Bilayers Individual Molécula microscopía de fluorescencia en planar compatibles

En este video, mostraremos cómo preparar y caracterizar bicapas lipídicas soportadas planares biofuncionalizadas. También describiremos en detalle la arquitectura de un microscopio de reflexión interna total con capacidades de detección de moléculas individuales. Mediremos la densidad de potencia de excitación, la fluidez y la densidad de proteínas de la bicapa lipídica.

Comencemos con una breve introducción a la bicapa lipídica soportada sobre vidrio plano. Cuando vesículas unilaminares pequeñas entran en contacto con una superficie de vidrio limpia, estallan y se extienden para formar una bicapa lipídica continua. Sobre un cojín de agua, normalmente elegimos el material PALM.

El POPC o fosfocolina oleílica es el lípido predominante porque da lugar a bicapas lipídicas fluidas a temperatura ambiente y a 37 grados Celsius. Para la funcionalización, añadimos niquel antióxido, un lípido sintético con un grupo funcional quelante de níquel, que se une a proteínas con etiqueta polihistidina. Por ejemplo, la molécula coestimuladora B siete uno, la molécula de adhesión ICAM uno y la molécula de MHC cargada con péptido marcada con fluorescencia para el reconocimiento por células T, como se muestra aquí; sin embargo, este sistema de bicapa puede emplearse en principio para abordar procesos completamente diferentes en una variedad de sistemas biológicos.

Debido a la naturaleza del sistema plano, los eventos de fluorescencia pueden monitorizarse en modo de reflexión interna total, lo que reduce sustancialmente el fondo celular y resulta muy adecuado para la microscopía de fluorescencia de molécula individual. Para la preparación de lípidos, se necesitan los lípidos POPC y cloroformo con níquel antiox, así como un matraz redondo limpio. Disuelva los lípidos en la proporción deseada y en cloroformo, y séquelos bajo vacío como se muestra aquí. Tras el tratamiento con alto vacío durante la noche, los lípidos forman una película en el interior del matraz. Para la rehidratación de los lípidos, utilice PBS desgasificado, añadiendo 10 mililitros de PBS desgasificado a la mezcla de lípidos seca.

No mezcle. Ahora, para evitar la oxidación de lípidos, llene el matraz con un gas inerte como nitrógeno o argón y gire el matraz. Los lípidos forman una suspensión lechosa.

Tome una pequeña muestra como blanco para el espectrofotómetro para evitar el intercambio de gases durante el siguiente paso. Es muy importante sellar adecuadamente el matraz que contiene la suspensión lipídica. Utilice una cinta adhesiva resistente al calor, por ejemplo, cinta para autoclave, para proteger del aire durante la formación física usando un baño ultrasónico cerrado.

Después de colocar el matraz, inicie el procedimiento de sonicación a una potencia máxima de 170 vatios. Sone durante 60 minutos. Debido a la formación física, la turbidez ha disminuido significativamente.

Esto puede verificarse mediante espectrofotometría a 550 nanómetros. Utilice la alícuota tomada antes de la sonicación como blanco. La densidad óptica a 230 nanómetros, que indica la cantidad de lípidos, debe permanecer constante.

Aquí llenamos pequeños tubos de ultracentrifugación con una suspensión de vesículas de un mililitro y los colocamos en un rotor de ángulo fijo de una ultracentrífuga de mesa. Es muy importante utilizar únicamente vesículas unilaminares pequeñas para la preparación de la bicapa. Las vesículas multilaminares más grandes y más densas, que también se forman durante la sonicación, interfieren con la fluidez de la bicapa y por lo tanto deben separarse y eliminarse mediante centrifugación.

Primero, centrifugamos durante una hora a 150,000 G a temperatura ambiente. El sobrenadante resultante se centrifuga luego durante ocho horas adicionales a 288,000 G a cuatro grados Celsius. Los portaobjetos deben estar muy limpios antes de que las vesículas lipídicas puedan extenderse sobre ellos para formar una bicapa continua y fluida.

Para ello, colocamos cubreobjetos en un montículo de teflón, que luego introducimos en un recipiente de vidrio. Es fundamental tener gran precaución, utilizando protección ocular, guantes protectores y bata de laboratorio, y trabajar dentro de una campana extractora de gases. Añadimos una parte de peróxido de hidrógeno al 30 % y luego tres partes de ácido sulfúrico concentrado, obteniendo así ácido peroximonosulfúrico, muy reactivo y oxidante.

Esta mezcla reacciona violentamente con sustancias orgánicas, incluyendo las presentes en la piel, los ojos y la ropa. Se calienta inmediatamente. Incube las laminillas durante 30 minutos.

Sujete la cubeta con la pinza. Lave completamente el ácido de ambos lados de la cubeta limpia utilizando agua destilada o desionizada de alta calidad. A continuación, coloque la cubeta sobre un soporte de teflón y déjela secar durante no más de 10 minutos para poder producir varias bicapas lipídicas individuales simultáneamente. Pegamos las cubetas secas con adhesivo de endurecimiento rápido.

Pegamento epoxi de dos componentes para una cámara Lab Tech de ocho o 16 pocillos. Primero, retire cuidadosamente la placa de vidrio lept de su marco original. Mezcle los dos componentes del pegamento en una proporción uno a uno.

Extiéndalo uniformemente sobre las ranuras inferiores del marco de la cámara. Coloque la laminilla limpia sobre la parte inferior del marco de la cámara recubierta de pegamento. Asegúrese de que el pegamento esté distribuido de manera uniforme entre la lámina de vidrio y el marco de plástico.

Deje que el pegamento se endurezca durante 30 minutos. Diluya la suspensión física de lípidos en PBS de uno a diez y filtre a través de un filtro de 0,2 micrones, agregando 120 microlitros de esta dilución a cada pocillo de una cámara de ocho pocillos o 60 microlitros a cada pocillo de una cámara de 16 pocillos. Asegúrese de que toda la superficie de vidrio quede cubierta y espere 20 minutos.

La bicapa ya se ha formado. Para eliminar los restos residuales, enjuague cada pocillo con 30 mililitros de PBS. Evite a toda costa la exposición al aire de la superficie de vidrio, ya que esto destruiría inmediatamente la bicapa. Asegúrese de que cada pocillo contenga el mismo volumen de tampón. Para el siguiente paso de decoración con proteína, llene completamente cada pocillo y retire la cúpula líquida.

Retire 330 microlitros. Esto dejará aproximadamente 350 microlitros dentro de cada uno. Para decorar la bicapa con proteínas, prepare una mezcla maestra que contenga las proteínas de elección con polihistidina y agregue 50 microlitros de esta mezcla a cada pocillo.

Las proteínas se unen al grupo cefálico antiníquel del lípido oscuro para garantizar resultados reproducibles, mezclando bien pero con cuidado, y siempre incubar durante 60 minutos para eliminar las proteínas no unidas. Lavar de nuevo con 30 mililitros de PBS. Enfoquémonos ahora en el hardware de microscopía.

Primero, ilustraremos los requisitos de la microscopía por reflexión interna total para la microscopía de césped basada en objetivos. Se necesita un objetivo de inmersión en aceite con una alta apertura numérica. El haz de excitación láser entrante es reflejado por el espejo dicromático y enfocado mediante un conjunto de dos o tres lentes únicamente en el plano focal posterior del objetivo.

Luego, la luz láser guía el objetivo como un haz recubierto a lo largo del eje óptico. De este modo, se ilumina la muestra fluorescente en toda su profundidad. Cuando se traslada el haz perpendicularmente al eje óptico, el haz permanece colimado, pero abandona el objetivo de forma inclinada.

Si continúa con la translocación, llegará en algún momento al ángulo crítico en el que el haz se refleja totalmente en la interfaz entre la cubreobjetos de vidrio y la muestra. La intensidad de la onda evanescente resultante decae exponencialmente y solo se excitan las estructuras cercanas a la interfaz, hasta varios cientos de nanómetros. Ahora, ilustramos cómo enfocar manualmente el haz láser en el plano focal posterior del objetivo.

Utilizando tres o dos lentes con los dos primeros lentes, se aumenta el diámetro del haz láser. La relación de sus longitudes focales determina el tamaño del punto de iluminación en el plano del espécimen. Para asegurar que el haz permanezca colimado, ajuste la distancia entre estos lentes de modo que sea igual a la suma de ambas longitudes focales.

La tercera lente se utiliza para enfocar el haz ampliado en el plano focal trasero del objetivo. Dado que la longitud focal de esta lente debe adaptarse a las dimensiones del cuerpo del microscopio y del periscopio asociado, en nuestro caso debe ser mucho más larga, variable en 75 centímetros. La distancia entre la segunda y la tercera lente no influye en las propiedades del haz.

Por lo tanto, el espacio infinito intermedio puede utilizarse para modificar el haz de manera definida sin distorsiones. Por ejemplo, se puede insertar una abertura y proyectarla con precisión sobre el plano del espécimen. En esencia, se puede lograr lo mismo utilizando dos lentes en lugar de tres.

El sistema de dos lentes es menos definido, pero introduce menos aberraciones de lente. Características simples como una abertura aún pueden implementarse muy bien para la modulación temporal. Un láser de gas, de hierro o de estado sólido debe colocarse delante de un obturador de rango milisegundo, por ejemplo, un obturador mecánico o un modulador óptico completo.

Una buena alternativa es un láser de diodo, que puede modularse electrónicamente y no requiere obturación externa. Dos espejos son suficientes para dirigir el haz a cualquier lugar y en cualquier dirección. Como se discutió anteriormente, se utilizan dos lentes para ampliar el haz y enfocarlo en el plano focal trasero del objetivo del microscopio.

Podemos trasladar el haz para la configuración del césped desplazando el espejo inferior del periscopio sobre un riel óptico. Para la detección de imágenes, utilizamos una cámara altamente sensible. Por ejemplo, un dispositivo acoplado por carga con multiplicación electrónica o em CCD, o un segundo haz láser de una longitud de onda diferente, puede alinearse en la trayectoria del haz.

Con el uso de espejos y una superposición dicróica. Para la detección simultánea de dos colores, colocamos un dispositivo divisor de haz disponible comercialmente en la trayectoria de emisión. Para los experimentos, es muy útil contar con dos trayectorias de haz de excitación independientes.

Por ejemplo, uno para imágenes de césped y un segundo para fotoblanqueo o activación selectiva. Esto puede lograrse fácilmente mediante la implementación de un conjunto de 2 divisores de haz 50/50. Como se muestra en nuestra ilustración, dos sistemas diferentes de ajuste de lentes y espejos darán lugar a dos perfiles de haz y ángulos de haz individuales.

Por ejemplo, una más amplia para la obtención de imágenes en el césped y otra más enfocada para el blanqueamiento o activación en zonas no césped. Se puede colocar una abertura en el haz no césped para moldear con precisión el punto de blanqueamiento o activación. Dos obturadores adicionales, uno para cada trayectoria del haz, permiten el control independiente de cada láser, dejando el objetivo en una trayectoria recta y no inclinada.

Encienda el medidor de potencia y ajústelo a la longitud de onda láser correspondiente. Mida la potencia de la luz láser en el objetivo y anótela. Ahora, traslade el espejo detrás del microscopio para inclinar el haz láser en el objetivo hacia la posición de césped.

Nunca mire directamente hacia la luz del láser. En la esquina inferior derecha, se observa el perfil de intensidad del láser de excitación tal como se visualiza mediante la emisión de una bicapa decorada con proteínas fluorescentes. Aquí utilizamos una representación en falso color para resaltar regiones de diferentes intensidades.

Mida la intensidad promedio del fondo dentro de una región de interés lo suficientemente grande. Este valor depende de ajustes específicos de la cámara, como la ganancia EM y la velocidad de lectura, y deberá restarse de todas las intensidades medidas. Determine la intensidad promedio dentro de toda el área iluminada.

Elige un diámetro lo suficientemente grande para que los valores de intensidad en la periferia sean similares a los del fondo de la cámara; mide la intensidad promedio del área central. Esta área define la región de interés en la que se realizarán los experimentos de microscopía posteriormente. Ahora, resta el valor promedio de intensidad de fondo de las intensidades tanto del área eliminada como del área central.

A continuación, multiplique las intensidades corregidas del fondo por el número correspondiente de píxeles del tamaño de la región para obtener las intensidades integradas. Establezca la intensidad integrada del área iluminada como uno y calcule la fracción para el área central. La potencia medida con el medidor de potencia.

En nuestro caso, cinco milivatios es directamente proporcional a la intensidad integrada de toda el área iluminada. Multiplique este valor por la fracción de potencia del área central para determinar la potencia dentro del área central. En nuestro ejemplo, 1.15 milivatios, el factor para convertir el número de píxeles a micrómetros cuadrados depende del tamaño real del píxel del chip de la cámara y de la magnificación de la trayectoria de emisión.

Puede determinarse fácilmente con una regla micrométrica. En nuestro ejemplo, el área central corresponde a 170,8 micrones cuadrados. La densidad de potencia se refiere a la potencia medida dividida por el área y, por lo tanto, equivale a 1,15 milivatios divididos por 170,8 micrones cuadrados o 0,007 milivatios por micrón cuadrado.

Es decir, 0,7 kilovatios por centímetro cuadrado. Para determinar la fluidez de la bicapa, realizamos una recuperación de fluorescencia tras el blanqueo fotónico del experimento de envoltura. Como se muestra en la película inferior izquierda, obtenemos imágenes de la bicapa fluorescente a baja densidad de potencia.

En la película inferior derecha, puede observarse la cámara de tecnología de laboratorio correspondiente en el microscopio. A continuación, se realiza un blanqueo en un área circular mediante pulsos cortos de alta densidad de potencia y se monitorea la recuperación a baja densidad de potencia. Nuevamente, el montaje proporciona una visión general del experimento en diferentes puntos de tiempo, siendo el tiempo cero los pulsos de blanqueo.

Cuantificamos la intensidad media de fluorescencia corregida del fondo dentro del círculo marcado y normalizamos todas las intensidades medidas a la intensidad al inicio del experimento. Antes de los pulsos de blanqueo, representamos los valores de intensidad normalizados frente al tiempo. El valor de saturación representa, en nuestro caso, la fracción móvil superior al 90 %. Primero, tome una imagen del bicapa a baja densidad de potencia de excitación.

Por ejemplo, al colocar un filtro de densidad óptica con un valor de atenuación logarítmico de dos, esto reduce la potencia por un factor de 100. El tiempo de exposición debe ser constante durante todo el procedimiento y suficiente para obtener imágenes de una fuerza de fluido individual a la densidad de potencia no atenuada, en nuestro caso, 10 milisegundos a 0,7 kilovatios por centímetro cuadrado. Utilice una representación en falso color para resaltar áreas de diferentes intensidades.

Seleccione una región de interés en la que se realizarán posteriormente mediciones de moléculas individuales y una región del mismo tamaño. Para la sustracción del fondo, calcule la intensidad integrada sustraída del fondo. Ahora retire el filtro de densidad óptica del trayecto del haz de excitación, blanquee el área y tome una imagen.

Verá fuerzas individuales de flu que se difunden en el área blanqueada. Las fuerzas individuales de flu están limitadas por difracción, con un diámetro típico de dos a tres píxeles; tome una región de siete por siete píxeles alrededor de cada señal de molécula individual y una segunda región cercana. Para la sustracción de fondo, es importante cuantificar únicamente la señal de fuerzas individuales de Fluor.

Por lo tanto, es mejor obtener imágenes de proteínas en la capa BI con una relación de tinte a proteína menor a uno o bien para proteínas marcadas específicamente con SAT. Incluso con una relación de tinte a proteína de uno, como se muestra en nuestro ejemplo, mida las intensidades integradas para ambas regiones y reste el fondo de la señal para no considerar el último evento observado en nuestro ejemplo, ya que probablemente haya ocurrido un blanqueo durante la exposición promedio. Las señales corregidas aquí; hacemos esto para un fluoróforo de cuatro, que observamos a lo largo de nueve cuadros.

Sin embargo, este procedimiento debe realizarse con al menos varios cientos de eventos de molécula individual. Regresemos a nuestra imagen original de bicapa observada con densidad de potencia de excitación atenuada. La densidad molecular se determina corrigiendo la intensidad integrada de la región de interés para una baja densidad de potencia de excitación, multiplicándola por cien y dividiéndola por la intensidad promedio de una sola molécula y el área.

Estamos trabajando con una densidad de 421,4 unidades de fuerza Fluor por micrón cuadrado. En nuestro ejemplo, con una relación dieta-proteína de uno, esto equivale al mismo número de moléculas por micrón cuadrado. Después de ver este video, debería ser capaz de preparar y caracterizar una bicapa lipídica funcionalizada con proteínas utilizando microscopía de fluorescencia de molécula individual.

Además, debería estar familiarizado con los principios básicos para modificar y mejorar un microscopio estándar para este propósito. Utilizaremos posteriormente esta metodología para determinar la cinética de unión del antígeno unido a bicapa con los receptores de células T unidos a la célula, pero muchas otras aplicaciones basadas en esto son ciertamente factibles.