ni sirve para anclar proteínas marcada con polihistidina a través de la formación de complejo de polihistidina mediada con el NTA-Ni-que contiene grupo de cabeza (Figura 1A) sintético. Por asociación estable de un típicamente sustituye al dominio transmembrana nativa y cola citoplásmica de la proteína de adhesión ICAM-1 y la molécula coestimuladora B7-1 con una etiqueta que contiene doce histidinas (ICAM-1-12H, -12H B7-1) (Figura 1B) . La clase II molécula IE k cargado con péptido contiene dos cadena polipeptídica membrana incorporado (α y β)s. Los transmembrana / dominios citoplásmicos de ambas cadenas tienen que ser reemplazados con una etiqueta que contiene seis histidinas cada uno (IE k α β 6H 6H o IE k -2x6H). Como alternativa, la ampliación de la α-cadena con doce histidinas y dejando el dominio extracelular de la cadena β sin etiquetar (dando lugar a IE k α β 12H 0H o IE k -12H) da lugar a resultados satisfactorios (Figura 1B). Etiquetado específico del sitio de pMHCs Es importante para etiquetar el pMHC estequiométricamente y específica de sitio con el fin de ser capaz de convertir los rendimientos medidos FRET en las constantes de unión de equilibrio significativas. Esto se puede lograr por medio del etiquetado química de un péptido sintético que se carga en la hendidura de unión al péptido de histidina recombinante marcada con moléculas MHC de clase II 2,5. El péptido incluye todos los residuos del epítopo de células T como well como un corto C-terminal enlazador (GGS) seguido de cisteína (por ejemplo, en el citocromo c de polilla (MCC) péptido ANERADLIAYLKQATK- GGSC, el enlazador está marcado en negrita). Esta cisteína se utiliza para marcar el péptido estequiométricamente con el uso de derivados de maleimida en colorantes. En este punto, un cuidado especial debe ser dedicado a la verificación cuantitativa tinte acoplamiento al péptido que contiene cisteína. Se recomienda HPLC-purificación del producto de adición de péptido-colorante y tiene que ser seguido por espectroscopia de masas de ionización por electrospray. Cualquier masas grabados correspondientes al educto péptido (sin colorantes) reflejan etiquetado incompleto. Si esto es cierto, el péptido purificado por HPLC debe ser sometido a rondas consecutivas de tinte etiquetado hasta el etiquetado se considera cuantitativo. Tenga en cuenta que la espectroscopia de masas MALDI-TOF se debe evitar ya que este método implica radiación láser para la muestra de ionización. Este tratamiento se desintegra los fluoróforos sensibles conectados antes de que se dio lectura a la masa péptido y así underrepre<html> senta grados de tinte de conjugación. El marcaje indirecto aún específica de sitio de los TCR unidos a células con el uso de una sola cadena monovalente fragmentos F V Todavía es un reto para fijar los tintes a teléfonos proteínas asociadas a la superficie de las células vivas de una manera específica de sitio. Para superar este obstáculo para los TCR expuestos en la superficie, una versión monovalente de cadena sencilla (scFv V) de los genes del anticuerpo monoclonal Reactivo TCRβ H57-197 2 se ha construido. La estructura cristalina de este anticuerpo en complejo con el TCR permite diseñar racionalmente una versión, en la que un residuo de serina en estrecha proximidad a la C-terminal del péptido asociado de MHC (donde está conectado el correspondiente colorante pareja FRET) se sustituye por una residuo de cisteína. Esta cisteína mutante sirve entonces como un aceptor para la conjugación colorante (Figura 2). Metodologías para grabar FRET nt &quot;&gt; valores de FRET a granel son los más adecuados para verificar la relación entre las distancias inter-dye elegidos y FRET eficiencias medidas en este TCR-pMHC sistema 2 vinculante. Además, las mediciones de FRET a granel revelan diferencias cualitativas y cuantitativas en sinápticas afinidades TCR-pMHC ( ver abajo y sección de protocolo 3.2). Diversos enfoques para cuantificar la eficiencia de FRET se han introducido en la literatura 6. En este artículo FRET se registra a través de (a) la recuperación de los donantes después del blanqueo aceptante, y por medio de (b) sensibilizado FRET emisión aceptor. El primer método (a) requiere el uso de un aceptor de FRET que pueden ser photobleached fácilmente, y un donante, que es bastante fotoestable. Además, es importante asegurarse de que el aceptor photobleached ya no es capaz de extinguir la fluorescencia del donador. Como el mismo canal de detección (donante) se utiliza para la cuantificación, sin factores de corrección unad no hay aberraciones cromáticas tienen que ser considerados, lo que hace que esta metodología simple y fiable. Sin embargo, las mediciones cuantitativas no se pueden repetir en el mismo lugar espécimen y los cambios en la FRET no se pueden grabar en el tiempo. Para evitar los efectos causados ​​por la difusión molecular o la motilidad celular una etapa de blanqueo rápido debe estar dirigida para, lo que minimiza el tiempo que pasa entre la primera donante de FRET (antes del blanqueo aceptor) y el segundo de adquisición de imágenes donante de FRET (después de FRET aceptor de blanqueo). Es recomienda emplear una poderosa fuente de luz láser de la longitud de onda de excitación aceptor FRET con el fin de reducir al mínimo la iluminación y el blanqueo de veces. Por el contrario, en el enfoque de la medición de la emisión sensibilizada FRET (b) el donante de FRET es excitado y la emisión del aceptor de FRET se observa en el canal aceptor de FRET. Los cambios en la señal de aceptor de FRET se pueden grabar con el tiempo pero de emisión del donador FRET en el canal aceptor desplazada al rojo (termed bleedthrough) y FRET aceptora cruzada de excitación a través de la excitación de los donantes tienen que ser determinados y restado del canal aceptor FRET registrada con exactitud. Para ello, los correspondientes FRET donante y aceptor de FRET imágenes tienen que estar alineados espacialmente. La detección de una sola molécula (cm) de FRET eventos Con el uso de láseres como fuente de excitación, una cámara sensible y TIRF microscopía de ruido atenuado la fluorescencia de los fluoróforos individuales se pueden rastrear fácilmente con el tiempo. Similar es cierto para la detección de eventos smFRET intermoleculares. Sin embargo, las complicaciones pueden ser causados ​​por FRET bleedthrough donante y cross-excitación del aceptor FRET, y por lo tanto mucho cuidado tiene que ser tomado al ajustar las densidades fluoróforo en el experimento smFRET. En el protocolo se proporciona a continuación (servicio de protocolo 4) el TCR fue elegido como FRET donantes en alta abundancia y pMHC como FRET aceptora con poca abundancia. Para atenuar FRET donante bleedthrough suficientemente, decorar el 10-30% de los TCR con fluorescente scFv V y 90 a 70% de los TCR con no fluorescente scFv V. Aquí el canal aceptor de FRET fue elegido como único canal molécula porque es confocal con la molécula de FRET solo canal. Esto ayuda a alinear eventos smFRET con aceptores de FRET sola molécula, que es la base de la validación smFRET. La extracción fuera de las tasas a través de mediciones sinápticas smFRET Photobleaching tanto FRET donante y aceptor FRET tiene que ser contabilizadas al extraer la vida media de las interacciones de una sola molécula FRET rastros. El número de FRET señales observables en el comienzo de su aparición como único par donador-aceptor N (0) se reduce con el tiempo por tanto unbinding del photobleaching complejo y receptor-ligando. El número de complejos de sobrevivir en un momento dado N (t) se puede expresar matemáticamente como sigue: En el término exp photobleaching (-t / τ lejía) el tiempo t es descrito por el producto del número de observaciones n y el tiempo de iluminación t enferma a causa del modo de observación no continua, discreta (es decir, solamente se produce la decoloración durante la iluminación ). Dentro de la exp- cinética plazo (t / τ off) el tiempo t es el producto del número de observaciones n y t el tiempo de retardo para una única observación FRET (es decir, unbinding cinética ocurre continuamente). Ecuación 1 se puede expresar como: <img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq2.jpg" /> La τ término lejía / τ mal describes el número de observaciones hasta que se produzca el blanqueo y se define como el valor esperado &lt;n blanquear&gt; de su función exponencial. Ecuación 2 se puede simplificar como sigue: <img alt="Ecuación 3" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq3.jpg" /> El valor esperado &lt;n (t lag)&gt; del número de cuadros N (t) con FRET-eventos observables después del tiempo t se determina directamente a partir del experimento. Depende del tiempo ajustable entre las observaciones (t lag) elegidos en el experimento y los valores desconocidos para τ off (el inverso de la tasa de descuento k off) y &lt;n blanquear&gt;, el valor esperado del número de observaciones antes de que ocurra el blanqueo . Por lo tanto, el cálculo del valor esperado &lt;n (t lag)&gt; durante al menos dos valores de t <sub&gt; lag permite la determinación experimental de &lt;n blanquear&gt; y T se fuera. La extracción de los valores sinápticos 2D-K D a través de mediciones basado en FRET La medición de la ocupación de un TCR, es decir, la relación entre la envolvente y las TCR TCR totales, es fundamental para determinar los valores sinápticos 2D-K D. Según la ecuación 4 este término es directamente proporcional a la medida FRET producir, siempre y cuando los TCR sirve como donantes y aceptores de FRET pMHCs como FRET. <img alt="Ecuación 4" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq4.jpg" /> con una ocupación = TCR, C = factor de conversión C es una constante, que depende del sistema de FRET y los fluoróforos utilizados. Se puede determinar experimentalmente como se muestra a continuación. una se puede convertir en un 2D-K D según la ecuación 5 cuando elSe sabe densidad inicial de ligandos de TCR antes de la adición de las células T a la bicapa. Esto es debido a la gran movilidad de las proteínas unidas-SLB y también porque SLBS proporcionar un depósito casi inagotable de ligandos 2. <img alt="Ecuación 5" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq5.jpg" /> con [pMHC inicial] = densidad inicial de pMHC antes de la adición de las células T Con las ecuaciones 4 y 5 ahora se puede determinar fácilmente la sináptica 2D-K D entre TCR y pMHC. Esto se hace más fiable con mediciones de FRET basado en la recuperación de los donantes después del blanqueo aceptor (ver sección 3.1 del protocolo). Sin embargo, para medir C la relación entre la intensidad I FRET FRET (corregida para el fondo, FRET bleedthrough donante y aceptor de FRET transversal de excitación) y TCR ocupación A tiene que ser determinada. Para estetiene que saber la relación R entre la intensidad media de fluorescencia de los fluoróforos individuales asociados-TCR FRET donantes (por ejemplo Cy3 o AF555) sm me traste donante y la intensidad media de una sola molécula FRET eventos sm me preocupe. R depende del sistema de FRET en cuestión, filtros de emisión y de la cámara utilizada para la detección de fluorescencia. El TCR de ocupación una continuación, se puede determinar directamente según la ecuación 6. <img alt="Ecuación 6" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq6.jpg" /> con R = sm me traste donante / sm me traste R se determinó como 1,45 para el sistema H57 scFv Cy3 / pMHC-Cy5 conduce a: a = mayor que FRET / mayor que TCR-cy3 • 1.45 La relación entre la ocupación de TCR A y el rendimiento FRET se puede determinar mediante FRET donante recuperary después del blanqueo aceptor. Para ello ambos parámetros se representan uno contra el otro para un número microclusters TCR como se muestra en la Figura 4A .La pendiente de la ajuste lineal indica el factor de conversión C (partir de la ecuación 4). Como se ha demostrado en la Figura 4A, C asciende para (a) el scFv H57 V - Cy3 / Cy5-pMHC sistema de FRET y (b) la configuración del sistema microscopio aplicado a 1.995. El TCR de ocupación a puede fácilmente deducirse de la siguiente manera: Ocupación TCR a = FRET ceder • 1.995

<table><tbody><tr><td>LB-media</td><td>Fisher Scientific</td><td>10000713</td><td>expresión bacteriana</td></tr><tr><td>Sf900 II</td><td>Life Technologies</td><td>10227402</td><td>medios de células de insectos para la producción de virus baculo</td></tr><tr><td>Insect-XPRESS con L-glutamina (Lonza)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10564038</td><td>medios de células de insectos para la expresión del virus baculo</td></tr><tr><td>células Sf9</td> Life <td>Technologies</td><td>11496-015</td><td>células para virus Producción y expansión</td></tr><tr><td>High Five Cells</td><td>Life Technologies Células</td><td>B855-02</td><td>para la expresión de poteína</td></tr><tr><td>LB-media</td><td>Fisher Scientific</td><td>10000713</td><td>expresión bacteriana</td></tr><tr><td>Sistema Centramate</td><td>Concentartion de proteínas Pall</td><td></td><td></td> de grandes volúmenes</tr><tr><td>Cassette Centramate 10kDa Cutoff</td><td>Pall</td><td>OS010T12</td><td>protein concentartion de grandes volúmenes</td></tr><tr><td>Unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra-15</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC900308</td><td>concentración de proteínas</td></tr><tr><td>Unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra-4 EMD</td><td>Millipore</td><td>UFC800308</td><td>concentración de proteínas</td></tr><tr><td>Amicon Stirred Ultrafiltration Cell modelo 200 mL</td><td>EMD Millipore</td><td>5123</td><td>concentartion de proteínas</td></tr><tr><td>&Auml; KTA PURE 25L</td><td>GE Healthcare</td><td>29-0182-24</td><td>purificación de proteínas</td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td>purificación de proteínas</td></tr><tr><td>Superdex 75 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5174-01</td><td>purificación de proteínas</td></tr><tr><td>Mono Q 5/50GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5166-01</td><td>purificación de proteínas</td></tr><tr><td>Ni Sepharose 6 Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5318-01</td><td>purificación de proteínas</td></tr><tr><td>Tricorn 10/20 columna</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4064-13</td><td>purificación de proteínas</td></tr><tr><td>Sistema de HPLC Gilson</td> Purificación <td>Gilson</td><td></td><td>de péptidos acoplados a fluorocromos</td></tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 y micro; m tamaño de partícula, tamaño de columna de 21,2 * 250 mm</td><td>Agilent</td><td>A6000250X212</td><td>purificación de péptidos acoplados a fluorocromos</td></tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 y micro; m tamaño de partícula, 21,2 * 50 mm tamaño de columna</td><td>Agilent</td><td>A6000050G212</td><td>purificación de péptidos acoplados a fluorocromos</td></tr><tr><td>Tricorn 10/20 columna&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4064-13</td><td>purificación de proteínas</td></tr><tr><td>Sistema de HPLC Gilson</td> Purificación <td>Gilson</td><td></td><td>de péptidos acoplados a fluorocromos</td></tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 y micro; m tamaño de partícula, tamaño de columna de 21,2 * 250 mm</td><td>Agilent</td><td>A6000250X212</td><td>purificación de péptidos acoplados a fluorocromos</td></tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 y micro; m tamaño de partícula, 21,2 * 50 mm</td> tamaño de columna <td>Agilent</td><td>A6000050G212</td><td>purificación de péptidos acoplados a fluorocromos</td></tr><tr><td>Maleimida GE Healthcare</td><td></td><td>PA23031</td> el <td>marcaje de proteínas específicas del sitio a través de cisteínas mutantes no apareadas</td></tr><tr><td>Cy5 maleimida</td><td>GE Healthcare</td><td>PA25031</td><td>el marcaje de proteínas específicas del sitio a través de cisteínas mutantes no apareadas</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 C2 Maleimida</td><td>Life Technologies</td><td>A-20346</td><td>marcaje de proteínas específicas del sitio a través de cisteínas mutantes no apareadas</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimida</td> Life <td>Technologies</td><td>A-20347</td><td>marcaje de proteínas específicas del sitio a través de cisteínas mutantes no apareadas</td></tr><tr><td>Fura-2, AM, permeado celular</td><td>Life Technologies</td><td>F-1221</td><td>colorante sensible al calcio para el marcaje celular</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma Aldrich 151874</td><td></td><td>para disolver Fura-2 AM</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution más calcio/magnesio</td><td>Fisher Scientific</td><td>10225362</td><td>tampón de imagen</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina polvo liofilizado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td>suplemento para tampón</td></tr><tr><td>de imagen 14-4-4S anticuerpo</td><td>affimetrix eBioscience</td><td>14-5980-81</td><td>anticuerpo bloqueante para H2-I-Ek (reconocido por el 5c.c7, 2B4 y AND TCR)</td></tr><tr><td>5 ml tubo de polipropileno de fondo redondo</td><td>Becton Dickinson</td><td>FALCON 352063</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu; m Unidad de filtro centrífugo Ultrafree-MC</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC30GV0S</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de jeringa 0.2&micro; m</td><td>Millipore</td><td>GVWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas TetraSpeck, 0,1 y micro; m, azul fluorescente/verde/naranja/rojo oscuro</td><td>Life technologies</td><td>T-7279</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio para mediciones de calcio basadas en fura-2&nbsp;</td>Microscopio <td>DMI4000B</td><td></td> <td>LEICA</td></tr><tr><td>para mediciones FRET (de una sola molécula)</td><td>LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS,</td><td>para más detalles, consulte la contribución paralela de JoVE de Axmann et al.</td><td></td></tr><tr>Bicapas <td></td><td>lipídicas planas soportadas</td><td>para obtener más detalles, consulte la contribución paralela de JoVE de Axmann et al.</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640, con L-Glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>11554416</td> medio <td>de células T</td></tr><tr><td>aminoácido no esencial 100X</td><td>Hyclone</td><td>SH30238.01</td><td>Suplemento de medios de células T</td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina/L-glutamina 100x</td><td>Life Technologies</td><td>12000226</td><td>Suplemento de medios de células T</td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td>Suplemento de medios de células T</td></tr><tr><td>interleucina-2 de ratón proteína recombinante</td><td>BPS Bioscience</td><td>90185-B Suplemento de</td><td>medios de células T</td></tr><tr><td>Grado de investigación Suero fetal bovino</td><td>Hyclone</td><td>SV30160.03</td><td>Suplemento de medios de células T</td></tr><tr><td>Origen (programa de análisis)</td><td>OrigenLab</td><td>http://www.originlab.com/</td> <td>ajuste no lineal de dos parámetros (tauoff, [ntlag])</td></tr></tbody></table>

medición de tcr-pmhc encuadernación<em&gt; in situ</em&gt; usando un ensayo de microscopía basada en fret

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

células T son notablemente específicas y efectivas cuando reconocen antígenos en forma de péptidos incrustados en moléculas MHC (pMHC) en la superficie de las células presentadoras de antígenos (APC). Esto es así a pesar de que los receptores de antígenos de células T (TCR) suelen ejercer una afinidad moderada (rango de μM) con el antígeno cuando la unión se mide in vitro1. En vista de los parámetros moleculares y celulares que contribuyen a la sensibilidad del antígeno de las células T, se ha desarrollado una metodología basada en la microscopía como medio para monitorear la unión de TCR-pMHC in situ, tal como ocurre dentro de la sinapsis de una célula T viva y una bicapa lipídica plana (SLB) artificial y funcionalizada soportada en vidrio, que imita la membrana celular de una célula presentadora de antígenos (APC) 2. Las mediciones se basan en la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) entre un tinte fluorescente desplazado hacia el azul y el rojo unido al TCR y al pMHC. Debido a que la eficiencia de FRET es inversamente proporcional a la sexta potencia de la distancia entre colorantes, se pueden emplear señales FRET para visualizar la unión sináptica TCR-pMHC. La sensibilidad del enfoque de microscopía admite la detección de eventos FRET de una sola molécula. Esto permite determinar la afinidad y la tasa de apagado de las interacciones sinápticas TCR-pMHC y, a su vez, interpolar la tasa de activación del enlace. Se podrían aplicar ensayos análogos para medir otras interacciones receptor-ligando en su entorno nativo.

La grabación de calcio intracelular a través del tinte de calcio fura-2, así como el análisis celular subsiguiente para verificar la potencia estimulante y por lo tanto la funcionalidad de SLBS se muestran en la Figura 4. Como se hace evidente, los niveles de calcio se elevan en las células T (expresado como la normalizada relación fura-2 340nm / 380nm con el valor inicial es 1) inmediatamente tan pronto como se instalan en los SLBS estimulantes. Los niveles de calcio regresan a los niveles basales poco después de la adición de un anticuerpo que bloquea pMHCs de compromiso TCR y que termina la activación de células T. La Figura 6 representa un experimento típico que implica la recuperación donante de FRET después del blanqueo aceptor, que se emplea para medir el rendimiento de FRET y que sirve para calcular los valores de 2D-K D (muestra en la Figura 4). Por favor, tenga en cuenta el aumento de la intensidad de los donantes de FRET, lo que representa TCR marcado a través de AF555, después de la ablación rápida y completa de la FRET unespecies cceptor (aquí: AF647 asociado con pMHCs). También es evidente la fuerte reducción en el canal de FRET, es decir, el canal de FRET aceptor de FRET en virtud de excitación del donante, aceptor de FRET después del blanqueo. La señal restante apenas visible corresponde a FRET bleedthrough donante. Rendimientos FRET dentro microclusters TCR individuales o sinapsis enteras se calculan en base a los valores de intensidad medidos indicados (Figura 6B). La figura 7 representa una trayectoria y el tiempo transcurrido de una molécula solo evento FRET visible en dos plazos. Como se ha señalado anteriormente en la introducción tal comportamiento se debe tanto a la decadencia de sináptica TCR-pMHC vinculante y fotoblanqueo. Para discriminar entre estas dos contribuciones, los marcos experimentales tiempo de adquisición tienen que ser variado en duración: mientras photobleaching sigue siendo una constante, los cambios en FRET longitud evento trayectoria solamente son causados ​​por la cinética de unión. Una cuantificación de tracelengths, w<html> hich constituye la base para el cálculo de tarifas y fuera de blanqueo que se muestran en la Figura 7, se proporcionan en las Tablas 1 a 3. Determinación de 2D-K D s requiere la grabación de mayor FRET rendimientos de FRET de donante TCR etiquetados. Con el uso de la constante C experimentalmente deducida (Figura 4), ​​un rendimiento FRET medida para un microcluster TCR o toda una sinapsis se puede convertir en el TCR de ocupación a, es decir, la relación de los TCR pMHC-comprometidos y totales (Figura 4C) . Con densidades pMHC conocidos presentes en el SLB antes de la adición de la célula T, a valores se pueden aplicar para determinar los valores K 2D-D sinápticas (Figura 4D). En-las tasas pueden ser calculadas con la ley de acción de masas (2D-k on = 2D-k off / 2D-K D) del sináptica determinado fuera de ritmo y los valores 2D-KD. 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 53157 / 53157fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Esquema Esquema de la bicapa lipídica sistema compatible de vidrio plano (SLB). SLBS (A) están compuestos de POPC (de 90-99%) y el lípido sintético DGS Ni-NTA (1-10%) y se forman espontáneamente cuando las superficies de vidrio limpias se cargan con pequeñas vesículas unilaminares (SUVs) que consiste en los lípidos correspondientes. (B) Una vez formado, tales SLBS se pueden funcionalizar con porciones solubles marcada con polihistidina extracelulares derivados de pMHCs, coestimuladoras B7-1 proteínas y ICAM-1, proteínas de adhesión para servir como APCs para las células T. Para obtener más información sobre cómo preparar SLBS consulte Axmann et al., 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig2.jpg" /> Figu<html> re 2. Förster de energía de resonancia a base de Transferencia de ensayo para cuantificar la unión TCR-pMHC in situ. (A) Una estructura compuesta de un TCR complejado con un fragmento de una sola cadena H57 acoplar un pMHC ilustra el enfoque basado en FRET descrito en este documento. Tenga en cuenta la corta distancia de unos 41 bis que separa los dos fluoróforos correspondientes sometidos FRET. Sitios aceptores para fluoróforo-maleimidas se indican en verde y rojo. (B) El principio de la detección de interacciones TCR-pMHC in situ se ilustra. Sólo scFv V -decorated TCR y pMHCs (aquí IE k), que forman complejos específicos, dar lugar a una señal FRET medible. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> &quot;/&gt; Figura 3. Los cromatogramas de la última etapa de filtración en gel dando lugar a monoméricas scFv V s y cargadas con péptido IE k -2x6H moléculas. X-ejes representan volumen de retención en ml, ejes Y indican la absorbancia a 280 nm en unidades arbitrarias (AU) . (A) sitio-específica H57 scFv V marcada con Alexa Fluor 555 maleimida se sometió a cromatografía S75 para separar colorante sin reaccionar de la proteína (paso 1.2.5). Las fracciones correspondientes al intervalo de retención 14 to15 ml (líneas de trazos) representan etiquetados monomérica H57 scFv V. (B), es decir k moléculas -2x6H complejados con el ANP-péptido espacio titular de UV-escindible había sido irradiada con UV, se incubaron con forma específica de sitio Alex 647 péptido marcado con maleimida y finalmente se sometió a cromatografía S200 para separar la proteína de péptido libre (etapa 1.1.2.4). El intervalo entre las líneas de trazos contiene correctamente plegada y pMHCs monoméricas. (A, B) </strong&gt; 0,7 ml de la muestra se aplicó a la columna en el inicio de la ron (0 ml punto). Las fracciones recogidas se concentraron. La proporción de proteínas de colorante se determina por photospectrometry antes de la diálisis contra PBS / glicerol al 50% (para el almacenamiento a -20 °). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig4.jpg" /> Figura 4. Determinación de 2D-K D s y 2D-k en s. (A) La correlación entre el rendimiento FRET según lo determinado por la recuperación de donante después se midió la decoloración aceptor y la ocupación TCR experimentalmente. Ocupación TCR se puede determinar para microclusters individuales TCR como se explica en la sección 4.2. Un ajuste lineal de los datos se muestran por la línea, la pendiente de la cual es igual a la relación entre C TCRocupación y el rendimiento FRET. C es una constante específica para el sistema de FRET y los fluoróforos (aquí Cy3 y Cy5) empleados. En este ejemplo se produjo 1,988. (B) FRET datos de rendimiento se determinaron para microclusters TCR individuales (N = 187, temperatura = 24 ° C) a través de la recuperación de los donantes de la decoloración de aceptor. Números debajo de las barras de histograma indican el límite superior dentro del intervalo. (C) La conversión de los datos mostrados en (B) multiplicando medido FRET rendimientos con la constante C determina en (A). Números siguientes barras indican el límite superior dentro del intervalo. (D) Histograma (semi-logarítmica, base = 4) que representa la distribución de 2D-K D s medido para microclusters TCR individuales. La mediana de 2D-K D se indica en azul. Números siguientes barras indican el límite superior dentro del intervalo. (E) El histograma se muestra en (D) se convierten intoa 2D-k en -histogram (semi-logarítmica, base = 4) que utiliza el k sináptica fuera de 24 ° C (0.41 s -1). La mediana de 2D-k determinado en el valor se indica en azul. Los datos fueron publicados originalmente en Huppa et al. 2 y se visualizan aquí en un nuevo formato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig4large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig5.jpg" /> Figura 5. validación funcional de SLBS emplea para la estimulación de células T y formación de imágenes. (A) TCR transgénicos blastos de células T cargadas con fura-2 se enfrentaron con estimuladora SLB albergar pMHCs antigénicos, ICAM-1 y B-7. Celular fura-2 emisiones entusiasmado a 340 nm y 380 nm, así como imágenes DIC se registraron. Como se ha indicado, valores de la relación de las intensidades de emisión emocionada en el 340 y 380 nm se muestran en el panel derecho. La adición de pMHC anticuerpos de bloqueo 14 min en el plazo experimental resultó en una disminución en los niveles de calcio intracelulares comparables a la de T en reposo células. (B) Un perfil temporal típico de relaciones medias Fura-2 en las células T en contacto SLBS estimuladoras se caracteriza por un aumento inicial de un calcio intracelular que es de 2 a 4 veces mayor en comparación a la de las células T no activadas o células T privadas de antígeno después del bloqueo mediado por anticuerpos. Círculos verdes indican los puntos de tiempo se ilustra en (A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig6.jpg" /> Figura 6. granel FRET rendimientos, medida a través de la recuperación del donante FRET después del blanqueo FRET aceptora. <strong&gt; (A) mostrado es un ejemplo de un típico FRET-sináptica de medición. Como se indica en la izquierda y en la parte superior una serie de imágenes fue adquirida con el uso de un divisor de haz de emisión que da lugar a un donante de FRET y un canal aceptor FRET (para información más detallada sobre los divisores de haz se refieren a Axmann et al 4). La línea se muestra en la imagen DIC izquierda indica el límite de la sinapsis de células T. Tenga en cuenta la pérdida de intensidad dentro del canal aceptor de FRET, así es el aumento de la intensidad en el canal de donante de FRET después de FRET aceptor de blanqueo (paso 4). (B) FRET eficiencias pueden ser cuantificados como se indica para las regiones sinápticas individuales o para sinapsis enteras. Para la inspección, las imágenes antes y después de FRET aceptora blanqueo se muestran con el uso de dos tablas de búsqueda (LUT, verde y física). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig6large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> </p&gt; <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig7.jpg" /> Figura 7. molécula individual FRET eventos aparecen y desaparecen pasos insingle y están perfectamente alineados con un solo fluoróforo aceptor FRET. Se muestra el lapso de tiempo de la molécula solo evento FRET. Las imágenes fueron adquiridas mediante una cámara EMCCD retroiluminado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig7large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig8.jpg" /> Figura 8. La determinación de τ off = 1 / k fuera de trayectorias smFRET medidos. (A) Los normalizados sumas acumuladas de las señales FRET observables (derivados de H57 scFv V -AF555 decoradas 5c.c7 TCR transgénico de blastos de células T que reconoce IE &lt;sup&gt; k / K3-AF647 a 24 ° C) durante cuatro retardos diferentes de tiempo (42 ms, 490 ms, 1007 ms, 1.989 mseg) se representa como una función del número total de observaciones. Funciones de ajuste mono-exponencial dan lugar a que corresponde el inverso negativo de los valores esperados &lt;n (t lag)&gt;. (B) Expectativa valores se representaron frente retrasos t lag y equipados con la ecuación &lt;n (t lag)&gt; = τ off / {(t off / &lt;n blanquear&gt;) + t lag} para dar τ y fuera &lt;n blanquear&gt;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este manuscrito describe cómo realizar ensayos basados en la Transferencia de Energía por Resonancia de Förster (FRET) (molécula única) para medir la dinámica de unión entre el receptor de antígeno de células T (TCR) y las moléculas MHC cargadas de péptidos antigénicos a medida que ocurren dentro de la sinapsis inmunológica de una célula T en contacto con una bicapa lipídica plana funcionalizada con soporte.

Medición de TCR-pMHC Encuadernación<em&gt; In Situ</em&gt; Usando un ensayo de microscopía basada en FRET

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

En este video, mostraremos cómo medir la cinética entre el receptor de antígeno de células T y el complejo mayor de histocompatibilidad cargado con péptido, o PMHC, en C dos, que se encuentra dentro de la sinapsis inmunológica entre una célula T y una bicapa lipídica planar soportada. Guiaremos brevemente a través de aspectos importantes de la producción de proteínas y la verificación de la integridad funcional de la bicapa lipídica mediante mediciones de flujo de calcio. Para obtener información más detallada sobre cómo preparar la bicapa lipídica y cómo configurar un microscopio de fluorescencia de molécula individual, consulte nuestra contribución paralela en el Journal of Visualized Experiments. Luego, explicaremos en detalle cómo realizar y analizar mediciones de transferencia de resonancia de energía de Förster en conjunto y a nivel de molécula individual.Para deducir la cinética de la unión del receptor de células T sináptico al PMHC y explicar nuestra estrategia basada en FRET utilizada en nuestro enfoque general, comenzamos con la estructura cristalina del receptor de células T, o TCR, mostrado aquí en azul, mientras se une a su antígeno, la molécula de MHC cargada con péptido o PMHC, mostrada en amarillo y rojo. También introducimos un fragmento de cadena sencilla de los dominios variables de un anticuerpo reactivo al beta del receptor de células T denominado age 57. Para mediciones cuantitativas basadas en FRET, es obligatorio marcar tanto al donador de FRET, en nuestro caso el fragmento de cadena sencilla, como al receptor de FRET, el PMHC, de manera específica en sitios definidos.Esto es factible para proteínas recombinantes mediante la introducción de una cisteína no apareada, la cual puede unirse luego covalentemente al fluoróforo conjugado con mala. Como se muestra, acoplamos el donador marcado Alexa Fluor 555 o Side Three al fragmento de cadena simple y al aceptor FRET. Alexa Fluor 647 o SI Five al extremo C del péptido unido al MHC.La distancia Indy, tal como se muestra en esta estructura compuesta, es de aproximadamente 41 angstrom, incluso menor que el primer radio, la distancia de transferencia de energía máxima a la mitad entre los dos colorantes. En nuestros experimentos, empleamos una bicapa lipídica soportada sobre vidrio plano como células presentadoras de antígenos simuladas. Estas están funcionalizadas con PMXC, la molécula de reconocimiento B siete uno y la molécula de adhesión I chim uno.De este modo, se puede realizar la imagen en modo de fluorescencia por reflexión interna total, que ilumina la fuerza fluorófora en proximidad cercana a la interfaz, reduciendo así sustancialmente el fondo celular. La transferencia de resonancia de energía por fluorescencia (FRET) solo es detectable cuando los fragmentos monocatenarios marcados de TCR se unen a las HC de membrana plasmática embebidas en capa. Esto nos permite visualizar la unión TCR-PM-HC y luego calcular la cinética de unión en el complejo de histocompatibilidad de clase II correctamente plegado.Las porciones extracelulares de P seven one y I chem one se purifican a partir de sobrenadantes de cultivos de células de insectos infectadas con el virus BUC correspondiente. La purificación se realiza en tres pasos, comenzando con cromatografía de afinidad por níquel anti aros, seguida de intercambio iónico y cromatografía de exclusión por tamaño. Los heterodímeros de MHC Clase dos con marcaje Histo se expresan en e coli como cuerpos de inclusión y se renaturan in vitro a cuatro grados Celsius y en presencia de un péptido espaciador mediante dilución rápida en tampón redox.El péptido espaciador será escindido posteriormente mediante exposición a luz UV. Los complejos PMHC correctamente plegados, además de ser purificados y concentrados, contienen el espaciador. El péptido es escindido y sustituido a pH 5,2 por el péptido fluorescente.El producto final se purifica según el tamaño. El fragmento de cadena simple se expresa con una cisteína no emparejada como cuerpos de inclusión en E. coli, se renatura in vitro mediante diálisis escalonada y se purifica según el tamaño. Luego, se marca a través de su cisteína no emparejada con un colorante conjugado a maleimida y se vuelve a purificar según el tamaño.Todas las proteínas recombinantes se dializan finalmente frente a PBS que contiene glicerol al 50%, concentrado hasta un miligramo de proteína por mililitro, y se almacenan a largo plazo a menos 20 grados Celsius. Utilice el colorante URA dos con relación métrica para medir los niveles intracelulares de calcio en células T como medio para verificar la potencia estimulante del liposoma. Incube los linfocitos T activados con el éster de URA 2:00 AM.Este compuesto entra en las células mediante su grupo AM, pero luego queda atrapado en el interior por la acción de las esterasas, que eliminan la parte AM. Añada fura 2:00 AM a aproximadamente 3 millones de linfocitos T a una concentración final de cinco micromoles por litro. Transfiera las células desde la placa de 24 pocillos a un nuevo tubo e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.Lave las células una vez con tampón de imagen que contenga solución salina tamponada con Hank, incluyendo calcio y magnesio, y 1% de albúmina. Para monitorear el calcio intracelular, utilice un sistema automatizado de microscopio invertido con capacidad UV. Inicie el protocolo de temporización y agregue menos de dos linfocitos T cargados a la bicapa lipídica funcionalizada colocada en foco sobre la platina del microscopio; adquiera, a intervalos de tiempo regulares, una imagen de contraste de interferencia diferencial (DIC) y dos imágenes fluorescentes excitadas con luz UV de 340 y 380 nanómetros.Inmediatamente después de establecer el contacto con la bicapa, los linfocitos T adoptan niveles elevados de calcio, tal como se observa mediante la relación URA dos, 15 minutos después de iniciado el experimento. Añada un anticuerpo bloqueante a las células que sature todos los antígenos PMHC. Como consecuencia, los niveles intracelulares de calcio disminuyen hasta alcanzar los valores del estado no activado, los cuales servirán posteriormente como referencia.En cuanto los niveles del anticuerpo bloqueante disminuyan a un valor que refleje el estado no activado, que normalizamos a uno para las mediciones de fret, las células T deben ser marcadas con una sonda de fragmento de cadena simple reactiva al TCR para cada experimento, transfiera aproximadamente un millón de células a un tubo y centrifúgelas a 400 ×g. Decante el medio y elimine las gotas residuales de medio. Seque las gotas adheridas a las paredes internas con una toalla de papel. Esto asegura un volumen de incubación mínimo de aproximadamente 30 microlitros, como mencioné anteriormente.El reactivo FRET se almacena a una concentración de un miligramo por mililitro y al 50 % de glicerol a menos 20 grados Celsius. Se marca de forma específica en el sitio con Alexa, fluoro 5, 5, 5 o tres, a una relación proteína:reactivo de uno a 0,3 microlitros del reactivo por células. Agite suavemente el precipitado varias veces e incube las células durante 20 minutos en hielo.Lave las células con tampón de imagen frío. Repita este procedimiento de lavado una vez. La incubación, la centrifugación y el almacenamiento a baja temperatura aseguran que los linfocitos T no internalicen la sonda fluorescente mientras están expuestos a ella.Esto provocaría una fluorescencia de fondo elevada. Además, los linfocitos T no pierden la sonda en frío durante el lavado y almacenamiento antes de colocar la cámara con bicapa sobre el intercambiador del portaobjetos del microscopio. Reemplace sucesivamente el PBS con tampón de imagenado, evitando a toda costa la exposición de la bicapa al aire, ya que esto la destruiría.Para reducir el fondo celular, empleamos la iluminación por campo oscuro. Para ello, posicionamos el haz de excitación en un ángulo crítico en el que ocurre reflexión interna total. Apague la excitación, encienda la luz amplia y agregue el linfocito T a la cámara ltec y déjelos asentarse sobre la bicapa lipídica.Encienda la excitación y enfoque una iluminación no de césped. La membrana celular se observa como un anillo a lo largo del eje óptico en cada plano focal; en el césped, solo la membrana basal en contacto con la bicapa es observable. Los planos focales superiores ya no están excitados y, por lo tanto, no son visibles.El protocolo de temporización comienza con los pulsos de excitación rojo y verde para la obtención de imágenes de PMHC y TCR, seguido de un pulso de blanqueo rojo para eliminar el aceptor P-M-H-C-F. Un pulso verde para obtener imágenes del TCR después del blanqueo del aceptor F fat, y un pulso rojo para verificar la ablación del aceptor F; estos experimentos se realizan a escala de subsegundo con el menor retraso posible entre el primer y el segundo pulso verde. Opcionalmente, se puede obtener una imagen DIC al principio; la separación de imágenes de dos colores permite la detección simultánea del canal del donador alimentado y del aceptor alimentado.La excitación del receptor alimentado muestra la acumulación de pMHC en la sinapsis de células T. Esta imagen previa a la fotobleaching verifica la presencia de pMHC e indica un enlazamiento ya mediado por el TCR. Excitante. El donador alimentado da lugar a imágenes en ambos canales.La señal del canal donador alimentado se reduce en cierta medida en intensidad debido a la transferencia de energía hacia el canal aceptor F. La señal del canal aceptor de FRET está compuesta por el paso parásito de FRET del donador alimentado y la excitación cruzada del aceptor de FRET. De todos modos, esta imagen no se utilizará para el análisis.En el protocolo actual, se realiza una acumulación rápida de blanqueo que sigue y elimina toda la fluorescencia aceptada del donador F. La intensidad de la imagen del donador F después del blanqueo aceptable de FRET se recupera ahora a niveles más altos sin pérdida de intensidad en el canal FRET.La siguiente verificación de aceptador FRET confirma la fotodegradación completa del aceptador de grasa F. Acerquémonos a la sinapsis para cuantificar la recuperación del donador alimentado. Determine la intensidad promedio del fondo, una constante independientemente del aceptador FRET.Fotoblanqueamiento, a continuación, determine la intensidad promedio del sincitio y la de un cúmulo representativo de TCR. Luego, el rendimiento de FRET se calcula normalizando la diferencia antes y después de la ablación del aceptor F. En nuestro ejemplo, medimos un 16 %FRET para todo el sincitio y un 26 %FRET para el representativo.Los rendimientos de FRET de los grupos de TCR se convertirán posteriormente en ocupaciones de TCR, que permiten obtener datos unimoleculares bidimensionales de la constante de disociación sináptica. Nos sirven para deducir la cinética de la unión sináptica de TCR al péptido-MHC en experimentos unimoleculares de FRET. Utilizamos los mismos reactivos y estrategia de trabajo que antes.Sin embargo, para asegurarnos de que realmente observamos la interacción entre un único TCR y un único péptido MHC, elegimos cumplir el siguiente criterio. Un evento candidato de una molécula individual de fre debe coincidir coloquialmente con la molécula aceptora de fre individual o con la molécula donadora de fre. Aquí empleamos un único PMHC como molécula aceptora de fre para verificar la naturaleza de molécula individual del evento de fre observado, pero con la lógica opuesta.Utilizar aceptores alimentados en botones superiores y donadores Fred en botones bajos es sin duda una opción. Normalmente exponemos linfocitos T que contactan con una capa lipídica estimulante mediante excitación a 514 y 647 nanómetros; se sigue una excitación secuencial y repetitiva del donador y del aceptor con un retraso mínimo de un milisegundo, seguido por un tiempo de demora que puede variarse según los requisitos del experimento.Para obtener una señal fluorescente lo suficientemente fuerte para la detección individual de partículas dentro de milisegundos tras la excitación, necesitamos aplicar densidades de potencia de excitación elevadas, que oscilan entre uno y cinco kilovatios por centímetro cuadrado. Debido al fotodesvanecimiento, el número de moléculas aceptoras de PMHC marcadas con FRET visibles disminuye rápidamente hasta un nivel en el que las fuerzas fluorescentes individuales del aceptor FRET se vuelven distinguibles en una bicapa que contiene 30 o más PMHC marcados por micrómetro cuadrado. Aquí se muestra un ejemplo para un retraso temporal total de 42 milisegundos.Un único evento de FRET marcado con el círculo rojo se vuelve visible en el segundo y tercer punto temporal. Co-localiza con una única molécula de S cinco marcada con un círculo verde. En este ejemplo, el evento de FRET observable tiene una duración de trazo de dos; recolecte más trazos de FRET de una sola molécula como se muestra en la tabla en algunos 128 trazos.A continuación, calcule la suma acumulativa complementaria de las trazas como se muestra mediante los números verdes y normalícelas como se indica; represente gráficamente los valores normalizados y ajústelos con una función exponencial monoexponencial. El valor esperado es un poco más de 1,5 intervalos de tiempo. Este valor depende del péptido TCR, la unión al MHC y el apagamiento fotoinducido; para poder discriminar entre estas dos contribuciones, el valor esperado debe calcularse para al menos tres tiempos diferentes.Los retardos ahora representan todos los valores esperados frente a sus respectivos tiempos de retardo y ajustan los puntos de datos a la función mostrada que contiene aquí el tiempo de vida. 2.12 segundos y el valor esperado para FOTOBLEACHING f Fred. La recuperación del donador tras el blanqueo aceptable de f Fred, como se muestra aquí y con mayor detalle anteriormente, puede utilizarse para determinar en solo unos pocos pasos las constantes de disociación bidimensionales según su eficacia dentro de la sinapsis inmunológica.Aquí centramos nuestro análisis en la interacción del TCR y en los grupos de TCR donde la unión T-C-R-P-M-H-C es más prominente. Como queda evidente a partir de las mediciones mostradas, los valores de F FRED varían considerablemente para grupos individuales de TCR.La multiplicación del valor F fred por el factor de proporcionalidad C da como resultado la ocupación del TCR, un término que describe la proporción entre el número de TCR unidos a pMHC y su número total. C debe determinarse una vez para un conjunto específico de pares fre y para el sistema FRE empleado. Hacia el final de esta presentación, explicaremos con mayor detalle cómo determinar C, por ejemplo, lo cual implica el uso específico de SI tres y SI cinco colocados en el fragmento de anticuerpo monocatenario reactivo al TCR y en el extremo C del péptido unido al MHC. Esto equivale aproximadamente a dos constantes de disociación sinápticas en dos dimensiones, que pueden calcularse a partir de la ocupación del TCR denominada A y de la densidad inicial de pMHC presente en el bicapa lipídica.La relación mostrada se deriva de la ley de acción de masas y se explica con mayor detalle en el artículo que acompaña a esta película. En nuestro ejemplo, la densidad inicial de pmcs asciende a 30 moléculas por micrón cuadrado. Llegamos a una distribución de kds 2D, que son efectivas en la sinapsis de células T con un valor mediano de aproximadamente 34 moléculas por micrón cuadrado.La distribución de la constante de asociación puede calcularse a partir de la distribución de KD 2D sináptica y la correspondiente constante de disociación aquí, 0,41 por segundo, determinada mediante análisis de trazas de FRET de molécula individual a 24 grados Celsius. El valor mediano es de aproximadamente 0,01 micrómetros cuadrados por molécula por segundo. En resumen, las mediciones de FRET entre el TCR y el péptido CMH permiten un análisis completo de todos los parámetros cinéticos que describen la dinámica de la reacción en C dos.Esta metodología puede, en principio, generalizarse al análisis de otras interacciones entre receptores y ligandos, ya que podrían ser fundamentales para el reconocimiento entre células. Por último, discutimos cómo derivar experimentalmente la constante C, que se requiere para convertir los rendimientos de grasa en ocupaciones del TCR. Este procedimiento solo necesita realizarse una vez.La constante determinada C puede entonces emplearse en todos los experimentos posteriores en los que se utilice el mismo sistema de transferencia de resonancia de energía de tipo fret con los mismos fluoróforos. En este procedimiento, esencialmente relacionamos los rendimientos de transferencia de resonancia de energía de tipo fret medidos en agrupamientos individuales de TCR, mediante la recuperación del donador tras el blanqueo fotoquímico del aceptor, con los valores de intensidad correspondientes detectados en el canal de transferencia sensibilizada. Como se discutió anteriormente, el rendimiento de transferencia se determina a partir de las imágenes del canal del donador de transferencia corregidas por fondo, antes y después de la ablación del aceptor de transferencia.El canal FRET sensibilizado debe alinearse con el canal donador F y con X e Y, y corregirse para el fondo. Aquí se muestra la fuga del donador Fred y la excitación cruzada del aceptor Fred. En el artículo se proporciona una descripción detallada de cómo corregir la fuga del donador Fred y la excitación cruzada del aceptor Fred.Acompañando este video, calcule ahora para cada agrupamiento de TCR la relación entre la señal del marcador de la imagen FRET corregida y la imagen correspondiente del donador FRET corregida. Determine la señal promedio corregida para donadores FRET individuales y para eventos FRET de molécula individual, y calcule la relación. La ocupación de TCR se deriva entonces multiplicando ambas relaciones.Ahora, represente gráficamente los rendimientos de FRET determinados para cada grupo individual de TCR frente a sus ocupaciones de TCR. A continuación, C se determina mediante regresión lineal, como se muestra aquí. En nuestro ejemplo, asciende aproximadamente a dos.Después de ver este video, debería ser capaz de utilizar una bicapa lipídica funcionalizada con proteínas en combinación con microscopía de fluorescencia de molécula individual para medir la cinética de unión sináptica entre PMHC y TCR. Se discutieron todos los pasos necesarios, incluyendo la producción de proteínas, la marcación de linfocitos T y las mediciones finales de FRET. Además, se mostró en detalle el análisis de imágenes, que permite obtener curvas de activación de linfocitos T y valores de FRET.Finalmente, se ha mostrado la metodología subyacente para la determinación de las tasas cinéticas de asociación y disociación. En principio, se puede utilizar un enfoque análogo para determinar otras interacciones entre receptores sinápticos y ligandos, aunque podrían ser necesarias modificaciones adecuadas.

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