Bilayers Individual Molécula microscopía de fluorescencia en planar compatibles

En este vídeo, mostraremos cómo preparar y caracterizar la bilar lipídica soportada plana biofuncionalizada. También describiremos en detalle la arquitectura de un microscopio de reflexión interna total con capacidades de detección de una sola molécula. Mediremos la densidad de potencia de excitación, la fluidez y la densidad proteica de la capa lipídica.

Comencemos con la breve introducción a la hoja lipídica plana con soporte de vidrio. Cuando las pequeñas vesículas uni lanares se encuentran con una superficie de vidrio limpia, estallan y se extienden para formar una bicapa lipídica contigua. En un cojín de agua, normalmente elegimos material de palma.

La fosfocolina o POPC tiene el lípido predominante porque da lugar a bicapas lipídicas fluidas a temperatura ambiente y 37 grados centígrados. Para la funcionalización, añadimos níquel antiox, un lípido sintético con un grupo principal quelante de níquel, que se une a las proteínas de etiqueta de polihistamina. Por ejemplo, la molécula coestimuladora B siete uno, la molécula de adhesión, ICAM uno, y la molécula MHC cargada con péptidos marcados con fluorescencia para el reconocimiento de células T como se muestra aquí, sin embargo, este sistema de bicapas puede, en principio, emplearse para abordar procesos completamente diferentes en una variedad de sistemas biológicos.

Debido a la naturaleza del sistema plano, los eventos de fluorescencia se pueden monitorear en el modo de reflexión interna total, lo que reduce sustancialmente el fondo celular y es muy adecuado para la microscopía de fluorescencia de molécula única Para la preparación de lípidos, se necesitan los lípidos, POPC y cloroformo antiox de níquel, y un matraz de fondo redondo limpio para disolver los lípidos en la proporción deseada y cloroformo y secarlos al vacío como se muestra aquí. Después de un tratamiento de alto vacío durante la noche, los lípidos forman una película en el interior del matraz. Para la rehidratación de lípidos, use Degas PBS a 10 mililitros de Degas PBS a la mezcla de lípidos secos.

No mezclar. Ahora, para evitar la oxidación de los lípidos, llene el matraz con un gas inerte como nitrógeno o argón y gire el matraz. Los lípidos forman una suspensión lechosa.

Tome una pequeña muestra como blanco para el espectrofotómetro para evitar el intercambio de gases durante el siguiente paso. Es muy importante sellar correctamente el matraz que contiene la suspensión lipídica. Utilice una cinta adhesiva estable al calor, por ejemplo, cinta de autoclave donde la protección del aire durante la formación física mediante un baño ultrasónico cerrado.

Después de montar el matraz, inicie el procedimiento de sonicación a una potencia máxima de 170 vatios. Sonic Cade durante 60 minutos. Debido a la formación física, la turbidez ha disminuido significativamente.

Esto se puede verificar mediante fotometría espectrospectral a 550 nanómetros. Utilice la alícuota tomada antes de la sonicación como un espacio en blanco. La densidad óptica a 230 nanómetros, que es indicativa de la cantidad de lípidos, debe permanecer constante.

Aquí llenamos pequeños tubos de ultra centrifugación con una suspensión visl de un mililitro y los colocamos en un rotor de ángulo fijo de una ultracentrífuga de mesa. Es muy importante utilizar solo pequeñas vesículas uni laina para la preparación de bicapas. Las vesículas multi laina más grandes y densas, que también se forman durante la sonicación, interfieren con la fluidez de la bicapa y, por lo tanto, deben palidecer y eliminarse por centrifugación.

Primero, centrifugamos durante una hora a 150.000 G a temperatura ambiente. A continuación, el snat resultante se centrifuga durante ocho horas adicionales a 288.000 G a cuatro grados centígrados. Las luces de vidrio deben estar muy limpias antes de que las vesículas lipídicas puedan extenderse sobre ellas para formar una bicapa contigua y fluida.

Para ello, colocamos cubreobjetos en un montículo de teflón, que luego colocamos en un recipiente de cristal. Gran precaución donde la protección de los ojos, guantes protectores y una bata de laboratorio y trabajar en un gabinete químico. Añadimos una parte de peróxido de hidrógeno al 30%, y luego tres partes de ácido sulfúrico concentrado para dar lugar a un ácido perio monosulfúrico muy reactivo y oxidativo.

Esta mezcla reacciona violentamente con las sustancias orgánicas, incluidas las de la piel, los ojos y la ropa. Se calienta inmediatamente. Incuba los portaobjetos durante 30 minutos.

Lave a fondo el cubreobjetos en ambos lados del cubreobjetos limpios con agua destilada W o agua sindicalizada de alta calidad. A continuación, coloque el portaobjetos en un soporte de teflón y déjelo secar durante no más de 10 minutos para poder producir varias bicapas lipídicas individuales a la vez. Pegamos cubreobjetos secos con endurecimiento rápido.

Pegamento epoxi de dos componentes para una cámara técnica de laboratorio de ocho o 16 pocillos. Primero, retire con cuidado la corredera de vidrio original de su marco. Mezcle los dos componentes del pegamento en una proporción de uno a uno.

Extiéndalo uniformemente en las ranuras inferiores del marco de la cámara. Coloque el deslizamiento de cubierta limpio en la parte inferior cubierta de pegamento del marco de la cámara. Asegúrese de que el pegamento se distribuya uniformemente entre el portaobjetos de vidrio y el marco de plástico.

Deja que el pegamento se endurezca durante 30 minutos. Diluir la suspensión física lipídica en PBS de uno a 10 y filtrarla a través de un filtro de 0,2 micras a 120 microlitros de esta dilución en cada pocillo de una cámara de ocho pocillos o 60 microlitros en cada pocillo de una cámara de 16 pocillos. Asegúrese de que toda la superficie del vidrio esté cubierta y espere 20 minutos.

Ahora se ha formado la bicapa Para deshacerse de los residuos les enjuague cada pozo con 30 mililitros de PBS. Evite a toda costa la exposición al aire de la superficie del vidrio. Esto destruiría instantáneamente la bicapa para asegurar que cada pocillo contenga el mismo volumen de tampón Para el siguiente paso de decoración de proteínas, llene cada pocillo por completo y retire la cúpula de líquido.

Saca 330 microlitros. Esto dejará unos 350 microlitros dentro de cada uno. Bueno, para decorar la bicapa con proteínas, prepare una mezcla maestra que contenga las proteínas técnicas de polihistamina de su elección y agregue 50 microlitros a cada pocillo.

Las proteínas se unen al grupo anticabeza de níquel del lípido oscuro para garantizar resultados reproducibles, mezcladas a fondo pero con cuidado y siempre incubadas durante 60 minutos para eliminar las proteínas no unidas. Lavar de nuevo con 30 mililitros de PBS. Centrémonos ahora en el hardware de microscopía.

En primer lugar, ilustraremos los requisitos de la microscopía de reflexión interna total para la microscopía de césped basada en objetivos. Se necesita un objetivo de inmersión en aceite con una apertura numérica alta. El haz de excitación láser entrante es reflejado por el espejo dicroico y enfocado a través de un conjunto de dos o tres lentes solo en el plano focal posterior del objetivo.

A continuación, la luz láser conduce el objetivo como un haz recubierto a lo largo del eje óptico. De esta manera, el espécimen fluorescente se ilumina en toda su profundidad. Cuando se transloca el haz perpendicularmente al eje óptico, el haz permanece intercalado, pero abandona el objetivo de forma inclinada.

Si continúa translocando, alcanzará en algún punto el ángulo crítico en el que el haz se refleja totalmente en la interfaz entre el deslizamiento de la cubierta de vidrio y la muestra. La intensidad de la onda evanescente resultante decae exponencialmente y solo se excitan los pisos cuatro, que están muy cerca de la interfaz hasta varios cientos de nanómetros. Ahora, ilustramos cómo enfocar el rayo láser manualmente en el plano focal posterior del objetivo.

Usando tres o dos lentes con las dos primeras lentes, se aumenta el diámetro del rayo láser. La relación de su distancia focal determina el tamaño del punto de iluminación en el plano de la muestra. Para asegurarse de que el haz permanezca intercalado, ajuste la distancia entre estas lentes para que sea igual a la suma de ambas distancias focales.

La tercera lente se utiliza para enfocar el haz de ensanchamiento en el plano focal posterior del objetivo. Debido a que la distancia focal de esta lente debe adaptarse a las dimensiones del cuerpo del microscopio y la de un periscopio asociado, debe ser mucho más larga en nuestro caso, variando 75 centímetros. La distancia entre la lente dos y tres no influye en las propiedades del haz.

Por lo tanto, el espacio infinito intermedio se puede utilizar para modificar el haz de una manera definida sin distorsiones. Por ejemplo, puede insertar una abertura y proyectar con precisión en el plano de la muestra. En esencia, puede lograr lo mismo con el uso de dos lentes en lugar de tres.

El sistema de dos lentes es menos definido pero introduce menos aberraciones de lente. Características simples como una apertura aún se pueden implementar muy bien para la modulación temporal. Se debe colocar un láser de gas, hierro o estado sólido frente a un obturador de rango de milisegundos, por ejemplo, un obturador mecánico o un modulador óptico al.

Una buena alternativa es un láser de diodo, que se puede modular electrónicamente y no necesita cierre externo. Dos espejos son suficientes para dirigir el haz a cualquier lugar y en cualquier dirección. Como se ha comentado anteriormente, las dos lentes se utilizan para ampliar el haz y enfocarlo en el plano focal posterior del microscopio. Objetivo.

Podemos trasladar el haz para la configuración del césped desplazando el espejo inferior del periscopio sobre un riel óptico. Para la detección de imágenes, utilizamos una cámara de alta sensibilidad. Por ejemplo, un dispositivo acoplado de carga multiplicadora de electrones o un segundo rayo láser CCDA em de una longitud de onda diferente se puede alinear en la trayectoria del haz.

Con el uso de espejos y una superposición dicroica. Para la detección simultánea de dos colores, colocamos un dispositivo de división de haz disponible en el mercado en la ruta de emisión. Para los experimentos, es muy útil tener dos trayectorias de haz de excitación independientes en su lugar.

Por ejemplo, uno para la obtención de imágenes de césped y un segundo para el fotoblanqueo o la activación dirigida. Esto se puede lograr fácilmente implementando un conjunto de 2 divisores de haz 50 50. Como se muestra en nuestra ilustración, dos sistemas diferentes de ajuste de lentes y espejos darán lugar a dos perfiles de haz y ángulos de haz individuales.

Por ejemplo, uno ensanchado para la obtención de imágenes en el césped y uno más enfocado para el blanqueo o la activación en el resto del césped. Se puede colocar una abertura en el haz que no es de césped para dar forma con precisión al punto de blanqueo o activación. Dos obturadores adicionales, uno para cada trayectoria del haz Habilite el interruptor de control independiente en el rayo láser, dejando el objetivo en una trayectoria recta no inclinada.

Encienda el medidor de potencia y ajústelo a la longitud de onda del láser correspondiente. Mide la potencia de la luz láser en el objetivo y anótalo. Ahora, transloca el espejo detrás del microscopio para inclinar el rayo láser hacia el objetivo a la posición del césped.

Nunca mire directamente a la luz láser. En la esquina inferior derecha, se ve el perfil de intensidad del láser de excitación visualizado a través de la emisión de una bicapa decorada con proteínas fluorescentes. Aquí usamos una representación de color falso para resaltar regiones de diferentes intensidades.

Mida la intensidad promedio del fondo dentro de una región de interés lo suficientemente grande. Este valor depende de los ajustes específicos de la cámara, como la ganancia EM y la velocidad de lectura, y deberá restarse de todas las intensidades medidas. Determine la intensidad media dentro de toda el área iluminada.

Elija el diámetro lo suficientemente grande para que los valores de intensidad en la periferia sean similares a los del fondo de la cámara y mida la intensidad media del área central. Esta área define la región de interés en la que se realizarán experimentos de microscopía más adelante. Ahora, reste el valor medio de la intensidad de fondo de las intensidades de la zona eliminada y central.

A continuación, multiplique las intensidades corregidas del fondo por el número de píxeles correspondiente del tamaño de la región para obtener intensidades integradas. Establezca la intensidad integrada del área iluminada como una sola y calcule la fracción para el área central. La potencia medida con el medidor de potencia.

En nuestro caso, cinco milivatios es directamente proporcional a la intensidad integrada de toda el área iluminada. Multiplique este valor por la fracción de potencia del área central para determinar la potencia dentro del área central. En nuestro ejemplo, 1,15 milivatios, el factor para convertir el número de píxeles a micras cuadradas depende del tamaño real de los píxeles del chip de la cámara y de la ampliación de la vía de emisión.

Se puede determinar fácilmente con un portaobjetos micrométrico. En nuestro ejemplo, el área central corresponde a 170,8 micras cuadradas. La densidad de potencia se refiere a la potencia medida dividida por el área y, por lo tanto, es igual a 1,15 milivatios dividido por 170,8 micras cuadradas o 0,007 milivatios por micra cuadrada.

Es decir, 0,7 kilovatios por centímetro cuadrado. Para determinar la fluidez de la bicapa, realizamos una recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo del experimento de envoltura. Como se muestra en la película inferior izquierda, obtenemos imágenes de la bicapa fluorescente a baja densidad de potencia.

En la película inferior derecha, puede ver la cámara técnica de laboratorio correspondiente en el microscopio. A continuación, blanqueamos un área circular con los pulsos cortos de alta densidad de potencia y controlamos la recuperación a baja densidad de potencia. Una vez más, el montaje proporciona una visión general del experimento para diferentes puntos de tiempo, siendo el tiempo cero los pulsos de lejía.

Cuantificamos la intensidad media de fluorescencia corregida de fondo dentro del círculo de marca y normalizamos todas las intensidades medidas a la intensidad al principio del experimento. Antes de los pulsos de blanqueo, trazamos los valores de intensidad normalizados en función del tiempo. El valor de saturación representa la fracción móvil en nuestro caso por encima del 90%Primero, tome una imagen de la bicapa a baja densidad de potencia de excitación.

Por ejemplo, al colocar un filtro de densidad óptica con un valor de atenuación logarítmica de dos, esto reduce la potencia en un factor de 100. El tiempo de exposición debe ser constante durante todo el procedimiento y suficiente para obtener una imagen de la fuerza de un solo fluido a la densidad de potencia no atenuada en nuestro caso, 10 milisegundos a 0,7 kilovatios por centímetro cuadrado. Utilice la representación de colores falsos para resaltar áreas de diferentes intensidades.

Elija una región de interés en la que se realizarán mediciones de una sola molécula más adelante y una región del mismo tamaño. Para la resta de fondo, calcule la intensidad integrada restada de fondo. Ahora retire el filtro de densidad óptica de la trayectoria del haz de excitación, blanquee el área y tome una imagen.

Verá que la fuerza individual de la gripe se difunde en el área blanqueada. La fuerza de la gripe única está limitada por la difracción con un diámetro típico de dos a tres píxeles, toma una región de siete por siete píxeles alrededor de cada señal de molécula individual y la segunda región cerca. Para la sustracción de fondo, es importante cuantificar solo la señal de una sola fuerza fluorada.

Por lo tanto, es mejor obtener imágenes de proteínas en la capa BI con una proporción de proteínas a proteínas de menos de una o, en el caso de proteínas marcadas específicamente con SAT. Incluso más proporción de dieta a proteína de uno como se muestra en nuestro ejemplo, mida las intensidades integradas para ambas regiones y reste el fondo de la señal para no tomar el último evento observado que se muestra en nuestro ejemplo, ya que el blanqueamiento probablemente ha ocurrido durante el promedio de exposición. Las señales corregidas aquí, lo hacemos para una gripe de cuatro, que observamos durante nueve cuadros.

Sin embargo, este procedimiento debe realizarse para al menos varios cientos de eventos de una sola molécula. Volvamos a nuestra imagen original de bicapa observada con una densidad de potencia de excitación atenuada. La densidad molecular se determina corrigiendo la intensidad integrada de la región de interés para la densidad de potencia de excitación baja mediante la multiplicación por cien y dividiéndola por la intensidad promedio de una sola molécula y el área.

Se trata de una densidad de 421,4 Fluor force por micra cuadrada. En nuestro ejemplo, con una proporción de dieta a proteína de uno, esto equivale al mismo número de moléculas por micra cuadrada. Después de ver este vídeo, debería ser capaz de preparar y caracterizar una bicapa lipídica funcionalizada por proteínas mediante microscopía de fluorescencia de molécula única.

Además, debe estar familiarizado con los principios básicos para modificar y actualizar un microscopio estándar para este propósito. Más adelante utilizaremos esta metodología para determinar la cinética de unión del antígeno unido a la bicapa a los receptores de células T unidos a células, pero muchas otras aplicaciones basadas en esto son ciertamente factibles.