Medición de TCR-pMHC Encuadernación

En este video, mostraremos cómo medir la cinética entre el receptor de antígeno de células T y el complejo mayor de histocompatibilidad cargado con péptido, o PMHC, en C dos, que se encuentra dentro de la sinapsis inmunológica entre una célula T y una bicapa lipídica planar soportada. Guiaremos brevemente a través de aspectos importantes de la producción de proteínas y la verificación de la integridad funcional de la bicapa lipídica mediante mediciones de flujo de calcio. Para obtener información más detallada sobre cómo preparar la bicapa lipídica y cómo configurar un microscopio de fluorescencia de molécula individual, consulte nuestra contribución paralela en el Journal of Visualized Experiments. Luego, explicaremos en detalle cómo realizar y analizar mediciones de transferencia de resonancia de energía de Förster en conjunto y a nivel de molécula individual.

Para deducir la cinética de la unión del receptor de células T sináptico al PMHC y explicar nuestra estrategia basada en FRET utilizada en nuestro enfoque general, comenzamos con la estructura cristalina del receptor de células T, o TCR, mostrado aquí en azul, mientras se une a su antígeno, la molécula de MHC cargada con péptido o PMHC, mostrada en amarillo y rojo. También introducimos un fragmento de cadena sencilla de los dominios variables de un anticuerpo reactivo al beta del receptor de células T denominado age 57. Para mediciones cuantitativas basadas en FRET, es obligatorio marcar tanto al donador de FRET, en nuestro caso el fragmento de cadena sencilla, como al receptor de FRET, el PMHC, de manera específica en sitios definidos.

Esto es factible para proteínas recombinantes mediante la introducción de una cisteína no apareada, la cual puede unirse luego covalentemente al fluoróforo conjugado con mala. Como se muestra, acoplamos el donador marcado Alexa Fluor 555 o Side Three al fragmento de cadena simple y al aceptor FRET. Alexa Fluor 647 o SI Five al extremo C del péptido unido al MHC.

La distancia Indy, tal como se muestra en esta estructura compuesta, es de aproximadamente 41 angstrom, incluso menor que el primer radio, la distancia de transferencia de energía máxima a la mitad entre los dos colorantes. En nuestros experimentos, empleamos una bicapa lipídica soportada sobre vidrio plano como células presentadoras de antígenos simuladas. Estas están funcionalizadas con PMXC, la molécula de reconocimiento B siete uno y la molécula de adhesión I chim uno.

De este modo, se puede realizar la imagen en modo de fluorescencia por reflexión interna total, que ilumina la fuerza fluorófora en proximidad cercana a la interfaz, reduciendo así sustancialmente el fondo celular. La transferencia de resonancia de energía por fluorescencia (FRET) solo es detectable cuando los fragmentos monocatenarios marcados de TCR se unen a las HC de membrana plasmática embebidas en capa. Esto nos permite visualizar la unión TCR-PM-HC y luego calcular la cinética de unión en el complejo de histocompatibilidad de clase II correctamente plegado.

Las porciones extracelulares de P seven one y I chem one se purifican a partir de sobrenadantes de cultivos de células de insectos infectadas con el virus BUC correspondiente. La purificación se realiza en tres pasos, comenzando con cromatografía de afinidad por níquel anti aros, seguida de intercambio iónico y cromatografía de exclusión por tamaño. Los heterodímeros de MHC Clase dos con marcaje Histo se expresan en e coli como cuerpos de inclusión y se renaturan in vitro a cuatro grados Celsius y en presencia de un péptido espaciador mediante dilución rápida en tampón redox.

El péptido espaciador será escindido posteriormente mediante exposición a luz UV. Los complejos PMHC correctamente plegados, además de ser purificados y concentrados, contienen el espaciador. El péptido es escindido y sustituido a pH 5,2 por el péptido fluorescente.

El producto final se purifica según el tamaño. El fragmento de cadena simple se expresa con una cisteína no emparejada como cuerpos de inclusión en E. coli, se renatura in vitro mediante diálisis escalonada y se purifica según el tamaño. Luego, se marca a través de su cisteína no emparejada con un colorante conjugado a maleimida y se vuelve a purificar según el tamaño.

Todas las proteínas recombinantes se dializan finalmente frente a PBS que contiene glicerol al 50%, concentrado hasta un miligramo de proteína por mililitro, y se almacenan a largo plazo a menos 20 grados Celsius. Utilice el colorante URA dos con relación métrica para medir los niveles intracelulares de calcio en células T como medio para verificar la potencia estimulante del liposoma. Incube los linfocitos T activados con el éster de URA 2:00 AM.

Este compuesto entra en las células mediante su grupo AM, pero luego queda atrapado en el interior por la acción de las esterasas, que eliminan la parte AM. Añada fura 2:00 AM a aproximadamente 3 millones de linfocitos T a una concentración final de cinco micromoles por litro. Transfiera las células desde la placa de 24 pocillos a un nuevo tubo e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Lave las células una vez con tampón de imagen que contenga solución salina tamponada con Hank, incluyendo calcio y magnesio, y 1% de albúmina. Para monitorear el calcio intracelular, utilice un sistema automatizado de microscopio invertido con capacidad UV. Inicie el protocolo de temporización y agregue menos de dos linfocitos T cargados a la bicapa lipídica funcionalizada colocada en foco sobre la platina del microscopio; adquiera, a intervalos de tiempo regulares, una imagen de contraste de interferencia diferencial (DIC) y dos imágenes fluorescentes excitadas con luz UV de 340 y 380 nanómetros.

Inmediatamente después de establecer el contacto con la bicapa, los linfocitos T adoptan niveles elevados de calcio, tal como se observa mediante la relación URA dos, 15 minutos después de iniciado el experimento. Añada un anticuerpo bloqueante a las células que sature todos los antígenos PMHC. Como consecuencia, los niveles intracelulares de calcio disminuyen hasta alcanzar los valores del estado no activado, los cuales servirán posteriormente como referencia.

En cuanto los niveles del anticuerpo bloqueante disminuyan a un valor que refleje el estado no activado, que normalizamos a uno para las mediciones de fret, las células T deben ser marcadas con una sonda de fragmento de cadena simple reactiva al TCR para cada experimento, transfiera aproximadamente un millón de células a un tubo y centrifúgelas a 400 ×g. Decante el medio y elimine las gotas residuales de medio. Seque las gotas adheridas a las paredes internas con una toalla de papel. Esto asegura un volumen de incubación mínimo de aproximadamente 30 microlitros, como mencioné anteriormente.

El reactivo FRET se almacena a una concentración de un miligramo por mililitro y al 50 % de glicerol a menos 20 grados Celsius. Se marca de forma específica en el sitio con Alexa, fluoro 5, 5, 5 o tres, a una relación proteína:reactivo de uno a 0,3 microlitros del reactivo por células. Agite suavemente el precipitado varias veces e incube las células durante 20 minutos en hielo.

Lave las células con tampón de imagen frío. Repita este procedimiento de lavado una vez. La incubación, la centrifugación y el almacenamiento a baja temperatura aseguran que los linfocitos T no internalicen la sonda fluorescente mientras están expuestos a ella.

Esto provocaría una fluorescencia de fondo elevada. Además, los linfocitos T no pierden la sonda en frío durante el lavado y almacenamiento antes de colocar la cámara con bicapa sobre el intercambiador del portaobjetos del microscopio. Reemplace sucesivamente el PBS con tampón de imagenado, evitando a toda costa la exposición de la bicapa al aire, ya que esto la destruiría.

Para reducir el fondo celular, empleamos la iluminación por campo oscuro. Para ello, posicionamos el haz de excitación en un ángulo crítico en el que ocurre reflexión interna total. Apague la excitación, encienda la luz amplia y agregue el linfocito T a la cámara ltec y déjelos asentarse sobre la bicapa lipídica.

Encienda la excitación y enfoque una iluminación no de césped. La membrana celular se observa como un anillo a lo largo del eje óptico en cada plano focal; en el césped, solo la membrana basal en contacto con la bicapa es observable. Los planos focales superiores ya no están excitados y, por lo tanto, no son visibles.

El protocolo de temporización comienza con los pulsos de excitación rojo y verde para la obtención de imágenes de PMHC y TCR, seguido de un pulso de blanqueo rojo para eliminar el aceptor P-M-H-C-F. Un pulso verde para obtener imágenes del TCR después del blanqueo del aceptor F fat, y un pulso rojo para verificar la ablación del aceptor F; estos experimentos se realizan a escala de subsegundo con el menor retraso posible entre el primer y el segundo pulso verde. Opcionalmente, se puede obtener una imagen DIC al principio; la separación de imágenes de dos colores permite la detección simultánea del canal del donador alimentado y del aceptor alimentado.

La excitación del receptor alimentado muestra la acumulación de pMHC en la sinapsis de células T. Esta imagen previa a la fotobleaching verifica la presencia de pMHC e indica un enlazamiento ya mediado por el TCR. Excitante. El donador alimentado da lugar a imágenes en ambos canales.

La señal del canal donador alimentado se reduce en cierta medida en intensidad debido a la transferencia de energía hacia el canal aceptor F. La señal del canal aceptor de FRET está compuesta por el paso parásito de FRET del donador alimentado y la excitación cruzada del aceptor de FRET. De todos modos, esta imagen no se utilizará para el análisis.

En el protocolo actual, se realiza una acumulación rápida de blanqueo que sigue y elimina toda la fluorescencia aceptada del donador F. La intensidad de la imagen del donador F después del blanqueo aceptable de FRET se recupera ahora a niveles más altos sin pérdida de intensidad en el canal FRET.

La siguiente verificación de aceptador FRET confirma la fotodegradación completa del aceptador de grasa F. Acerquémonos a la sinapsis para cuantificar la recuperación del donador alimentado. Determine la intensidad promedio del fondo, una constante independientemente del aceptador FRET.

Fotoblanqueamiento, a continuación, determine la intensidad promedio del sincitio y la de un cúmulo representativo de TCR. Luego, el rendimiento de FRET se calcula normalizando la diferencia antes y después de la ablación del aceptor F. En nuestro ejemplo, medimos un 16 %FRET para todo el sincitio y un 26 %FRET para el representativo.

Los rendimientos de FRET de los grupos de TCR se convertirán posteriormente en ocupaciones de TCR, que permiten obtener datos unimoleculares bidimensionales de la constante de disociación sináptica. Nos sirven para deducir la cinética de la unión sináptica de TCR al péptido-MHC en experimentos unimoleculares de FRET. Utilizamos los mismos reactivos y estrategia de trabajo que antes.

Sin embargo, para asegurarnos de que realmente observamos la interacción entre un único TCR y un único péptido MHC, elegimos cumplir el siguiente criterio. Un evento candidato de una molécula individual de fre debe coincidir coloquialmente con la molécula aceptora de fre individual o con la molécula donadora de fre. Aquí empleamos un único PMHC como molécula aceptora de fre para verificar la naturaleza de molécula individual del evento de fre observado, pero con la lógica opuesta.

Utilizar aceptores alimentados en botones superiores y donadores Fred en botones bajos es sin duda una opción. Normalmente exponemos linfocitos T que contactan con una capa lipídica estimulante mediante excitación a 514 y 647 nanómetros; se sigue una excitación secuencial y repetitiva del donador y del aceptor con un retraso mínimo de un milisegundo, seguido por un tiempo de demora que puede variarse según los requisitos del experimento.

Para obtener una señal fluorescente lo suficientemente fuerte para la detección individual de partículas dentro de milisegundos tras la excitación, necesitamos aplicar densidades de potencia de excitación elevadas, que oscilan entre uno y cinco kilovatios por centímetro cuadrado. Debido al fotodesvanecimiento, el número de moléculas aceptoras de PMHC marcadas con FRET visibles disminuye rápidamente hasta un nivel en el que las fuerzas fluorescentes individuales del aceptor FRET se vuelven distinguibles en una bicapa que contiene 30 o más PMHC marcados por micrómetro cuadrado. Aquí se muestra un ejemplo para un retraso temporal total de 42 milisegundos.

Un único evento de FRET marcado con el círculo rojo se vuelve visible en el segundo y tercer punto temporal. Co-localiza con una única molécula de S cinco marcada con un círculo verde. En este ejemplo, el evento de FRET observable tiene una duración de trazo de dos; recolecte más trazos de FRET de una sola molécula como se muestra en la tabla en algunos 128 trazos.

A continuación, calcule la suma acumulativa complementaria de las trazas como se muestra mediante los números verdes y normalícelas como se indica; represente gráficamente los valores normalizados y ajústelos con una función exponencial monoexponencial. El valor esperado es un poco más de 1,5 intervalos de tiempo. Este valor depende del péptido TCR, la unión al MHC y el apagamiento fotoinducido; para poder discriminar entre estas dos contribuciones, el valor esperado debe calcularse para al menos tres tiempos diferentes.

Los retardos ahora representan todos los valores esperados frente a sus respectivos tiempos de retardo y ajustan los puntos de datos a la función mostrada que contiene aquí el tiempo de vida. 2.12 segundos y el valor esperado para FOTOBLEACHING f Fred. La recuperación del donador tras el blanqueo aceptable de f Fred, como se muestra aquí y con mayor detalle anteriormente, puede utilizarse para determinar en solo unos pocos pasos las constantes de disociación bidimensionales según su eficacia dentro de la sinapsis inmunológica.

Aquí centramos nuestro análisis en la interacción del TCR y en los grupos de TCR donde la unión T-C-R-P-M-H-C es más prominente. Como queda evidente a partir de las mediciones mostradas, los valores de F FRED varían considerablemente para grupos individuales de TCR.

La multiplicación del valor F fred por el factor de proporcionalidad C da como resultado la ocupación del TCR, un término que describe la proporción entre el número de TCR unidos a pMHC y su número total. C debe determinarse una vez para un conjunto específico de pares fre y para el sistema FRE empleado. Hacia el final de esta presentación, explicaremos con mayor detalle cómo determinar C, por ejemplo, lo cual implica el uso específico de SI tres y SI cinco colocados en el fragmento de anticuerpo monocatenario reactivo al TCR y en el extremo C del péptido unido al MHC. Esto equivale aproximadamente a dos constantes de disociación sinápticas en dos dimensiones, que pueden calcularse a partir de la ocupación del TCR denominada A y de la densidad inicial de pMHC presente en el bicapa lipídica.

La relación mostrada se deriva de la ley de acción de masas y se explica con mayor detalle en el artículo que acompaña a esta película. En nuestro ejemplo, la densidad inicial de pmcs asciende a 30 moléculas por micrón cuadrado. Llegamos a una distribución de kds 2D, que son efectivas en la sinapsis de células T con un valor mediano de aproximadamente 34 moléculas por micrón cuadrado.

La distribución de la constante de asociación puede calcularse a partir de la distribución de KD 2D sináptica y la correspondiente constante de disociación aquí, 0,41 por segundo, determinada mediante análisis de trazas de FRET de molécula individual a 24 grados Celsius. El valor mediano es de aproximadamente 0,01 micrómetros cuadrados por molécula por segundo. En resumen, las mediciones de FRET entre el TCR y el péptido CMH permiten un análisis completo de todos los parámetros cinéticos que describen la dinámica de la reacción en C dos.

Esta metodología puede, en principio, generalizarse al análisis de otras interacciones entre receptores y ligandos, ya que podrían ser fundamentales para el reconocimiento entre células. Por último, discutimos cómo derivar experimentalmente la constante C, que se requiere para convertir los rendimientos de grasa en ocupaciones del TCR. Este procedimiento solo necesita realizarse una vez.

La constante determinada C puede entonces emplearse en todos los experimentos posteriores en los que se utilice el mismo sistema de transferencia de resonancia de energía de tipo fret con los mismos fluoróforos. En este procedimiento, esencialmente relacionamos los rendimientos de transferencia de resonancia de energía de tipo fret medidos en agrupamientos individuales de TCR, mediante la recuperación del donador tras el blanqueo fotoquímico del aceptor, con los valores de intensidad correspondientes detectados en el canal de transferencia sensibilizada. Como se discutió anteriormente, el rendimiento de transferencia se determina a partir de las imágenes del canal del donador de transferencia corregidas por fondo, antes y después de la ablación del aceptor de transferencia.

El canal FRET sensibilizado debe alinearse con el canal donador F y con X e Y, y corregirse para el fondo. Aquí se muestra la fuga del donador Fred y la excitación cruzada del aceptor Fred. En el artículo se proporciona una descripción detallada de cómo corregir la fuga del donador Fred y la excitación cruzada del aceptor Fred.

Acompañando este video, calcule ahora para cada agrupamiento de TCR la relación entre la señal del marcador de la imagen FRET corregida y la imagen correspondiente del donador FRET corregida. Determine la señal promedio corregida para donadores FRET individuales y para eventos FRET de molécula individual, y calcule la relación. La ocupación de TCR se deriva entonces multiplicando ambas relaciones.

Ahora, represente gráficamente los rendimientos de FRET determinados para cada grupo individual de TCR frente a sus ocupaciones de TCR. A continuación, C se determina mediante regresión lineal, como se muestra aquí. En nuestro ejemplo, asciende aproximadamente a dos.

Después de ver este video, debería ser capaz de utilizar una bicapa lipídica funcionalizada con proteínas en combinación con microscopía de fluorescencia de molécula individual para medir la cinética de unión sináptica entre PMHC y TCR. Se discutieron todos los pasos necesarios, incluyendo la producción de proteínas, la marcación de linfocitos T y las mediciones finales de FRET. Además, se mostró en detalle el análisis de imágenes, que permite obtener curvas de activación de linfocitos T y valores de FRET.

Finalmente, se ha mostrado la metodología subyacente para la determinación de las tasas cinéticas de asociación y disociación. En principio, se puede utilizar un enfoque análogo para determinar otras interacciones entre receptores sinápticos y ligandos, aunque podrían ser necesarias modificaciones adecuadas.