Name: Bilayers Individual Molécula microscopía de fluorescencia en planar compatibles (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 20 min
Description: Aprende a preparar bicapas lipídicas planares funcionalizadas con proteínas y a caracterizarlas mediante microscopía de fluorescencia de molécula única. Este método permite estudiar dinámica de proteínas de membrana con alta resolución.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

MA fue apoyado por una beca de Schrödinger del Fondo austríaco Ciencia (FWF, J3086-B11) y gracias al Max-Planck-Sociedad para el apoyo financiero y administrativo. GS fue apoyado por el Fondo de Ciencia y Tecnología de Viena (WWTF, LS13-030). JH fue apoyado por el Fondo de Ciencia y Tecnología de Viena (WWTF, LS14-031).

1. Generación y funcionalización de planar SLBS <ol><li> La mezcla de los lípidos <ol><li> Para llegar a una DGS NTA-Ni / 90% composición lipídica POPC 10% se disuelven 45 mg de POPC y 6,9 mg DGS NTA-Ni en cloroformo en un matraz de 250 ml de fondo redondo. Mantenga el volumen de baja cloroformo (sólo varios ml) se evapore en el siguiente paso. Para una DGS NTA-Ni / 99% composición de lípidos POPC 1% utilizar 49,5 mg y 0,69 mg POPC DGS NTA-Ni. </li><li> Eliminar el cloroformo utilizando un evaporador rotatorio lentamente - un aumento por encima de la temperatura ambiente no es necesario. Alternativamente, soplar fuera dentro de una campana química en una corriente de gas inerte tal como nitrógeno o argón. Mientras se hace girar constantemente este matraz para permitir la igualdad de deposición del lípido secado en la mitad inferior del matraz de fondo redondo. </li><li> Una vez que se evaporó la mayor parte del cloroformo, adjuntar el matraz para aspirar O / N para eliminar el cloroformo cuantitativamente. NOTA: Este paso es fundamental para evitar la contaminaciónde proteínas y células con cloroformo tóxico en las etapas posteriores y para asegurar la fluidez de la bicapa lipídica. </li></ol></li><li> Generación de pequeñas vesículas unilaminares (SUV) de lípidos secos NOTA: pequeñas vesículas unilaminares (SUVs) son entre 20 nm y 100 nm de diámetro y se pueden producir fácilmente por tratamiento con ultrasonidos de baño. Extrusión de lípidos, un método alternativo, puede dar lugar a SUVs y, dependiendo del tamaño de poro del filtro aplicado para la extrusión, también vesículas unilamelares grandes (LUV), que son 100 nm a 1000 nm de tamaño. Sin embargo, todo terrenos son los más adecuados para la formación de SLBS. <ol><li> SUVs través de ultrasonidos de baño (que se muestran en el video): <ol><li> Desgasifique PBS. Suspender la mezcla de lípidos seca con los 250 ml matraz de fondo redondo de 10 ml desgasificado PBS. </li><li> Llenar el matraz con gas inerte tal como nitrógeno o argón, cerrarlo con un tapón y sellar el matraz con cinta de autoclave. </li><li> Coloque el frasco cerrado en un baño de ultrasonido y sonicar el lípido suspensión unt 120 a 170 W hasta que se ha vuelto clara. Esto toma entre 30 y 60 min. </li><li> Monitorear el progreso de la vesícula formación espectro-fotometría: derivarse que la absorción de la emulsión sin diluir en comparación con PBS se mantiene constante a 234 nm (como un indicador aproximado de la concentración de lípidos) todavía debe bajar de manera significativa a 550 nm (debido a una menor dispersión de la luz a través de partículas más grandes). </li><li> Para sedimentar las vesículas unilamelares no pesados, que interfieren con la formación de un SLB contigua, sedimentar la suspensión de vesículas por centrifugación, a 150.000 xg durante 1 hora a 25 ° C y luego durante 8 horas a 288.000 xg, 4 ° C. </li><li> Filtrar el sobrenadante a través de un filtro de jeringa con un diámetro de poro de 0,2 micras. </li><li> Medir la DO a 234 nm y 550 nm para controlar la claridad de la preparación de vesículas y la cantidad de lípidos izquierda. </li><li> Guarde las vesículas a 4 ° C en atmósfera de argón o nitrógeno. Opcionalmente, utilice suspensión de vesículas bicapa para la preparación depor muchos meses. </li></ol></li><li> SUVs mediante extrusión de lípidos: <ol><li> En resumen, pasar la suspensión de lípidos varias veces a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,1 micras. Independientemente del método de fabricación, centrifugar la suspensión de vesículas dos veces (1H, 150,000g, 25 ° C; a continuación, 8H, 4 ° C, 288.000 g) para sedimentar las vesículas no unilamelares que son más pesados. NOTA: Cuando se almacena a 4 ° C bajo gas inerte, las vesículas se pueden utilizar para la preparación bicapa durante varios meses. </li></ol></li></ol></li><li> Formación de un SLB y cargar con la proteína <ol><li> Tratar 24 x 50 mm # 1.5 portaobjetos de vidrio con una mezcla 3: 1 de ácido sulfúrico concentrado y peróxido de hidrógeno al 30% durante 30 min. NOTA: Debido a la naturaleza agresiva de la mezcla tome un cuidado especial, es decir, llevar una bata de laboratorio y gafas de seguridad como se muestra en el video! </li><li> Enjuagar los portaobjetos de vidrio bajo una corriente de ddH2O fuera de una botella con atomizador. Colóquelos en un soporte de teflón y déjelos secardurante 10 a 30 min. </li><li> Retire la placa de vidrio inferior de 8 o 16 cámaras así, llenar el fondo con pegamento epoxi y coloque cuidadosamente un portaobjetos de vidrio limpio y seco en el fondo de la cámara de cola cubierta. Deje que el pegamento se endurezca durante aproximadamente 10 min. Retire el exceso de pegamento de la parte inferior. NOTA: un sello hermético entre el portaobjetos de vidrio y la cámara también se puede lograr fácilmente con el uso de un de dos componentes dental pasta de modelar de silicona, que se endurece dentro de 10 a 30 min. Este sello no es tan firme como el pegamento epoxi, pero resiste la tensión física regular. Después del experimento se puede retirar fácilmente de la cámara, que luego es reutilizable en futuros experimentos. </li><li> Pipetear 120 l (60μl) de una suspensión de lípidos veces 10 diluida PBS-en cada pocillo de un niño de 8 (16) - así cámara (preparado como se ha descrito anteriormente) y dejar que la forma bicapa durante 20 min. Enjuagar cuidadosamente la bicapa dos veces con 15 ml de PBS. Una vez se ha formado la bicapa, siempre debe estar sumergida en tampón y nunca se expone al aire. </li&gt; <li> Llene cada pocillo hasta el final con PBS, luego despegar 330μl (cámara de 8 pocillos) o 165μl (cámara de 16 pocillos). Hay 350μl (175μl) dejó en el pozo. Añadir 50 l (25 l) de cóctel que contiene proteínas etiquetadas-His diluido en PBS a cada pocillo (400 o 200 l final) y se incuba a TA durante 60 min en la oscuridad. La densidad de proteína de la superficie se puede ajustar mediante la variación de la concentración de proteína durante esta etapa de incubación. </li><li> Enjuague cada pocillo dos veces con 15 ml de PBS. NOTA: Por lo general, SLBS se debe utilizar en los experimentos de no más de 6 horas después de su carga con la proteína. Durante este periodo, la recuperación después de photobleaching fluoróforo permanece hasta el 95% y sin pérdida de la proteína asociada a la bicapa se puede detectar. La densidad de la proteína debe ser determinado antes del experimento (véase a continuación). </li><li> Paso opcional: Para probar la unión no específica de la proteína de la DGS NTA-Ni que contiene SLB, lavar el SLB una vez con PBS que contiene imidazol 300 mM. El PROproteína debe salir por completo. </li></ol></li></ol> 2. Microscopio de instalación <ol><li> Para la construcción de un sistema de microscopía capaz de detectar la fluorescencia de fluorocromos individuales consulte las recomendaciones indicadas en la introducción. </li></ol> 3. Mediciones Eléctricas NOTA: Los fluoróforos pueden ser fácilmente saturados con el exceso de luz de excitación. Esto acelera fotoblanqueo sin mayor ganancia en emisión y debe evitarse tanto. Para optimizar la iluminación de la muestra la densidad de potencia de excitación debe ser medido directamente en el espécimen. Tales mediciones pueden también servir como una referencia para futuros experimentos. Además, conociendo la relación entre la potencia de entrada y de salida de láser es útil al evaluar donde la luz se pierde en el sistema de imágenes. <ol><li> Mover el haz de excitación a la posición vertical para que salga el objetivo en un ángulo de 90 °. </li><li> Coloque la cabeza del medidor de potencia en la parte superior of la viga y medir la potencia del haz (= P). Documentar el resultado. </li><li> Utilizando el periscopio, gire el haz en la posición TIRF y la imagen de una bicapa fluorescente homogéneo intacta. Para evitar la decoloración y la saturación de la señal CCD lugar una densidad neutra (ND) del filtro con una densidad óptica (DO) de 2 a 3 en la trayectoria de la luz de excitación. <ol><li> Mida las cuentas integradas de todo el campo iluminado (= I total). Además, medir el tamaño de la zona iluminada (= A total). Medir las cuentas integradas (= I Center) del punto central de máxima iluminación, así como el tamaño del punto (= a centro). </li></ol></li><li> Mida la señal de fondo por píxel (= B) o bien fuera de la zona iluminada o sin iluminación de la muestra. </li><li> Reste la señal de fondo a partir de los resultados medidos en 3.). Para ello, multiplicando el número de píxeles de la zona en cuestión (área entera iluminada o punto central) con el fondocuentas por píxel. (= I Total - A .B totales y yo Center - Un centro .B). </li><li> Divida el integrado y corrección de fondo de la señal del punto central de la señal integrada y fondo con corrección de todo el campo de la iluminación. NOTA: El resultado indica la fracción de la potencia total situado dentro del punto central (= (centro I - Un centro .B) / (I Total - A .B total)). Multiplicación de este resultado con el P potencia medida en 2.) resultados en el poder de la luz que ilumina el punto central. </li><li> Determine el tamaño de la mancha Un centro en μm². Por esta dividir el tamaño de píxel cámara en micras por el aumento del objetivo, toma la plaza del resultado como μm² por píxel. <ol><li> Alternativamente medir el tamaño de píxel dentro de la imagen con el uso de una diapositiva micrómetro colocado en el microscopio y tomar el cuadrado de la zona de resultado como por píxel. Multiply este valor por el número de píxeles situados dentro del punto central para llegar a la zona de punto iluminado. </li></ol></li><li> Dividir la potencia P que ilumina el punto central por el tamaño del punto central de un centro, μm² para calcular la intensidad de iluminación por 2 micras. Un ejemplo se da en la figura 6. </li><li> Valores de densidad de potencia medidos en la iluminación no TIRF suelen ser inferiores a los presentes en la iluminación TIRF 13, que también depende del ángulo exacto en el que la luz láser está totalmente reflejada. Para llegar a densidades de potencia presentes bajo iluminación TIRF, imagen calibrada perlas fluorescentes de diámetro 0.1μm tanto en no TIRF y TIRF. La relación de intensidades de fluorescencia del grano medido en TIRF y el modo no TIRF asciende a el factor de conversión C, que permite la conversión de los valores de densidad de potencia medidos en los efectivos bajo iluminación TIRF (ecuación 1). Densidad de poder </em&gt; TIRF = C • densidad de potencia no TIRF (ecuación 1) con C = intensidad del grano T IRF intensidad / perlas no TIRF </li></ol> 4. Densidad Las mediciones <ol><li> Determinar la señal media de los fluoróforos individuales situados en una bicapa. Moléculas MHC bicapa unida cargadas con péptidos fluorescentes son ideales para este propósito ya que la proteína: etiqueta estequiometría es exactamente una. Si lejía necesaria todas las etiquetas de la bicapa en el campo de visión y dejar que la fluorescencia se recuperan de visualizar fluoróforos individuales. <ol><li> Graba imágenes en rápida sucesión (por ejemplo, se aplican una adquisición de streaming de protocolo) y supervisar las moléculas individuales de movilidad en varios marcos. Para obtener más información consulte la Figura 7. </li></ol></li><li&gt; Marque el punto central de la iluminación dentro de la bicapa como retorno de la inversión. Medir el ROI, la variación en densidad de potencia de iluminación (que es proporcional a la intensidad de fluorescencia) debe ser idealmente menos de 15%. <ol><li> Determinar sola molécula y fluorescencia mayor sólo dentro de este retorno de la inversión. Integrar la señal de un retorno de la inversión, que es lo suficientemente grande como para capturar el 99% o más de la función de dispersión de punto del único emisor. Cuando se emplea una cámara con un tamaño de píxel de 16-20 de micras (indicado en las especificaciones de la cámara del fabricante), un objetivo con un aumento de 100 veces y una abertura numérica igual o mayor que 1,45, tome una región de 7 por 7 píxeles con el pico de intensidad situado en el centro de la plaza. </li><li> Para determinar la señal de fondo, integrar los cargos de un cuadrado de 7 por 7 pixel vecino, que no contiene una señal de fluorescencia. Reste el fondo de la señal de moléculas individuales para determinar el valor corregido para una sola molécula de flúorescencia. Seleccionar sólo las señales, que son todavía visibles en el siguiente cuadro. </li></ol></li><li> Repita el paso 4.2 cincuenta a varios cientos de veces. Un promedio de la señal de fondo con corrección. Si lo desea, trazar valores de intensidad de una sola molécula como un histograma. Opcional: tomar ventaja de un plugin adecuado de paquetes de software de código abierto (por ejemplo ImageJ) o procesar los datos utilizando un software comercial (por ejemplo Metamorph, Molecular Devices). Los usuarios experimentados pueden escribir su propio programa de análisis en Matlab o paquetes de software similares. </li><li> Coloque un filtro de densidad neutra de 2 o más alto en el camino de excitación y tomar imágenes de una bicapa fluorescente que contiene proteínas marcadas con el mismo fluoróforo. Anote la intensidad media de píxeles dentro de la misma ROI utilizado para mediciones de la intensidad de una sola molécula. Registre el tiempo de exposición de las medidas de fluorescencia a granel. Mida el mismo lugar sin iluminación para la sustracción de fondo. </li><li> Para determinar la densidad de proteína dentro de la bicapa, multiplicar la intensidad de píxel media de fluorescencia mayor fondo corregida determinada en la etapa 4 por el número de píxeles por cuadrado micras (por ejemplo, 41.5), por 100 (si se emplea un filtro ND con una DO de 2) o 1.000 (si un ND se utilizó filtro con un diámetro exterior de 3) y el tiempo de exposición utilizada en el paso 2 y se divide por la media de la señal única molécula determinada en el paso 3, el tiempo de exposición utilizada en el paso 2 y el número de fluoróforos por proteína. </li></ol> 5. Prueba de la integridad de la bicapa <ol><li> Preparar una bicapa fluorescente y colocarlo en la platina del microscopio como se describe anteriormente. </li><li> Ajuste el enfoque y tome la imagen de la bicapa en modo TIRF. Aplicar un corto pero intenso pulso de blanqueador en modo no TIRF para la ablación de la fluorescencia en un pequeño retorno de la inversión en forma de disco. </li><li> Tome una imagen de la bicapa en el modo de baja intensidad TIRF inmediatamente después del blanqueo y luego cada cinco a diez segundos para controlar la velocidad de recuperación de fluorescencia. </li><li> Move a un área diferente de la bicapa y siga los pasos 2 y 3. Tome otra imagen en el modo de TIRF baja intensidad 5 min después del impulso de lejía. Determinar la intensidad he puesto blanqueador en el área de lejía y lo comparo con la intensidad antes de blanquear I 0 al comienzo del experimento (sin blanqueo debería haber ocurrido) para calcular la fracción inmóvil (SI) de la siguiente manera: Fracción inmóvil IF (%) = (I 0 - Puedo publicar lejía) / (I 0 - fondo) x 100, con el fondo = intensidad medida en el retorno de la inversión sin luz de excitación aplicada El IF debe ser inferior a 10% (idealmente menos de 5%). </li></ol>

<ol><li>Walter, N. G., Huang, C. Y., Manzo, A. J., Sobhy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do-it-yourself+guide%3A+how+to+use+the+modern+single-molecule+toolkit%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Do-it-yourself guide: how to use the modern single-molecule toolkit.</a> Nat Methods. 5, 475-489 (2008).</li>
<li>Sahl, S. J., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+imaging+with+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence imaging with single molecules.</a> Current opinion in structural biology. 23, 778-787 (2013).</li>
<li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor-proximal+signals+are+sustained+in+peripheral+microclusters+and+terminated+in+the+central+supramolecular+activation+cluster%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster.</a> Immunity. 25, 117-127 (2006).</li>
<li>Kaizuka, Y., Douglass, A. D., Varma, R., Dustin, M. L., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+segregating+T+cell+receptor+and+adhesion+molecules+during+immunological+synapse+formation+in+Jurkat+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A.%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A.. 104, 20296-20301 (2007).</li>
<li>Wilson, B. S., Pfeiffer, J. R., Surviladze, Z., Gaudet, E. A., Oliver, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+mapping+of+mast+cell+membranes+reveals+primary+and+secondary+domains+of+Fc%28epsilon%29RI+and+LAT%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">High resolution mapping of mast cell membranes reveals primary and secondary domains of Fc(epsilon)RI and LAT.</a> The Journal of cell biology. 154, 645-658 (2001).</li>
<li>Lillemeier, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR+and+Lat+are+expressed+on+separate+protein+islands+on+T+cell+membranes+and+concatenate+during+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">TCR and Lat are expressed on separate protein islands on T cell membranes and concatenate during activation.</a> Nat Immunol. 11, 90-96 (2010).</li>
<li>Woof, J. M., Burton, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+antibody-Fc+receptor+interactions+illuminated+by+crystal+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures.</a> Nature reviews. Immunology. 4, 89-99 (2004).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> The Journal of cell biology. 89, 141-145 (1981).</li>
<li>Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAxelrod%2C+D+%22Methods+in+cell+biology%22">Methods in cell biology</a>. 89, 169-221 (2008).</li>
<li>Wieser, S., Moertelmaier, M., Fuertbauer, E., Stockinger, H., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%28Un%29confined+diffusion+of+CD59+in+the+plasma+membrane+determined+by+high-resolution+single+molecule+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">(Un)confined diffusion of CD59 in the plasma membrane determined by high-resolution single molecule microscopy.</a> Biophys J. 92, 3719-3728 (2007).</li>
<li>Huang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-rate+nanoscopy+using+sCMOS+camera-specific+single-molecule+localization+algorithms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms.</a> Nat Methods. 10, 653-658 (2013).</li>
<li>Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+measurement+by+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics.</a> Biophys J. 16, 1055-1069 (1976).</li>
<li>Axelrod, D., Burghardt, T. P., Thompson, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+Internal+Reflection+Fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Biophys.+Bioeng.%22%5BJournal%5D)">Total Internal Reflection Fluorescence.</a> Ann. Rev. Biophys. Bioeng.. 13, 247-268 (1984).</li>
<li>Huse, M., Quann, E. J., Shouts Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whispers+and+the+kiss+of+death%3A+directional+secretion+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Whispers and the kiss of death: directional secretion in T cells.</a> Nat Immunol. 9, 1105-1111 (2008).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Methods. 3, 793-795 (2006).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285, 221-227 (1999).</li>
<li>Bunnell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+ligation+induces+the+formation+of+dynamically+regulated+signaling+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">T cell receptor ligation induces the formation of dynamically regulated signaling assemblies.</a> J Cell Biol. 158, 1263-1275 (2002).</li>
<li>Sherman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+nanoscale+organization+of+signaling+molecules+downstream+of+the+T+cell+antigen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Functional nanoscale organization of signaling molecules downstream of the T cell antigen receptor.</a> Immunity. 35, 705-720 (2011).</li>
<li>Huppa, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR-peptide-MHC+interactions+in+situ+show+accelerated+kinetics+and+increased+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.</a> Nature. 463, 963-967 (2010).</li>
<li>Axmann, M., Schuetz, G. J., Huppa, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+TCR-pMHC+binding+using+a+FRET-based+microscopy+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring TCR-pMHC binding using a FRET-based microscopy assay.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2015).</li>
<li>Lillemeier, B. F., Schuetz, G. J., Pfeiffer, J. R., Surviladze, Z., Wilson, B. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane-associated+proteins+are+clustered+into+islands+attached+to+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A.%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane-associated proteins are clustered into islands attached to the cytoskeleton.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A.. 103, 18992-18997 (2006).</li>
<li>Natkanski, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+use+mechanical+energy+to+discriminate+antigen+affinities%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">B cells use mechanical energy to discriminate antigen affinities.</a> Science. 340, 1587-1590 (2013).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen ningún interés financiero en competencia.

Microscopía sola molécula ofrece la oportunidad única de estudiar el comportamiento de las proteínas dentro de su entorno celular nativo. La imagen molecular se convierte, por tanto, cada vez más atractivo a una amplia comunidad científica, sin embargo, muchos científicos de la vida todavía se esconden de la inversión inicial en tecnología y experiencia. El principal beneficio que surge de montaje de la propia sistema de imágenes es que se puede ajustar fácilmente a las necesidades específicas de cualquier persona. Como se sugiere en este documento una TIRF no haz de excitación se puede implementar fácilmente, además de una trayectoria de la luz TIRF existente, si se desea la foto-blanqueamiento rápido y definido (o-activación) de fluoróforos y ligandos, por ejemplo, cuando se realiza FRAP o ligando experimentos uncaging 14 . La introducción de un divisor de haz de emisión permite la grabación simultánea de al menos dos y en algunos casos hasta cuatro canales fluorescentes. La lista de extensiones es, en esencia, sólo limitado porla propia imaginación. Por ejemplo, la implementación de una rueda de filtros de emisión motorizado en la vía de emisión permite el cambio rápido entre hasta diez canales fluorescentes diferentes. Cuando se combinan dos motorizados ruedas de filtros de emisión (cada una equipada con ranuras 10 de filtro) en la serie, hasta 18 canales fluorescentes puede ser leída. Formación de imágenes basada en TIRF se puede complementar con mediciones de la movilización del calcio y la interferencia Reflexión Microscopy (IRM) después de la integración de un camino de excitación de la lámpara de Xenón o Mercurio. IRM es el método de elección para visualizar el grado en el cual las células se unen a la superficie de cristal o un SLB y por lo tanto pueden proporcionar información crítica al interpretar los datos de imagen basados ​​en TIRF. El establecimiento de un haz de excitación se abrieron con el uso de un sencillo espejo dicroico y un láser de 405 nm adicional de la realización de la microscopía permite la localización de fotoactivación (PALM) o estocástico microscopía óptica de reconstrucción (STORM), es decir, dos superresolutmetodologías de iones con una precisión de posición por debajo del límite de difracción de la luz visible 15,16. Sin embargo, el éxito experimental no sólo es una cuestión de hardware adecuado. Para sacar el máximo provecho de las imágenes basadas en TIRF de ruido reducido, las células deben hacer contacto a una superficie de una manera que no impone restricciones sobre la superficie de la célula o que interfiera con la fisiología de la membrana plasmática. SLBS funcionalizado con proteínas adecuadas para la adhesión celular están excediendo muy adecuado para este propósito porque todos los ligandos incrustados-SLB son lateralmente móvil y ajustar su posición lateral dentro de la bicapa en respuesta al receptor de la dinámica de unión y la segregación. Para fabricar SLBS de una manera reproducible, lo mejor es comenzar con los SUV de gran pureza. Como se describe aquí, es por lo tanto crítico para eliminar vesículas multilamelares, que también se producen durante la sonicación, en dos etapas de ultracentrifugación como éstos interfere con la formación de SLBS contiguas que ofrecen alta fluidez. SLBS de forma de alta calidad sólo en superficies de vidrio limpio. Una vez portaobjetos de vidrio limpio se debe utilizar inmediatamente o almacenar en vacío. Es importante destacar que SLBS nunca deben ser expuestos al aire ya que esto daría lugar a su interrupción. Lavado SLB implica, como se muestra, tampón de enjuague con el uso de una pipeta serológica, ya que esto no es sólo un procedimiento de salvar pero también de ahorro de tiempo. Durante la cosecha y purificación de proteínas SLB-residentes el uso de detergentes debe ser evitado. Esto es porque detergente reducirá significativamente la movilidad de proteínas incluso cuando están presentes en cantidades traza. Para evitar la necesidad de detergente todos juntos, se recomienda la expresión soluble de ligandos etiqueta equipado polihistidina secretada en células de mamíferos o insectos. Si se requiere el replegamiento de cuerpos de inclusión de E. coli, la precaución debe aplicarse para eliminar detergentes efectivamente de los cuerpos de inclusión antes de su desempleo y replegamiento. Una importante ventaja de emplear SLBS resultados de su naturaleza modular y reconstituyente, que permite diseccionar específicamente el papel de una interacción receptor-ligando dado para la activación celular y la adhesión celular. En este sentido, es importante mencionar que DGS NTA-Ni debe estar presente en 10% dentro de la SLB con el fin de evitar que las proteínas que compiten por los sitios de unión NTA-NI. Cuando se emplea SLBS que albergan sólo el 1% o 2% DGS NTA-Ni, una reducción en la asociación de las especies proteicas un determinado marcada con polihistidina se puede notar, especialmente cuando se co-incubación de cantidades crecientes de una segunda especie de proteína-polihistidina etiquetado (inédito observación). Este fenómeno no se observa cuando se trabaja con SLBS ofrecen el 10% DGS NTA-Ni. Aunque nunca hemos observado la unión no específica de cualquier proteína-polihistidina etiquetado probado para SLBS contienen DGS NTA-Ni, esta posibilidad debe ser probado en la introducción de una proteína, por primera vez,Para ello se recomienda el uso de SLBS carentes de DGS NTA-Ni (la proteína no debe obligar). En segundo lugar, cuando se utiliza un SLB contiene DGS NTA-Ni, la proteína debe salir por completo después de lavar la SLB con PBS que contenía imidazol 300 mM. Otra ventaja significativa de emplear SLBS es que las interacciones transitorias y eventos de señalización pueden ser monitoreados con resolución mejorada 17-19 de espacio-temporal. Esto es al menos en parte debido a un proceso de unión tridimensional se reduce esencialmente a dos dimensiones de imagen, especialmente cuando se graba en el modo de TIRF ruido atenuado. El uso de SLBS es compatible con la detección de señales sola molécula, un requisito previo para la microscopía foto activadas localización (PALM) o estocástico microscopía óptica de reconstrucción (STORM), es decir, la microscopía de super-resolución con una resolución por debajo del límite de difracción 15,16. Estas modalidades especiales de imagen permiten sola molécula Förster Resonancia Energía Traexperimentos nsfer diseñados para visualizar las interacciones individuales proteína-proteína en un entorno sináptica 20. Este enfoque se explica en considerable detalle en una publicación JoVe denominado 21 &quot;Medición de la unión usando un ensayo de FRET a base de microscopía de TCR-pMHC&quot;. Al interpretar los experimentos basados ​​en SLB uno siempre debe tener en cuenta que no todas las propiedades de una membrana plasmática de una célula viva se caracterizan por SLBS, y que algunas de las cualidades que faltan pueden afectar la fisiología bajo investigación. Después de todo, las proteínas incrustadas-SLB están difundiendo libremente y no organizados en microdominios de membrana como la mayoría de sus homólogos celulares son 5,6,22. Hojas de membrana de plasma inmovilizada derivadas de células adherentes, que conservan la arquitectura membrana plasmática de las células vivas en cierto grado, se han empleado con éxito para estudiar la captación de antígenos de membrana embebido por los linfocitos B 23. Sin embargo, incluso talesmembranas no interactúan con un citoesqueleto muy dinámico y cuentan con ninguna flexibilidad, ya que se apoyan en una superficie de vidrio rígido. En vista de estas discrepancias existe una clara necesidad de SLBS ingeniería, que ofrecen medios para compartimentar las proteínas de una manera definida y que se apoyan en superficies de flexibilidad ajustable o por superficies que cambian su rigidez en respuesta a pulsos de luz aplicados localmente.

La comprensión de los mecanismos por los que las proteínas de membrana cumplen su función celular a menudo puede ser una tarea difícil, porque sus modos de acción se definen a menudo por las interacciones de afinidad baja, que son difíciles de detectar y evaluar mediante metodologías bioquímicas convencionales. Las proteínas de membrana pueden además ser altamente enriquecido en dominios específicos de membrana 5,6 o formar estructuras de orden superior dinámicos, que pueden, en principio, alterar su actividad biológica 7. Tanto sola molécula de microscopía de fluorescencia láser asistida no invasiva se ha convertido en la metodología de elección para estudiar el comportamiento de proteínas en entornos celulares complejos. Esto es especialmente cierto para los procesos bioquímicos que tienen lugar en la membrana plasmática, ya que pueden, en principio, ser controlados en el modo de reducción de ruido reflexión interna total (TIRF). Aquí iluminación de la muestra se restringe a una rebanada de hasta 200 nm-delgada en las proximidades de un vaso surface, lo que resulta en una pérdida significativa en el fondo celular y, debido a las características de la luz de excitación evanescente, también en un aumento sustancial en la intensidad de señal de fluorescencia 8,9. Ambos aspectos son importantes cuando se pretende para alta resolución posicional y temporal en la detección de moléculas individuales. Planar SLBS no sólo son compatibles con la microscopía TIRF. Cuando funcionalizado con ligandos adecuados que también proporcionan acceso directo al estudio de la dinámica molecular de reconocimiento célula-célula a medida que ocurren en las células inmunes u otras células. También pueden ser simplemente utilizadas para posicionar células móviles y por lo demás no adherentes lo suficientemente cerca para el portaobjetos de vidrio de modo que tales células se pueden obtener imágenes en la iluminación TIRF, que es altamente deseable cuando los experimentos de conducción que implican seguimiento molécula simple o simple superresolución a base de molécula. Con este fin proteínas tienen que ser cargado en un SLB altamente móvil. Una ventaja inherente de la li utilizado<html> Los PID son que no hay unión no específica de proteínas en absoluto. Por otra parte, SLBS pueden considerarse como líquidos de dos dimensiones con una capacidad inherente de curarse a sí mismos; irregularidades en el soporte de vidrio se compensan hasta un cierto grado. Un protocolo paso a paso se proporciona para generar bicapas altamente móviles encargadas de proteínas de interés. La formación de SLBS planas se describe, que contienen 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) como el ingrediente principal (de 90-99%) y el sintético y funcionalizado de lípidos de 1,2-dioleoyl- sn -glicero-3 - {[N (5-amino-1-carboxipentil) iminodiacético ácido] succinil} sal de níquel (DGS NTA-Ni) en baja abundancia (1-10%). POPC lleva un ácido graso saturado y un ácido graso monoinsaturado y forma bicapas lipídicas de alta fluidez incluso a RT. DGS NTA-Ni se une con su grupo de cabeza a las colas de poli-histidina y sirve como anclaje para proteínas etiquetadas-poli-histidina de elección (Figura 1). &quot;&gt; Es importante destacar que el hardware microscopía debe incluir un número de periféricos que se describen a continuación. Con la información proporcionada y algunos conocimientos básicos de la óptica y la física láser, cualquier biólogo debe ser capaz de construir una sola configuración de imágenes molécula. Excitación de la muestra debe ser idealmente realizado en un microscopio invertido en el modo de reflexión interna total (TIRF) como este régimen reduce la luz espuria y el fondo excesivo resultante de otra forma de celular autofluorescencia 9. Para ello, un objetivo especial TIRF capaz (ver más abajo) y se necesitan iluminación láser. Algunos experimentos requieren tiempos de iluminación dentro del rango de milisegundos y operado en una sucesión rápida. Para ahorrar tiempo de iluminación o para evitar el blanqueo innecesario causado por iluminación repetitivo a menudo es útil para dividir la luz emitida en dos o más canales espectrales. Esto permite una lectura simultánea de dos o más perfiles de emisión, que pueden convertirse en un factor significativo cuando CONDUCting experimentos que implican transferencia de energía de resonancia Förster (FRET). Aquí la emisión resultó de un impulso de luz de excitación solo se puede grabar tanto del donante FRET y FRET aceptora (como la emisión sensibilizada). La cámara debería capturar suficientes fotones con suficientemente bajo fondo para visualizar fluoróforos individuales durante el tiempo de iluminación. Aplicaciones informáticas tendrá que estar preparado para la tarea de sincronizar cierre de excitación y de adquisición de imágenes. Una visión global se da a continuación y en la Figura 2: Objetivo a TIRF capaz: Para la iluminación TIRF basada en el objetivo de la apertura numérica (NA) del objetivo debe ser igual o mayor que 1,4 utilizando portaobjetos de vidrio estándar (n = 1,515) 9. La ampliación puede oscilar entre 60x a 150x. El objetivo debe ser corregida cromáticamente para permitir confocalidad cuando la formación de imágenes diferentes fluoróforos. Láseres: El número de lase disponiblesOpciones R ha aumentado significativamente en los últimos años. Modernos láseres de onda continua de diodos electrónicamente modulables son rentables y pueden funcionar con frecuencia y velocidad sin precedentes. Más caros láseres de iones de gas sobresalen en la calidad del haz láser, pero requieren de obturación externo (véase más adelante) y, a menudo extensa (agua) de refrigeración. Persianas de Excitación: moduladores acústico-ópticos (OMA) permiten cierre rápido en rápida sucesión 10. Para apretado cerrando la combinación de un AOM con los obturadores mecánicos se recomienda. De esta manera extensa calentamiento de la OMA debido a la exposición de luz continua se evita y la luz se escape de la OMA en el fuera de posición se anula. Las lentes se utilizan para ampliar haces de láser y para enfocar ellos sobre el plano focal posterior del objetivo. De esta manera, la luz de excitación sale del objetivo como un haz paralelo (Figura 3), que se requiere para la iluminación de TIRFla muestra. Moviendo el punto focal dentro del plano focal posterior desde el centro a la periferia del objetivo va a cambiar el ángulo en el que el haz sale del objetivo, pero no la ubicación del punto de láser en la muestra (Figura 3), que es una función de la geometría de haz global. Iluminación TIRF sobreviene en un ángulo crítico, que se puede ajustar utilizando un conjunto de espejos que funcionan como un periscopio para traducir el punto focal del láser dentro del plano focal del objetivo. Las lentes deben ser corregidas cromáticamente y se pueden utilizar en un conjunto de dos o tres lentes. Un sistema de tres lente consiste en dos lentes que actúan como un telescopio para ensanchar el haz de láser (y por lo tanto el punto de iluminación en la muestra) y una tercera lente para enfocar el haz ensanchada en el plano focal posterior del objetivo (Figura 4). Ambas funciones (telescopio y de enfoque) también se puede lograr por una combinación de sólo dos lentes (véase la figura 4). Espejos debe ser de al menos el 95% reflectante para evitar la pérdida de la luz láser. Para cada ajuste del haz de un conjunto de dos espejos se aplica normalmente como tal disposición es suficiente para ajustar con precisión cualquier ángulo y la posición de un rayo láser. Superposiciones dicroicos reflejan y transmiten la luz de diferentes longitudes de onda específicas y se utilizan para superponer o dividir los haces de dos láseres. Filtros Polychroic son más complejos que los filtros dicroicos y son necesarias para reflejar la luz de excitación de entrada y salida de transmitir luz de emisión de la muestra. Se colocan en el cubo de filtro entre el objetivo y la lente del tubo del microscopio. Limpie los filtros: Dependiendo del tipo de employe láser d láser limpiar los filtros con un ancho de banda de transmisión estrecha debe ser colocado en el haz de láser justo después de que sale del láser. Filtros Notchestán diseñados para absorber con eficacia la luz láser con un ancho de banda estrecha y transmitir toda otra luz. Se colocan dentro de la trayectoria de emisiones para filtrar cualquier luz de excitación láser espuria. Sin embargo, filtros de corte funcionan sólo a 0 ° de ángulo de entrada. Si la anchura de banda del filtro de corte es muy fuerte, los diferentes ángulos entrantes no pueden reflejarse más. El bloqueo de la luz láser láser colimado no se ve afectada, pero la luz retrodispersada no puede ser obstaculizada de manera eficiente de llegar a la cámara. Ruedas de filtros motorizados equipados con ruedas de filtros adecuados se pueden colocar fácilmente en la vía de excitación y de emisión y permiten conmutación simple entre diferentes intensidades de luz (cuando está equipado con filtros ND) o canales fluorescentes (cuando se coloca delante de una lámpara de arco de xenón o de mercurio para radiométrica imágenes de calcio o delante de la cámara para seleccionar el fluoróforo emisor de luz). 50:50 cubo divisor de haz cun ser utilizado para dividir rayos láser en dos trayectorias de rayos de excitación separados y también para combinarlos en frente del periscopio. Divisor de haz (camino de emisión): Para la adquisición rápida de imágenes sin necesidad de cambios de filtro físico, el haz de emisión se divide en un canal azul-cambiado y desplazada al rojo. En principio, divisores de haz pueden ser construidos mediante el empleo de una cuña dicroico o un conjunto de espejos y un espejo dicroico para separar el haz de emisión de una manera dependiente de la longitud de onda. Se necesitan dos filtros de emisión para limpiar los canales emitidos. Filtro espacial: filtrado espacial del haz de excitación es a veces necesaria para eliminar los rayos de luz no paralelos emitidos por rayos láser de baja calidad. Un filtro espacial consiste en un telescopio de dos lentes con un pequeño agujero de alfiler colocado exactamente en el punto focal de ambas lentes. Esta luz espuria manera resultante de las porciones no paralelos del haz de láser se bloquea de manera eficiente. Such condiciones se deben cumplir al establecer la microscopía basada en TIRF. Aumentos filtrado espacial con poros más pequeños, que son más difíciles de colocar en el punto focal, y con distancias focales más pequeñas de la primera lente. Para reducir los efectos causados ​​por aberraciones de la lente es ventajoso emplear en lugar de simples lentes de alta calidad y objetivos de microscopio infinito-corregida con bajo aumento (10x o 20x). Periscopio: Una configuración periscopio es necesario traducir el rayo láser enfocado en el plano focal del objetivo, un requisito previo para la imagen TIRF. Puede ser fácilmente construido a partir de dos espejos de dos pulgadas, una etapa de traslación para ajustar el primer espejo y un poste para posicionar el segundo espejo para reflejar la ensanchado y centrado haz de excitación en el microscopio (Figura 5). Cámara: Back-iluminado Electron-Multiplicación de dispositivos de carga acoplada (EMCCD) se utilizan rutinariamente parala grabación de señales sola molécula. Esto es debido a su alta eficiencia cuántica (hasta 95%), alta velocidad de adquisición (hasta 30 MHz) y comparativamente bajo nivel de ruido. Enfriamiento hasta -80 ° C reduce el ruido térmico y con el apoyo de una serie de cámaras EMCCD actualmente disponibles. Una limitación de la tecnología es que EMCCD ruido de la cámara aumenta linealmente con la tanto la ganancia de la cámara y la señal que está siendo capturado. Este no es el caso con las cámaras científicas CMOS (sCMOS), que son significativamente menos caros y operan debido a la arquitectura especial del chip sCMOS también mucho más rápido que las cámaras EMCCD. Sin embargo, un problema asociado con la tecnología CMOS es que la adquisición de imágenes todavía carece de un cierto grado de una lectura cuantitativa en un solo nivel molécula, debido a que cada pixel cuenta con diferente sensibilidad de detección. En principio esto se puede compensar a través de la normalización pixel, pero este procedimiento no es en absoluto triviales 11. Es por eso que todavía dudamos en volverfelicitar cámaras sCMOS para microscopía sola molécula, pero en vista de la rápida evolución de esta tecnología, cámaras sCMOS pronto podría convertirse en la cámara de elección. Slow cámaras cámaras CCD de escaneo de evitar el ruido y píxeles de varianza relacionados amplificación todos juntos y soportan velocidades de adquisición más rápidos si se pueden operar en un modo denominado &#39;cinético&#39;. En este modo todo el chip de la cámara a excepción de una región de interés (ROI) está enmascarado, que hace que sea posible emplear el propio chip como un dispositivo de almacenamiento. Tras el retorno de la inversión se expone por primera vez, los cargos resultantes se desplazaron a la zona enmascarada de la línea de píxeles de chips por línea de píxeles, donde la imagen está protegida de mayor exposición a la luz. Una vez que el desplazamiento de todas las líneas de la ROI en la región enmascarada se ha completado (en el rango sub-milisegundos), el propio ROI está listo para la próxima exposición. Este ciclo se repite hasta que se cargan todas las líneas de píxeles del chip CCD. El chip se lee a continuación lentamente con marcadamente reduruido de lectura ced. Por ejemplo en un chip de 1000 x 1300 píxeles, 20 ROIs de 50x50 píxeles se pueden grabar en una sucesión rápida. Debido a que las imágenes permanecen en el chip durante un tiempo considerable antes de ser leído, es crítico para asegurar el enmascaramiento de alta calidad y para enfriar la cámara (por ejemplo, con nitrógeno líquido) como un medio para reducir el ruido térmico excesivo. Algunas cámaras EMCCD también soportan el modo de cinética. Software: El tiempo de los láseres, persianas, AOMS y exposición de la cámara, así como el almacenamiento de imágenes adecuado son esenciales para cualquier experimento de imágenes exitosa. En principio muchas operaciones definidas se pueden programar con paquetes de software disponibles que vienen con la cámara. Paquetes de software comerciales soportan un gran número de periféricos de hardware, que pueden ser implementadas con poco conocimiento técnico. Generador de impulsos, adquisición de datos (DAQ) (con canales analógicos y digitales de salida) y el osciloscopio: Un generador de pulso es unexcelente elección para convertir impulsos de disparo en impulsos de tiempo y tensión definida. De esta manera los láseres pueden ser controladas precisamente por la potencia de salida y sincronizados en el milisegundo de rango sub-milisegundo. Tarjetas DAQ con salidas analógicas lograr lo mismo y se integran fácilmente en la placa base del ordenador a través de las ranuras PCI. La duración del impulso, amplitud y frecuencia se verifican con un osciloscopio. Recinto de toda la trayectoria del haz de excitación: Para evitar las fluctuaciones en el perfil de excitación debido a convecciones de aire la ruta completa haz de excitación debe ser encerrado de su entorno de laboratorio. Esta medida es especialmente importante cuando se realiza la microscopía TIRF. Componentes ópticos también están protegidos del polvo y el ojo humano de exposición a la luz láser. Recintos pueden construir fácilmente de cartón negro, que se puede comprar en las tiendas de artes. Para determinar la fluidez de la recuperación SLB fluorescencia después Photobleaching (FRAP) medidas 12 se llevan a cabo. Para FRAP la existencia de dos trayectorias de rayos de excitación es aconsejable (véase la Figura 3). La primera trayectoria de rayos está diseñado para la imagen de la fluorescencia de la bicapa. Esto se puede hacer en la configuración TIRF y con baja intensidad de luz. La segunda trayectoria del haz debe permitir una breve pero intensa pulso blanqueador y debe ser configurado en modo no TIRF, para que salga el objetivo a lo largo del eje óptico. Una abertura redonda se puede colocar en la trayectoria del haz de excitación (véase la figura 8) para proyectar un perfil blanqueador perfectamente redondo con bordes definidos. Con el fin de imagen de esta abertura sobre el plano de objeto, su posición óptima sería en el plano focal de la lente 3 (véase la Figura 3). Sin embargo, debido a la longitud focal larga de esta lente, una imagen de abertura de suficiente calidad puede también ser generado, cuando la abertura se coloca en posiciones ligeramente desplazadas. Después de haber realizado tque la formación de imágenes experimento los datos en bruto deben ser analizados apropiadamente. Varios protocolos paso a paso se ofrecen, que cubre el ajuste de los parámetros principales (por ejemplo, potencia de iluminación y de tiempo, ángulo TIRF), adquisición y análisis de los datos.

<table><tbody><tr><td>#1.5 portaobjetos de vidrio</td><td>VWR</td><td>631-0853</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de fondo redondo de 250 ml</td><td>VWR</td><td>201-1357</td><td></td></tr><tr><td>Cubos divisores de haz 50:50</td><td>Thorlabs</td><td>BS013</td><td></td></tr><tr><td>Modulador acústico-óptico C1205-2</td><td>Solo es necesario isomet</td><td></td> <td>si se utilizan láseres CW, que no se pueden modular,</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-NHS</td><td>Life technologies</td><td>A-20000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-NHS</td><td>Life technologies</td><td>A-20009</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-NHS</td><td>Life technologies</td><td>A-20006</td><td></td></tr><tr><td>cinta de autoclave</td><td>VWR</td><td>489-1312</td><td>o cualquier otra cinta adhesiva termoestable</td></tr><tr><td>Avanti Mini-Extruder Avanti</td><td>Lipids</td><td>610000</td><td>alternativa al sonicador de baño sonicador</td></tr><tr><td>de baño QSONICA Q700</td><td>QSONICA</td>divisor de haz <td>Q700</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cairn</td><td>P280/210/MLS</td><td></td></tr><tr><td>B&uuml; evaporador rotativo chi</td><td>VWR</td><td>531-0837</td><td></td></tr><tr><td>cámara</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra 897</td><td>ver texto manuscrito para alternativas</td></tr><tr><td>de peróxido de hidrógeno concentrado</td><td>Roth</td><td>9683.1</td><td></td></tr><tr><td>ácido sulfúrico concentrado</td><td>Roth</td><td>X944.2</td><td></td></tr><tr><td>pegamento epoxi</td><td>Uhu</td><td>45705</td><td>Uhu plus sofortfest 2min</td></tr><tr><td>rueda de filtros</td><td>Sutter instrumentos</td><td>Lambda 10-2</td><td></td></tr><tr><td>LabTek cámaras VWR</td><td></td><td>734-2062</td><td></td></tr><tr><td>láser&nbsp;</td><td>Toptica-diferentes</td><td></td> <td>variantes (longitudes de onda 375 - 785 nm) están disponibles</td></tr><tr><td>lente</td><td>Thorlabs, Newport-DGS</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>NTA-Ni (lípido)</td><td>Avanti Lipids</td><td>790404C</td><td>ya está en Choroform-solved se recomienda la versión entregada de la variante de sal nicekl</td></tr><tr><td>POPC (lípido)</td><td>Avanti Lipids</td><td>850457C</td><td>ya en Choroform-se recomienda</td></tr> <tr><td>la versión entregadamicroscopio Zeiss Axiovert 200</td><td>Zeiss-espejos</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E02</td><td></td></tr><tr><td>filtros ópticos</td><td>AHF, Chroma, Semrock-juegos</td><td></td> <td>de filtros están disponibles para muchas combinaciones diferentes de colorantes</td></tr><tr><td>osciloscopio</td><td>BK Precision&nbsp;</td><td>2120C</td><td></td></tr> solución <tr><td>salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Life technologies</td><td>14190-136</td><td>desgasificación antes del uso</td></tr><tr><td>periscopio</td><td>Thorlabs</td><td>RS99/M</td><td></td></tr><tr><td>picodent twinsil 22</td><td>Picodent</td><td>13001000</td><td>alternativa al medidor de potencia de pegamento epoxi</td></tr><tr><td>Lasermate-Q</td><td>Coherent</td><td>:</td> <td>cualquier medidor de potencia sensible en el rango espectral utilizado servirá</td></tr><tr><td>generador de impulsos</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SRS DG535&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>filtro espacial</td><td>Thorlabs</td><td>KT310/M</td><td></td></tr><tr><td>filtro de jeringa 0.2&micro; m</td><td>Millipore</td><td>GVWP04700</td><td></td></tr><tr><td>objetivo apocromático compatible con TIRF 100x, NA 1.46</td><td>Zeiss</td><td>440782-9800-000</td><td></td></tr><tr><td>tubos de triclorometano/cloroformo</td><td>Roth</td><td>3313.1</td><td></td></tr><tr><td>para policarbonato por ultracentrifugación 1,00 mm, 11 mm x 32 mm&nbsp;</td><td>Ultracentrífuga Thermo Fisher</td><td>45237</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall&nbsp;</td><td>Rotor</td> ultracentrífugo Thermo <td>Fisher RC M150GX</td><td></td></tr> Espectrofotómetro UV <tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>S120-AT2</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000c</td> Bomba <td>de</td><td></td> vacío <td>Thermo Fisher</td></tr> <tr><td></td><td>VWR</td><td>181-0248</td><td></td></tr></tbody></table>

bilayers individual molécula microscopía de fluorescencia en planar compatibles

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

En el transcurso de una sola década, la microscopía de una sola molécula ha pasado de ser un dominio aislado compartido únicamente por físicos con una sólida formación en óptica y física láser a una disciplina que ahora está disfrutando de una vívida atención por parte de los científicos de la vida de todos los lugares 1. Esto se debe a que las imágenes de una sola molécula tienen el potencial único de revelar el comportamiento de las proteínas in situ en células vivas y descubrir la organización celular con una resolución sin precedentes por debajo del límite de difracción de la luz visible 2. Las bicapas lipídicas planas (SLB) soportadas por vidrio son una herramienta poderosa para acercar las células que de otro modo crecerían en suspensión lo suficientemente cerca del portaobjetos de vidrio para que puedan obtenerse fácilmente en el modo de iluminación de reflexión interna total con reducción de ruido 3,4. Son muy útiles para estudiar la dinámica de las proteínas en eventos asociados a la membrana plasmática tan diversos como la formación de contacto célula-célula, la endocitosis, la exocitosis y el reconocimiento inmune. Se presentan procedimientos sencillos sobre cómo generar SLBs funcionalizados a proteínas altamente móviles de manera reproducible, cómo determinar la movilidad de las proteínas dentro de ellas y cómo medir las densidades de las proteínas con el uso de la detección de una sola molécula. Se muestra cómo construir un sistema de microscopía de molécula única rentable con capacidades de iluminación TIRF y cómo operarlo en el experimento.

La arquitectura del sistema de microscopía de fluorescencia de una sola molécula se describe en considerable detalle en la figura 2. Las piezas individuales tales como los componentes ópticos y otros componentes de hardware se explican en la introducción. Las trayectorias de los rayos ópticos de excitación, que dan lugar de una manera definida de TIRF y la iluminación no TIRF, se muestran y explican en las figuras 3 a 5. Nota la ubicación del divisor de haz 50:50 delante del espejo colocado en primera periscopio una etapa traducible micrómetro (Figura 5). Este divisor de haz superpone el haz TIRF utilizado para la formación de imágenes (indicado en verde) y la viga no TIRF (indicado en rojo) que se utiliza para el blanqueo o la activación de la muestra luz mediada por la abertura definida por el local (tal como se indica en la Figura 3). Los caminos combinados de luz (Figura 5, indicados en naranja) se reflejan a través del segundo espejo periscopio en el puerto posterior de la micr invertidaoscope. Como se explica en la Figura 4 y se indica en la Figura 2, la implementación de dos o tres lentes convexas ensancha los perfiles de rayo láser y se enfoca los rayos láser en el plano focal posterior del objetivo de dar lugar a dos haces colimados iluminando la muestra en TIRF y , respectivamente, en no TIRF. Un ejemplo para los valores de intensidad medidos requeridos para el cálculo de la densidad de potencia sobre el espécimen se muestra en la Figura 6. La media de la señal de fondo que se sustrae de intensidades medidas en la zona iluminada y central (utilizado para la formación de imágenes), se determina en una región dentro de la campo de visión, que no está iluminada por el haz de láser (en este caso 7089 cuentas). Los antecedentes corregido intensidades medias de los recuentos de iluminación (1684) y el área central (4830 cuentas) se multiplican por los tamaños región correspondiente para dar lugar a intensidades integradas (1,471x 10 8 conteos de la zona iluminada y 3.424 x 10 7 recuentos de la zona central). La relación de las intensidades integradas dentro de las regiones central y sistema de iluminación produce la fracción de la potencia total que ilumina la zona central (0,23 o 23%). Como se muestra en la película, la potencia total tiene que ser determinada en el objetivo con el uso de un medidor de potencia en el modo de iluminación no TIRF. En nuestro ejemplo se ajusta a 5 mW, lo que daría lugar a una potencia de 5 mW x 0,23 = 1,15 mW dentro de la zona central. Desde 41,5 píxeles cantidad en nuestro ejemplo a 1 m 2, el área central tiene un tamaño de 7089 pixeles /41.5 píxeles x 2 micras = 170,8 m 2. La división de la potencia de la luz que ilumina el área central (1,15 mW) por esta área (170,8 m 2) se obtiene una potencia mediadensidad de 0,7 kW / cm 2 dentro de la zona central. Figura 7 muestra imágenes y resultados de intensidad correspondientes de fluoróforos individuales adquiridos en rápida sucesión (100 fotogramas por segundo, es decir, con un marco de tiempo de 10 ms). Para la cuantificación de intensidad de la señal media de una región rectangular de siete por siete (= 49) píxeles, que cubre la señal de fluorescencia, se determina. Además, la media de la señal del fondo se determina dentro de una región rectangular de siete por siete píxeles en las proximidades de la señal de una sola molécula. La señal de fondo media corregida se multiplica por el número de píxeles dentro de la región (= 49) para dar lugar a la señal de una sola molécula (marcada en negrita). Un experimento FRAP representante diseñado para evaluar la movilidad de las proteínas marcadas con fluorescencia asociados-SLB se muestra en la Figura 8. Nota en la figura 8A la repetitiva uso de un haz de formación de imágenes de baja intensidad ensanchado y el uso individual de un segundo más estrecho y la abertura definida luz alta intensidad para la ablación fluorocromo rápida en el segundo punto de tiempo cero. Intensidades media de fondo-resta dentro del círculo amarillo, que han sido normalizado por el valor de intensidad media inicial antes del pulso lejía, se representan gráficamente en la Figura 8B contra el tiempo para registrar la velocidad y grado en el que la fluorescencia se ha recuperado. Como se muestra, más del 90% (indicado por la línea verde) de la intensidad inicial bicapa se ha recuperado dentro de 75 segundos después de la ablación fluorocromo. Como consecuencia de menos de 10% de las proteínas embebidas en el SLB mostrado son inmóviles. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema Esquema de un sistema SLB. SLBS (A) están hechos de POPC (90-99%) y el lípido sintético DGS NTA-Ni (1-10%). Ellos forman espontáneamente cuando las superficies de vidrio limpias están acusados ​​de los SUV que consisten en los lípidos correspondientes. (B) Una vez formados, estos SLBS pueden ser fácilmente decoradas con proteínas solubles extendidas, ya sea con un solo C- o etiqueta N-terminal que contiene doce histidinas (12H, por ejemplo la molécula co-estimuladoras B7-1 y la molécula de adhesión ICAM-1 dímeros) o proteínas ampliar con dos etiquetas que contiene seis histidinas cada uno (2x6H, por ejemplo, un dímero αβMHC clase II). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig2.jpg" /> Figura 2. Visión general de las trayectorias de excitación y de emisión. Haz láseres de iones gas (por ejemplo Ar + o Kr +) puede ser operado para cerrar rápido con el uso de mo óptico acústico<html> dulators. Láseres diodos son hoy en día disponibles en muchas longitudes de onda y representan una excelente alternativa, ya que pueden ser moduladas por vía electrónica en el microsegundo-rabia. Tenga en cuenta que los rayos láser se pueden ajustar fácilmente con dos (dicroicas) espejos y dividir y combinar con el uso de divisores de haz simples para dar lugar a dos o más trayectorias de rayos. En este ejemplo un haz de formación de imágenes TIRF (a supervisar los eventos) y un haz de blanqueo (a uno o fluoróforos de blanqueo foto-activar las moléculas enjaulado en una manera definida por la abertura) se utilizan. Ambos caminos de excitación pueden ser operados independientemente uno de otro mediante el uso de obturadores adicionales. El periscopio permite la traducción de los rayos láser enfocados en el plano focal posterior del objetivo para generar iluminación TIRF de la muestra. La imagen fluorescente se puede dividir espectralmente con el uso de un divisor de haz de emisión antes de la adquisición con el uso de una cámara ultra-sensibles (por ejemplo EM-CCD o una cámara CMOS científica)..com / files / ftp_upload / 53158 / 53158fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig3.jpg" /> Figura 3. Ajuste de iluminación TIRF traduciendo el haz enfocado dentro del plano focal posterior del objetivo. Como se muestra en el punto focal del haz de láser se desplaza dentro del plano focal posterior del objetivo desde el centro hacia la periferia a través de la translocación de la viga (usando una disposición de espejos periscopio). Como resultado, un haz paralelo sale del objetivo en una iluminación inclinada hasta que se alcanza un ángulo crítico en el cual ocurre la reflexión interna total. El campo evanescente se genera en la interfase vidrio-media, donde se produce la reflexión total. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig3large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta fi</a><html> gura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig4.jpg" /> Figura 4. sistemas ópticos sencillos para enfocar el haz láser en el plano focal posterior del objetivo. Cualquiera de tres o dos lentes son necesarios para ensanchar el haz de láser y para enfocar en el plano focal posterior del objetivo TIRF. Dos sistemas de lentes contienen menos errores de lente asociado que los sistemas de tres lentes y podrían ser más adecuados para generar el haz de formación de imágenes TIRF. Tres lentes podrían ser preferible cuando el objetivo de la ampliación del haz definido y un punto de iluminación con bordes afilados, como sería necesario para los estudios que emplean la foto-activación o -bleaching. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> /53158fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. anotado fotografía de la trayectoria del haz en la parte posterior del microscopio de fluorescencia. Como ya se indica en la Figura 2 una caña de una implementar fácilmente dos haces de excitación, uno en TIRF (indicado en verde) la otra en modo no TIRF (indicado en rojo). Estos se convierten en superpuesta con el uso de un divisor de haz de 50:50 (BS). Las lentes convexas (L1 y L2) están situadas en los respectivos haces de ellos para centrarse en el plano focal posterior del objetivo (no mostrados). Un periscopio que consiste en dos espejos (M1 y M2) guía ambos haces a través del puerto de entrada en el microscopio. El primer espejo (M1) puede ser movido con el uso de una etapa de traducción (TS) (girando un tornillo micrométrico como se indica) para mover una de las vigas en su posición TIRF. Una vez TIRF se ha establecido, el segundo haz (utilizado para la foto-blanqueo o-activación, aquí se indica en rojo) se puede ajustar independientemente de la viga TIRF que salir del objetivo en la no-TIRFde modo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig6.jpg" /> Figura 6. Medir el poder dentro de la zona central del punto de iluminación. Como se indica eligió regiones apropiadas de interés, que reflejan el fondo, toda la zona iluminada (IA) y la zona central (CA), donde más tarde se registraron eventos. Restar los valores de fondo de los registrados para IA y CA e integrar las intensidades multiplicando intensidades medias corregidas con el número de píxeles presentes dentro de cada área (= intensidades integradas). Divida la intensidad integrada de CA por el de IA para llegar a la proporción de la potencia del haz de iluminación de la CA (en este ejemplo: 23%). Determine la potencia de la luz que ilumina el CA multiplicando la potencia del haz global (en este caso: 5 mW) con la proporción iluminando el CA (aquí: 0,23). Para determinar el tamaño de la zona central multiplicar el área (aquí: 7.089 pixel) con un factor de píxel a la zona de conversión del tamaño (aquí: 1 / 41,5 m 2 -1 pixel). Para llegar a la densidad de potencia media de la luz de excitación que ilumina la CA, divida el poder (en este caso: 1,15 mW) por el tamaño de la entidad emisora. (Aquí: 170,8 m 2) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig7.jpg" /> Figura 7. La cuantificación de las señales de una sola molécula. (A) Evolución temporal de fluoróforos individuales en una SLB. Una región de tamaño 7 x 7 píxel de interés (ROI, amarillo) se coloca alrededor de la señal para la cuantificación. Antecedentes se determina a partir del píxel vecino un 7 x 7roi (verde). (B) cuantificado intensidades promedio de píxeles se enumeran. Para determinar la señal de una sola molécula, los valores de fondo (ROI verde) se restan de los valores de señal (ROI amarillo) y se multiplicaron por 49. (C) intensidades de moléculas individuales de un fluoróforo se representan gráficamente contra el tiempo. Tenga en cuenta, que el punto de tiempo de 90 ms se omite como el fluoróforo está en el proceso de blanqueo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig7large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig8.jpg" /> Figura 8. La recuperación de fluorescencia Después de Photobleaching (FRAP) análisis para determinar la integridad de la SLB. (A) FRAP se realizó en una bicapa llevar a CEA / MCC-Alexa Fluor 647. Cada imagen de la décimo experimento se muestra. (B) la cuantificación FRAP del experimento se muestra en (A). Los valores indican las intensidades promedio (i) dentro de la ROI amarilla se muestra en (A) dividida por la intensidad inicial (I) o antes del blanqueo. Puntos de datos rojas se muestran en (A), la línea verde denota 0,9 recuperación de intensidades originales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí se muestra la preparación de bicapas lipídicas planas funcionalizadas con proteínas, la determinación de la movilidad de las proteínas en su interior y la medición de las densidades de las proteínas. Se esboza una hoja de ruta para la construcción de un microscopio de reflexión interna total con reducción de ruido, que permite visualizar fluorocromos residentes de una sola capa con alta resolución espacio-temporal.

Bilayers Individual Molécula microscopía de fluorescencia en planar compatibles

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

En este video, mostraremos cómo preparar y caracterizar bicapas lipídicas soportadas planares biofuncionalizadas. También describiremos en detalle la arquitectura de un microscopio de reflexión interna total con capacidades de detección de moléculas individuales. Mediremos la densidad de potencia de excitación, la fluidez y la densidad de proteínas de la bicapa lipídica.Comencemos con una breve introducción a la bicapa lipídica soportada sobre vidrio plano. Cuando vesículas unilaminares pequeñas entran en contacto con una superficie de vidrio limpia, estallan y se extienden para formar una bicapa lipídica continua. Sobre un cojín de agua, normalmente elegimos el material PALM.El POPC o fosfocolina oleílica es el lípido predominante porque da lugar a bicapas lipídicas fluidas a temperatura ambiente y a 37 grados Celsius. Para la funcionalización, añadimos niquel antióxido, un lípido sintético con un grupo funcional quelante de níquel, que se une a proteínas con etiqueta polihistidina. Por ejemplo, la molécula coestimuladora B siete uno, la molécula de adhesión ICAM uno y la molécula de MHC cargada con péptido marcada con fluorescencia para el reconocimiento por células T, como se muestra aquí; sin embargo, este sistema de bicapa puede emplearse en principio para abordar procesos completamente diferentes en una variedad de sistemas biológicos.Debido a la naturaleza del sistema plano, los eventos de fluorescencia pueden monitorizarse en modo de reflexión interna total, lo que reduce sustancialmente el fondo celular y resulta muy adecuado para la microscopía de fluorescencia de molécula individual. Para la preparación de lípidos, se necesitan los lípidos POPC y cloroformo con níquel antiox, así como un matraz redondo limpio. Disuelva los lípidos en la proporción deseada y en cloroformo, y séquelos bajo vacío como se muestra aquí. Tras el tratamiento con alto vacío durante la noche, los lípidos forman una película en el interior del matraz. Para la rehidratación de los lípidos, utilice PBS desgasificado, añadiendo 10 mililitros de PBS desgasificado a la mezcla de lípidos seca.No mezcle. Ahora, para evitar la oxidación de lípidos, llene el matraz con un gas inerte como nitrógeno o argón y gire el matraz. Los lípidos forman una suspensión lechosa.Tome una pequeña muestra como blanco para el espectrofotómetro para evitar el intercambio de gases durante el siguiente paso. Es muy importante sellar adecuadamente el matraz que contiene la suspensión lipídica. Utilice una cinta adhesiva resistente al calor, por ejemplo, cinta para autoclave, para proteger del aire durante la formación física usando un baño ultrasónico cerrado.Después de colocar el matraz, inicie el procedimiento de sonicación a una potencia máxima de 170 vatios. Sone durante 60 minutos. Debido a la formación física, la turbidez ha disminuido significativamente.Esto puede verificarse mediante espectrofotometría a 550 nanómetros. Utilice la alícuota tomada antes de la sonicación como blanco. La densidad óptica a 230 nanómetros, que indica la cantidad de lípidos, debe permanecer constante.Aquí llenamos pequeños tubos de ultracentrifugación con una suspensión de vesículas de un mililitro y los colocamos en un rotor de ángulo fijo de una ultracentrífuga de mesa. Es muy importante utilizar únicamente vesículas unilaminares pequeñas para la preparación de la bicapa. Las vesículas multilaminares más grandes y más densas, que también se forman durante la sonicación, interfieren con la fluidez de la bicapa y por lo tanto deben separarse y eliminarse mediante centrifugación.Primero, centrifugamos durante una hora a 150,000 G a temperatura ambiente. El sobrenadante resultante se centrifuga luego durante ocho horas adicionales a 288,000 G a cuatro grados Celsius. Los portaobjetos deben estar muy limpios antes de que las vesículas lipídicas puedan extenderse sobre ellos para formar una bicapa continua y fluida.Para ello, colocamos cubreobjetos en un montículo de teflón, que luego introducimos en un recipiente de vidrio. Es fundamental tener gran precaución, utilizando protección ocular, guantes protectores y bata de laboratorio, y trabajar dentro de una campana extractora de gases. Añadimos una parte de peróxido de hidrógeno al 30 % y luego tres partes de ácido sulfúrico concentrado, obteniendo así ácido peroximonosulfúrico, muy reactivo y oxidante.Esta mezcla reacciona violentamente con sustancias orgánicas, incluyendo las presentes en la piel, los ojos y la ropa. Se calienta inmediatamente. Incube las laminillas durante 30 minutos.Sujete la cubeta con la pinza. Lave completamente el ácido de ambos lados de la cubeta limpia utilizando agua destilada o desionizada de alta calidad. A continuación, coloque la cubeta sobre un soporte de teflón y déjela secar durante no más de 10 minutos para poder producir varias bicapas lipídicas individuales simultáneamente. Pegamos las cubetas secas con adhesivo de endurecimiento rápido.Pegamento epoxi de dos componentes para una cámara Lab Tech de ocho o 16 pocillos. Primero, retire cuidadosamente la placa de vidrio lept de su marco original. Mezcle los dos componentes del pegamento en una proporción uno a uno.Extiéndalo uniformemente sobre las ranuras inferiores del marco de la cámara. Coloque la laminilla limpia sobre la parte inferior del marco de la cámara recubierta de pegamento. Asegúrese de que el pegamento esté distribuido de manera uniforme entre la lámina de vidrio y el marco de plástico.Deje que el pegamento se endurezca durante 30 minutos. Diluya la suspensión física de lípidos en PBS de uno a diez y filtre a través de un filtro de 0,2 micrones, agregando 120 microlitros de esta dilución a cada pocillo de una cámara de ocho pocillos o 60 microlitros a cada pocillo de una cámara de 16 pocillos. Asegúrese de que toda la superficie de vidrio quede cubierta y espere 20 minutos.La bicapa ya se ha formado. Para eliminar los restos residuales, enjuague cada pocillo con 30 mililitros de PBS. Evite a toda costa la exposición al aire de la superficie de vidrio, ya que esto destruiría inmediatamente la bicapa. Asegúrese de que cada pocillo contenga el mismo volumen de tampón. Para el siguiente paso de decoración con proteína, llene completamente cada pocillo y retire la cúpula líquida.Retire 330 microlitros. Esto dejará aproximadamente 350 microlitros dentro de cada uno. Para decorar la bicapa con proteínas, prepare una mezcla maestra que contenga las proteínas de elección con polihistidina y agregue 50 microlitros de esta mezcla a cada pocillo.Las proteínas se unen al grupo cefálico antiníquel del lípido oscuro para garantizar resultados reproducibles, mezclando bien pero con cuidado, y siempre incubar durante 60 minutos para eliminar las proteínas no unidas. Lavar de nuevo con 30 mililitros de PBS. Enfoquémonos ahora en el hardware de microscopía.Primero, ilustraremos los requisitos de la microscopía por reflexión interna total para la microscopía de césped basada en objetivos. Se necesita un objetivo de inmersión en aceite con una alta apertura numérica. El haz de excitación láser entrante es reflejado por el espejo dicromático y enfocado mediante un conjunto de dos o tres lentes únicamente en el plano focal posterior del objetivo.Luego, la luz láser guía el objetivo como un haz recubierto a lo largo del eje óptico. De este modo, se ilumina la muestra fluorescente en toda su profundidad. Cuando se traslada el haz perpendicularmente al eje óptico, el haz permanece colimado, pero abandona el objetivo de forma inclinada.Si continúa con la translocación, llegará en algún momento al ángulo crítico en el que el haz se refleja totalmente en la interfaz entre la cubreobjetos de vidrio y la muestra. La intensidad de la onda evanescente resultante decae exponencialmente y solo se excitan las estructuras cercanas a la interfaz, hasta varios cientos de nanómetros. Ahora, ilustramos cómo enfocar manualmente el haz láser en el plano focal posterior del objetivo.Utilizando tres o dos lentes con los dos primeros lentes, se aumenta el diámetro del haz láser. La relación de sus longitudes focales determina el tamaño del punto de iluminación en el plano del espécimen. Para asegurar que el haz permanezca colimado, ajuste la distancia entre estos lentes de modo que sea igual a la suma de ambas longitudes focales.La tercera lente se utiliza para enfocar el haz ampliado en el plano focal trasero del objetivo. Dado que la longitud focal de esta lente debe adaptarse a las dimensiones del cuerpo del microscopio y del periscopio asociado, en nuestro caso debe ser mucho más larga, variable en 75 centímetros. La distancia entre la segunda y la tercera lente no influye en las propiedades del haz.Por lo tanto, el espacio infinito intermedio puede utilizarse para modificar el haz de manera definida sin distorsiones. Por ejemplo, se puede insertar una abertura y proyectarla con precisión sobre el plano del espécimen. En esencia, se puede lograr lo mismo utilizando dos lentes en lugar de tres.El sistema de dos lentes es menos definido, pero introduce menos aberraciones de lente. Características simples como una abertura aún pueden implementarse muy bien para la modulación temporal. Un láser de gas, de hierro o de estado sólido debe colocarse delante de un obturador de rango milisegundo, por ejemplo, un obturador mecánico o un modulador óptico completo.Una buena alternativa es un láser de diodo, que puede modularse electrónicamente y no requiere obturación externa. Dos espejos son suficientes para dirigir el haz a cualquier lugar y en cualquier dirección. Como se discutió anteriormente, se utilizan dos lentes para ampliar el haz y enfocarlo en el plano focal trasero del objetivo del microscopio.Podemos trasladar el haz para la configuración del césped desplazando el espejo inferior del periscopio sobre un riel óptico. Para la detección de imágenes, utilizamos una cámara altamente sensible. Por ejemplo, un dispositivo acoplado por carga con multiplicación electrónica o em CCD, o un segundo haz láser de una longitud de onda diferente, puede alinearse en la trayectoria del haz.Con el uso de espejos y una superposición dicróica. Para la detección simultánea de dos colores, colocamos un dispositivo divisor de haz disponible comercialmente en la trayectoria de emisión. Para los experimentos, es muy útil contar con dos trayectorias de haz de excitación independientes.Por ejemplo, uno para imágenes de césped y un segundo para fotoblanqueo o activación selectiva. Esto puede lograrse fácilmente mediante la implementación de un conjunto de 2 divisores de haz 50/50. Como se muestra en nuestra ilustración, dos sistemas diferentes de ajuste de lentes y espejos darán lugar a dos perfiles de haz y ángulos de haz individuales.Por ejemplo, una más amplia para la obtención de imágenes en el césped y otra más enfocada para el blanqueamiento o activación en zonas no césped. Se puede colocar una abertura en el haz no césped para moldear con precisión el punto de blanqueamiento o activación. Dos obturadores adicionales, uno para cada trayectoria del haz, permiten el control independiente de cada láser, dejando el objetivo en una trayectoria recta y no inclinada.Encienda el medidor de potencia y ajústelo a la longitud de onda láser correspondiente. Mida la potencia de la luz láser en el objetivo y anótela. Ahora, traslade el espejo detrás del microscopio para inclinar el haz láser en el objetivo hacia la posición de césped.Nunca mire directamente hacia la luz del láser. En la esquina inferior derecha, se observa el perfil de intensidad del láser de excitación tal como se visualiza mediante la emisión de una bicapa decorada con proteínas fluorescentes. Aquí utilizamos una representación en falso color para resaltar regiones de diferentes intensidades.Mida la intensidad promedio del fondo dentro de una región de interés lo suficientemente grande. Este valor depende de ajustes específicos de la cámara, como la ganancia EM y la velocidad de lectura, y deberá restarse de todas las intensidades medidas. Determine la intensidad promedio dentro de toda el área iluminada.Elige un diámetro lo suficientemente grande para que los valores de intensidad en la periferia sean similares a los del fondo de la cámara; mide la intensidad promedio del área central. Esta área define la región de interés en la que se realizarán los experimentos de microscopía posteriormente. Ahora, resta el valor promedio de intensidad de fondo de las intensidades tanto del área eliminada como del área central.A continuación, multiplique las intensidades corregidas del fondo por el número correspondiente de píxeles del tamaño de la región para obtener las intensidades integradas. Establezca la intensidad integrada del área iluminada como uno y calcule la fracción para el área central. La potencia medida con el medidor de potencia.En nuestro caso, cinco milivatios es directamente proporcional a la intensidad integrada de toda el área iluminada. Multiplique este valor por la fracción de potencia del área central para determinar la potencia dentro del área central. En nuestro ejemplo, 1.15 milivatios, el factor para convertir el número de píxeles a micrómetros cuadrados depende del tamaño real del píxel del chip de la cámara y de la magnificación de la trayectoria de emisión.Puede determinarse fácilmente con una regla micrométrica. En nuestro ejemplo, el área central corresponde a 170,8 micrones cuadrados. La densidad de potencia se refiere a la potencia medida dividida por el área y, por lo tanto, equivale a 1,15 milivatios divididos por 170,8 micrones cuadrados o 0,007 milivatios por micrón cuadrado.Es decir, 0,7 kilovatios por centímetro cuadrado. Para determinar la fluidez de la bicapa, realizamos una recuperación de fluorescencia tras el blanqueo fotónico del experimento de envoltura. Como se muestra en la película inferior izquierda, obtenemos imágenes de la bicapa fluorescente a baja densidad de potencia.En la película inferior derecha, puede observarse la cámara de tecnología de laboratorio correspondiente en el microscopio. A continuación, se realiza un blanqueo en un área circular mediante pulsos cortos de alta densidad de potencia y se monitorea la recuperación a baja densidad de potencia. Nuevamente, el montaje proporciona una visión general del experimento en diferentes puntos de tiempo, siendo el tiempo cero los pulsos de blanqueo.Cuantificamos la intensidad media de fluorescencia corregida del fondo dentro del círculo marcado y normalizamos todas las intensidades medidas a la intensidad al inicio del experimento. Antes de los pulsos de blanqueo, representamos los valores de intensidad normalizados frente al tiempo. El valor de saturación representa, en nuestro caso, la fracción móvil superior al 90 %. Primero, tome una imagen del bicapa a baja densidad de potencia de excitación.Por ejemplo, al colocar un filtro de densidad óptica con un valor de atenuación logarítmico de dos, esto reduce la potencia por un factor de 100. El tiempo de exposición debe ser constante durante todo el procedimiento y suficiente para obtener imágenes de una fuerza de fluido individual a la densidad de potencia no atenuada, en nuestro caso, 10 milisegundos a 0,7 kilovatios por centímetro cuadrado. Utilice una representación en falso color para resaltar áreas de diferentes intensidades.Seleccione una región de interés en la que se realizarán posteriormente mediciones de moléculas individuales y una región del mismo tamaño. Para la sustracción del fondo, calcule la intensidad integrada sustraída del fondo. Ahora retire el filtro de densidad óptica del trayecto del haz de excitación, blanquee el área y tome una imagen.Verá fuerzas individuales de flu que se difunden en el área blanqueada. Las fuerzas individuales de flu están limitadas por difracción, con un diámetro típico de dos a tres píxeles; tome una región de siete por siete píxeles alrededor de cada señal de molécula individual y una segunda región cercana. Para la sustracción de fondo, es importante cuantificar únicamente la señal de fuerzas individuales de Fluor.Por lo tanto, es mejor obtener imágenes de proteínas en la capa BI con una relación de tinte a proteína menor a uno o bien para proteínas marcadas específicamente con SAT. Incluso con una relación de tinte a proteína de uno, como se muestra en nuestro ejemplo, mida las intensidades integradas para ambas regiones y reste el fondo de la señal para no considerar el último evento observado en nuestro ejemplo, ya que probablemente haya ocurrido un blanqueo durante la exposición promedio. Las señales corregidas aquí; hacemos esto para un fluoróforo de cuatro, que observamos a lo largo de nueve cuadros.Sin embargo, este procedimiento debe realizarse con al menos varios cientos de eventos de molécula individual. Regresemos a nuestra imagen original de bicapa observada con densidad de potencia de excitación atenuada. La densidad molecular se determina corrigiendo la intensidad integrada de la región de interés para una baja densidad de potencia de excitación, multiplicándola por cien y dividiéndola por la intensidad promedio de una sola molécula y el área.Estamos trabajando con una densidad de 421,4 unidades de fuerza Fluor por micrón cuadrado. En nuestro ejemplo, con una relación dieta-proteína de uno, esto equivale al mismo número de moléculas por micrón cuadrado. Después de ver este video, debería ser capaz de preparar y caracterizar una bicapa lipídica funcionalizada con proteínas utilizando microscopía de fluorescencia de molécula individual.Además, debería estar familiarizado con los principios básicos para modificar y mejorar un microscopio estándar para este propósito. Utilizaremos posteriormente esta metodología para determinar la cinética de unión del antígeno unido a bicapa con los receptores de células T unidos a la célula, pero muchas otras aplicaciones basadas en esto son ciertamente factibles.

single-molecule-fluorescence-microscopy-on-planar-supported-bilayers

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Apoyado bicapas planas son potentes herramientas que pueden ser utilizados para modelar las interacciones moleculares en una sinapsis inmunológica. Aquí, se muestra los métodos para el anclaje de las proteínas de adhesión celular sabe que modulan la formación de sinapsis en el folleto superior de la bilyer lípidos y visualizar la formación de sinapsis mediante microscopía TIRF.

El apoyo de bicapa plana para la Formación de Estudio de la sinapsis inmunológica y Kinapse

En este artículo se describe cómo obtener FRET rastros de moléculas individuales de ADN inmovilizado en una superficie utilizando un microscopio confocal de barrido automático.

Sistema Automatizado de Soltero mediciones de fluorescencia de la molécula de superficie inmovilizada Biomoléculas

En este video, demostramos un procedimiento para investigar la organización de la septina en una bicapa lipídica soportada por vidrio in vitro utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total.

Ensayo de bicapa lipídica soportada plana: una técnica in vitro basada en microscopía para investigar el ensamblaje de septinas en imitaciones de membranas biológicas

Presentamos un método de preparación de mica apoyado bicapas lipídicas de microscopía de alta resolución. La mica es transparente y plana en una escala atómica, pero rara vez se utiliza en la formación de imágenes debido a dificultades de manejo; nuestra preparación resulta en la deposición uniforme de la hoja de mica, y reduce el material utilizado en la preparación bicapa.

Preparación de Mica Soportado bicapa lipídica de Alta Resolución Microscopía Óptica de Imagen

Describimos un protocolo para la preparación de bicapas lipídicas soportadas y su caracterización utilizando microscopía de fuerza atómica y espectroscopía de fuerza.

Fuerza Atómica Microscopía Imaging y Fuerza Espectroscopia de admitidos Bilayers lípidos

A continuación, se presenta un protocolo para detectar eventos individuales, SNARE mediada por liposomas y de fusión entre bicapas soportadas en los canales de microfluidos utilizando TIRFM polarizado, con sensibilidad única molécula y ~ 15 ms tiempo de resolución. Lípidos y liberación de carga solubles se pueden detectar de forma simultánea. tamaño de los liposomas, de difusividad de los lípidos, y poro de fusión propiedades se miden.

La fusión mediada por SNARE de proteoliposomas individual con bicapas soportadas atados en una celda de flujo de microfluidos supervisado por microscopía TIRF polarizada

Este protocolo describe la formación de bicapas lipídicas soportadas y la adición de filamentos citoesqueléticos y proteínas motoras para estudiar la dinámica de las redes citoesqueléticas reconstituidas y atadas a la membrana utilizando microscopía de fluorescencia.

Reconstitución de corticidades mínimas de actina atadas a la membrana en bicapas lipídicas soportadas

La reconstitución libre de células ha sido una herramienta clave para comprender el ensamblaje del citoesqueleto, y el trabajo en la última década ha establecido enfoques para estudiar la dinámica de la septina en sistemas mínimos. Aquí se presentan tres métodos complementarios para observar el ensamblaje de la septina en diferentes contextos de membrana: bicapas planas, soportes esféricos y soportes de varilla.

Reconstitución del ensamblaje de septina en membranas para estudiar propiedades y funciones biofísicas

Aquí, se presenta un protocolo para realizar y analizar la unión, movilidad y ensamblaje de moléculas individuales en membranas lipídicas artificiales apiñadas utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total de molécula única (smTIRF).

Difusión y ensamblaje de una sola molécula en membranas lipídicas llenas de polímeros

Este protocolo describe cómo utilizar la microscopía TIRF para rastrear canales iónicos individuales y determinar su actividad en las membranas lipídicas soportadas, definiendo así la interacción entre el movimiento de la membrana lateral y la función del canal. Describe cómo preparar las membranas, registrar los datos y analizar los resultados.

Imágenes de una sola molécula de la movilidad lateral y la actividad del canal iónico en bicapas lipídicas utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF)

Este artículo ofrece una descripción detallada de cómo crear muestras para el seguimiento de una sola proteína en bicapas lipídicas soportadas por sólidos. También explica un microscopio de fluorescencia sencillo con sensibilidad a una sola molécula y una tasa de fotogramas rápida. Finalmente, describimos el procedimiento para extraer trayectorias de una sola proteína.

Seguimiento de proteínas individuales en bicapas lipídicas mediante microscopía de fluorescencia

Aprende a preparar bicapas lipídicas planares funcionalizadas con proteínas y a caracterizarlas mediante microscopía de fluorescencia de molécula única. Este método permite estudiar dinámica de proteínas de membrana con alta resolución.

Bilayers Individual Molécula microscopía de fluorescencia en planar compatibles

Explorar más videos