Name: Selección de alto rendimiento de las Variaciones obstinación en lignocelulósica Biomasa: Total lignina, lignina Monómeros y enzimática Azúcar de lanzamiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Aprenda métodos de alto rendimiento para evaluar la recalcitrancia de biomasa lignocelulósica mediante pretratamiento termoquímico e hidrólisis enzimática. Esta técnica permite identificar materiales óptimos para biocombustibles.

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Los autores desean agradecer a la pasante Evelyn Von Neida, quien proporcionó información primordial sobre la preparación de muestras de biomasa para las dos tuberías de alto rendimiento discutidas en este manuscrito. El apoyo para el desarrollo de este trabajo y manuscrito fue proporcionado por el Centro de Ciencias de Bioenergía. El Centro de Ciencias de Bioenergía es un Centro de Investigación de Bioenergía del Departamento de Energía de EE. UU. respaldado por la Oficina de Investigación Biológica y Ambiental de la Oficina de Ciencia del DOE. El Laboratorio Nacional de Energía Renovable (NREL) es un laboratorio nacional de la Oficina de Eficiencia Energética y Energía Renovable del DOE de los Estados Unidos, operado por el DOE por la Alliance for Sustainable Energy, LLC. Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Energía de los Estados Unidos bajo el Contrato No. DE-AC36-08-GO28308 con el Laboratorio Nacional de Energías Renovables.

1. Alto rendimiento determinación de glucosa y xilosa rendimientos Siguiendo enzimática Sacarificación 9,29 <ol><li> Preparación de la muestra (molienda, De-almidonado, extracción, tratamiento previo) <ol><li> Moler al menos 300 mg de cada muestra de la biomasa utilizando un molino Wiley, de tal manera que las partículas pasan a través de una malla 20 (850 micras) pantalla. Transferencia a zip-top antiestáticas bolsas (normalmente con código de barra) y la información de la muestra registro a la base de datos de código de barras. </li><li> Añadir aproximadamente 250 mg o más de la biomasa aérea de la bolsa antiestática para una numerada (con lápiz, no use tinta o marcador) para bolsitas de té, cuidadosamente enrollar las bolsitas de té, asegurándose de doblar los extremos sobre la biomasa para prevenir pérdida durante de-almidonado y extracción. </li><li> Envuelva la bolsita cerrada con alambre de cobre estañado. Anote el número de la bolsita de té para cada muestra con código de barras. </li><li> Preparar solución de enzima-de almidonar de enzimas comerciales (típicamente, 0,25% (v / v) de la glucoamilasa (AGU ~ 1600 / L) y1,5% (v / v) de alfa-amilasa (~ 2.900 KNU-S / L) en acetato de sodio 0,1 M (pH 5,0)). Preparar 16 ml por g de biomasa a granel o 500 ml por 120 muestras bolsita de té. Nota: Las cargas capaces de eliminar el almidón a partir de biomasa de tierra deben ser determinadas empíricamente mediante pruebas de almidón después de la digestión con una gama de cargas enzimáticas y ratios. </li><li> En un recipiente de plástico, añadir 16 ml de solución de-almidonar enzima por 1 g de biomasa aérea granel. Para un protocolo de-almidonado lotes, añadir 120 bolsitas de té a 500 ml de la solución tampón de la enzima. </li><li> Incubar en un agitador a 55 ° C durante 24 (± 4) horas, a 120 rpm para eliminar posibles almidón. </li><li> Después de la incubación de-almidonar, enjuague y empapar la biomasa en varios litros de agua desionizada durante 30 minutos. Repetir este proceso dos veces más para eliminar las sales tampón que pueden causar la ebullición (formación de burbujas de gas en la solución que puede resultar en un aumento repentino y violento en el nivel de la solución, provocando etanol líquido caliente para cascadafuera del recipiente de reacción) durante la extracción. </li><li> Tras el lavado exhaustivo de la biomasa de-almidonado, colocar las bolsitas de té en la columna de Soxhlet para la extracción. No se requiere un dedal para este paso. </li><li> Configure el reflujo Soxhlet, utilizando etanol al 95% y extraer las muestras durante 24 horas. </li><li> Quite las bolsitas del reactor Soxhlet y se extendió a cabo en una sola capa en una bandeja plana. </li><li> Permita que las muestras se sequen durante la noche a temperatura ambiente en una campana de humos. </li><li> Desenrolle las bolsitas de té y devolver la biomasa seca de bolsas antiestáticas originales con código de barras. Nota: Las bolsas anti-estáticas son eficientes en la reducción de la electricidad estática en la biomasa, lo que mejora las características de manejo. Si se utilizan otras opciones de almacenamiento, biomasa adicional puede ser necesaria debido a la biomasa apego a un lado del recipiente de almacenamiento. </li><li> Transferencia de al menos 50 mg de la biomasa seca a una tolva de código de barras (utilizando más material es mejor para la dispensación precisa). Spueden códigos de barras de bolsas anti-estáticas y la tolva de recepción para asegurar el seguimiento de precisión de muestra. </li><li> Tolvas de carga en sólidos pesando robot, prestando especial atención a la orden de las muestras en los bastidores. Cargar placas reactor suficiente para contener todas las muestras y seleccione el protocolo de dispensación en función del número de placas utilizadas. </li><li> Robóticamente sopesar 5 mg de las muestras secas (± 0,3 mg) en acero inoxidable placas de 96 pocillos resistentes a los ácidos. Pesar 3 réplicas de cada muestra distribuida alrededor de la placa para minimizar las variaciones localizadas. </li><li> Incluya 8 muestras de biomasa de control de un material estándar biomasa bien caracterizado con el fin de realizar un seguimiento de la realización del ensayo. Para múltiples placas, el uso de múltiples tolvas estándar de biomasa será minimizar la deriva del tamaño de partícula causada por tamizado en las tolvas de dispensación durante los ciclos repetidos. Nota: En cada placa, debe haber 24 muestras con 3 repeticiones, 4 espacios en blanco que consisten en agua desionizada y la enzima y 8 controls, usando la biomasa estándar caracterizado previamente. Los 3 pozos de esquina de cada una de las 4 esquinas de la placa están reservados para los estándares de azúcar. </li><li> Compruebe pozos estándar en blanco y azúcar para las partículas de biomasa errantes y quitar si está presente. </li><li> Añadir 250 ml de agua desionizada a cada pocillo, y sellar las placas con politetrafluoroetileno respaldado por adhesivo de silicona (PTFE) cinta. </li><li> Utilizando una punta del soldador de 1/8 &quot;, perfore la cinta de PTFE en cada puerto de vapor (117 en total) para cada plato. Use un plato vacío apilados en la placa del reactor sellado como guía y para restringir el movimiento de PTFE película. </li><li> Sujete las placas firmemente con 0.031 juntas &quot;de espesor reforzado con vidrio de PTFE (pre-perforadas con agujeros para los puertos de vapor) entre las placas y los platos vacíos en la parte superior e inferior de la pila. Trate previamente las muestras usando un reactor de vapor de agua fijada a 180 ° C durante 17,5 min, u otras combinaciones de temperatura / tiempo en base a la severidad deseada. </li><li> Placas de reactores enfriar a 50 °; C por las inundaciones con agua desionizada. </li></ol></li><li> Enzimática Sacarificación <ol><li> Preparar una solución de sacarificación enzimática que consta de 8% (v / v) solución de enzima en 1,0 M de citrato de sodio, pH 5,0. Preparar 5 ml por placa reactor. Nota: La dilución requerida debe determinarse sobre la base de la actividad y contenido de proteína de la solución específica de la enzima. </li><li> Cuando las placas son frescos, centrifúguelas en un rotor de cubeta oscilante a 1500 xg durante 20 min. Retire la película de sellado. Nota: Estas placas son pesados ​​y las especificaciones de centrífuga debe comprobar la compatibilidad. </li><li> Añadir 40 l de la solución de enzima de stock 8% a cada pocillo (70 mg de enzima por g de biomasa). </li><li> Vuelva a cerrar con una nueva cinta de PTFE. Coloque la placa de sellado en pinza placa magnética. </li><li> Mezclar suavemente las muestras por inversión (al menos 15 veces), y se incuba a 50 ° C durante 70 h. </li><li> Cuando la sacarificación ha concluido, mezclar por inversión y centrifugar las placas a 1.500 xg durante 20 min. </li></ol></li><li> Ensayo de Azúcar <ol><li> Prepare un conjunto de 6 de la glucosa y los estándares de calibración de xilosa combinado en tampón M de citrato 0,014 (pH 5,0) que van desde 0 a 0,750 mg / ml (0, 0,2, 0,3, 0,45, 0,65, y 0,75 mg / recomendada ml) y de 0 a 0,600 mg / ml (0, 0,1, 0,2, 0,35, 0,45, y 0,6 mg / ml recomendado) para la glucosa y xilosa, respectivamente. </li><li> Preparar la glucosa oxidasa / peroxidasa (goPod) y xilosa deshidrogenasa (XDH) los reactivos de acuerdo a instrucciones del kit. </li><li> Con una pipeta, retire 200 l de líquido de los 4 pozos de esquina y pozos de borde adyacentes a los pozos de esquina (12 pozos en total) de la placa del reactor. </li><li> Con una pipeta, dispensar 180 l de agua desionizada a cada pocillo de una placa de dilución de fondo plano de poliestireno de 96 pocillos. No añadir agua a los pozos convencionales y esquina 12 de azúcar (quitar estos consejos si se utiliza un cabezal de 96 canales). </li><li> Con una pipeta, dispense 180 l de reactivo goPod a cada pocillo de la prueba de glucosa en plcomió. </li><li> Con una pipeta, dispensar reactivo XDH 180 l a cada pocillo de la placa de ensayo xilosa. </li><li> Con una pipeta, transferir 20 l alícuotas de hidrolizado de la placa del reactor de 96 pocillos de la placa de dilución. Pipetear de la sección superior de los pocillos para evitar los sólidos de biomasa y líquido residual en los pozos de esquina. Mezclar por trituración durante al menos 10 ciclos. </li><li> Con una pipeta, transferir 110 l de estándares de azúcar, por duplicado, a los pozos de esquina de la placa de dilución. </li><li> Con una pipeta, transferir 20 alícuotas de la placa de dilución para los de glucosa y xilosa placas de ensayo. Mezclar por trituración. </li><li> Incubar las glucosa y xilosa placas de ensayo a temperatura ambiente durante 30 min. Romper con cuidado las burbujas de la superficie antes de leer. Una pistola de calor pasó brevemente sobre la superficie de la placa funciona bien. </li><li> El uso de un lector de placas de 96 pocillos ultravioleta / visible, ajuste la longitud de onda medida a 510 nm y registrar la absorbancia contra un blanco de reactivo.Esta medición supervisa la formación de quinonimina, que es proporcional a la concentración de glucosa. La concentración de glucosa se calcula a partir de la curva de calibración basada en los estándares de calibración preparadas en 1.3.1. </li><li> El uso de un lector de placas de 96 pocillos ultravioleta / visible, ajuste la longitud de onda medida a 340 nm y registrar la absorbancia. Esta medición supervisa la reducción de NAD + a NADH, que es proporcional a la concentración de xilosa. La concentración de xilosa se calcula a partir de la curva de calibración en base a los estándares de calibración preparadas en 1.3.1. </li></ol></li></ol> 2. Alto rendimiento Determinación del total de lignina y lignina contenido monomérico Usando pyMBMS 28 <ol><li> Preparación de la muestra <ol><li> Moler y extraer la biomasa utilizando los métodos descritos en los pasos 1.1.1, y 1.1.6-1.1.8. Esto incluye la molienda y extracción de un conjunto de normas para usar como controles experimentales. Nota: El measur pyMBMSelemen- no dependen del tamaño de partícula, por lo que si solamente utilizando el protocolo pyMBMS, la preparación de biomasa deben llevarse a cabo para permitir que la muestra para encajar en el soporte de la muestra, &lt;4 mm. </li><li> Usando una pequeña espátula de dispensación de aproximadamente 4 mg (3 a 5 mg preferidos) de la biomasa preparada en una taza de acero inoxidable de 80 l diseñado para la auto-muestreador. </li><li> Asegúrese de que al menos el 10% de las muestras que se analizan son las normas de control, como las disponibles en el Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (bagazo de caña de azúcar-8491; álamo-8492; de pino-8493; o el trigo de la paja-8494). El estándar también puede ser cualquier especie análogas a las muestras a analizar que ya han sido caracterizados utilizando métodos estándar. </li><li> Aleatoriamente cargar las muestras en las copas de auto-sampler utilizando pinzas para evitar el sesgo debido a la posible deriva espectrómetro con el tiempo. Nota: Una aleatorización típica de las muestras sería incluir la medición de todas las muestras de una vez, seguido de un re-aleatorizacióndel orden de las muestras para una medición por duplicado. Programas de aleatorización están disponibles en línea. </li><li> Usando un taladro estándar, producir manualmente discos de filtro de vidrio de tipo láminas de fibra de vidrio A / D, sin aglutinante. Sujete el filtro de fibra de vidrio redonda con pinzas, centrarlo sobre la copa de la muestra, y empuje en la muestra utilizando una llave Allen de 3,5 mm para confinar el material en cada taza durante el experimento. </li></ol></li><li> Protocolo Instrumental <ol><li> Calibrar el espectrómetro de masas usando un estándar conocido que tiene intensidades de los picos en toda la gama de compuestos que pueden existir para las muestras experimentales. Para las muestras típicas de biomasa, utilice perfluorotributilamina (PFTBA). </li><li> Ajuste la velocidad de flujo del gas portador de helio a 0,9 L / min utilizando un medidor de flujo de gas. </li><li> Ajuste el horno de auto-muestreador a una temperatura de pirólisis de 500 ° C y la temperatura de interfaz a 350 ° C utilizando el software de auto-muestreador. Nota: A &quot;de acero inoxidable 1/8 calientalínea de transferencia de calor envuelto en cinta que conecta el auto-muestreador al espectrómetro de masas se controla mediante un controlador térmico a 250 ° C. </li><li> Comience la adquisición de datos en el espectrómetro de masas y espere al menos 60 segundos para obtener datos suficientes para la recopilación de antecedentes espectros. </li><li> Comience el método de auto-muestreador automático con las especificaciones de 2.2.2. Nota: La auto-muestreador gotas de cada muestra individualmente en el horno de auto-muestreador. El tiempo total de adquisición de datos es de aproximadamente 1,5 min; Sin embargo, la pirólisis de una típica muestra de 4 mg es completa después de 30 seg. </li><li> Contenido Registro de iones totales (TIC) de cada muestra utilizando el software espectrómetro de masas en la velocidad de barrido de 0,5 seg. Intensidades de Registros entre m / z 30-450. Nota: los compuestos de biomasa típicas utilizan ionización suave a 17 eV. El instrumento puede grabar intervalos mayores de m / z 1 a 1000; Sin embargo, la tasa de exploración estará limitada por el poder de la CPU del ordenador. </li><li> Eliminar fondo de los espectros utilizando el manual mejorar función en el software. Nota: Una porción 60 de barrido de la línea de base al comienzo de la recogida de datos se utiliza para calcular un valor medio de fondo. Este promedio espectros de fondo se quita de los espectros de la muestra experimental automáticamente en el software espectrómetro de masas. </li><li> Importe el archivo de texto de una sola columna creado por el software espectrómetro de masas que contiene los datos espectrales para cada muestra, en un programa de base de datos y combinar todas las muestras en una sola base de datos. Añadir los metadatos aplicables a la hoja de cálculo. Importe los datos con formato de hoja de cálculo (archivo / CSV) en un paquete de software estadístico y la media de normalizar el espectro para dar cuenta de la variación en las masas de muestra pirolizados. </li><li> Use un paquete de software estadístico para llevar a cabo un análisis de componentes principales (PCA) usando los datos espectrales para analizar agrupación de las muestras replicadas estándar utilizados en las mediciones, así como para evaluar qué picos son parte integral de la clasificación de los productos químicoscompuestos en las cargas parcela 28. Nota: Los grupos de PCA las muestras en base a la similitud de sus espectros, y permite una verificación de los estándares para medir el error experimental debido a la deriva instrumento durante la carrera. </li><li> Para calcular la siringil lignina (S) / guayacil (G) ratio, sumar las áreas de los picos S (m / z = 154, 167, 168, 182, 194, 208, y 210) y se divide por la suma de G picos en 124, 137, 138, 150, 164, y 178. </li><li> Para calcular el contenido total de lignina, sumar los picos de lignina con m / z = 120, 124, 137, 138, 150, 152, 154, 164, 167, 178, 180, 182, 194, y 210. </li><li> Calcular un factor de corrección para escalar la medición pyMBMS a un método estándar para la estimación de la lignina total de, como Klason lignina. Divida el valor lignina Klason de la norma individual del contenido total de lignina medido para esa muestra estándar utilizando pyMBMS. </li><li> Aplique este factor de corrección a todas las especies como en el conjunto de datos. Repita el procedimiento para cada tipo de biomasa analizada. Nota: El factor de corrección puede variar en función significativa en la S / G de la biomasa analizada. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los pasos clave de preparación de muestras para la obtención de datos precisa y reproducible cuando se realizan experimentos de selección de alto rendimiento son las siguientes: Azúcar Ensayo de lanzamiento: En general, las muestras se preparan en lotes que van desde unas pocas docenas a varios miles a la vez. Cada paso importante se lleva a cabo típicamente para todas las muestras antes de mover hacia adelante con el fin de minimizar las variaciones en la prepar...

A medida que la oferta mundial de combustibles no renovables y sus productos disminuciones asociadas, los científicos se han cuestionado para crear combustibles y productos químicos similares a partir de fuentes de origen vegetal 1. Un aspecto clave de este trabajo es determinar qué especies de plantas pueden ser adecuados para la producción de biocombustibles y biomateriales 2,3. Típicamente, estas materias primas se evalúan para la lignina, celulosa, hemicelulosa y el contenido; así como su susceptibilidad a la deconstrucción (recalcitrancia) a través de pretratamiento térmico, mecánico y / o químico con o sin posterior enzima de sacarificación. Análisis más detallados se usan para determinar la composición específica de las fracciones de lignina y hemicelulosa, así como actividades óptimas enzima necesaria. Modificaciones transgénicas de plantas que no poseen intrínsecamente características ideales para la conversión bioquímica o termoquímica a los productos básicos deseados han proporcionado a los investigadores con una fuente de gran expansión de la ollamaterias primas ciales 4. Los métodos analíticos estándar para la cuantificación de los rasgos químicos de una planta, mientras que muy útil para pequeños conjuntos de muestras, no son adecuadas para la detección rápida de cientos o miles de muestras 5-7. Los métodos descritos en este documento HTP se han desarrollado para evaluar rápida y eficazmente un gran número de variantes de biomasa para los cambios en la pared celular recalcitrante a la degradación termoquímica y / o enzimática. Es fundamental entender que los ensayos de selección HTP descritos en este documento no han sido diseñados para maximizar la conversión o rendimiento. El objetivo es determinar las diferencias relativas en el recalcitrante intrínseca de muestras de biomasa relacionados. Como resultado, muchos de los pasos de análisis difieren de los ensayos de conversión de biomasa &quot;típicos&quot;, donde el objetivo es obtener la máxima tasa de conversión o extensión. Por ejemplo, severidades de pretratamiento más bajas y tiempos más cortos de la enzima de hidrólisis se utilizan para maximizar diferircias entre las muestras. En la mayoría de los casos, las cargas relativamente altas de enzimas se utilizan para reducir las diferencias debidas a la variación experimental en la actividad enzimática, lo que podría alterar los resultados de manera significativa. Técnicas rápidas para determinar la composición de la planta paredes celulares y los azúcares monoméricos liberados tras la sacarificación enzimática incluyen robótica,, placas de 96 pocillos termoquímicamente compatibles personalizados, y modificaciones de los métodos de laboratorio estándar 8-11 y protocolos instrumentales, como la espectroscopia vibracional (infrarrojos (IR), de infrarrojo cercano (NIR), o Raman) y resonancia magnética nuclear (RMN) 12-17. Estas metodologías son la clave para el aislamiento de las materias primas con alto contenido de celulosa o bajos de lignina, o los previstos para obtener el más alto de glucosa, xilosa, etanol, etc. Estos métodos han permitido a los análisis a escala reducida que emplean pequeñas cantidades de biomasa y consumibles, lo que lleva a la reducción de experimental costa 18 </sarriba&gt;. Otra característica de este enfoque metodológico es que diversas condiciones experimentales pueden ser rápidamente, y en algunos casos de forma simultánea, evaluado. Por ejemplo, una variedad de diferentes estrategias de tratamiento previo o cócteles de enzimas puede ser probado, permitiendo que los parámetros experimentales más óptimas para identificar y emplear rápidamente. Materias primas populares, como el rastrojo de maíz 9, álamo 8,10, bagazo de caña 8, y el pasto varilla 8 se han evaluado con éxito el uso de estos métodos HTP. Lignina total y la composición monomérica lignina también son comúnmente cuantificados rasgos de biomasa. Las reducciones en el contenido de lignina se ha demostrado que aumentar la digestibilidad enzimática de polisacáridos 19,20. El papel que la relación lignina monomérica (a menudo reportado como siringil / guayacil (S / G) contenido) juega en la deconstrucción de la pared celular vegetal es todavía bajo investigación. Algunos informes han indicado que las reducciones en la S / Grelación condujo a un aumento de los rendimientos de glucosa después de la hidrólisis de 21 años, mientras que otros estudios revelan la tendencia opuesta 19,22. Métodos de alto rendimiento para la evaluación de la lignina y sus monómeros incluyen espectroscopia vibracional (IR, NIR y Raman 23-26), junto con el análisis multivariado, y pirólisis espectrometría de masas de haz molecular (pyMBMS) 27,28. En el desarrollo de métodos HTP para el cribado de la biomasa, varias consideraciones integrales deben mantenerse en mente. Un aspecto clave es la complejidad del método. ¿Cuál es el nivel de habilidad requerida para la técnica? Análisis quimiométricos, por ejemplo, requieren habilidades específicas para construir, evaluar y mantener modelos predictivos. Los métodos estándar exhiben pasos de análisis preparatorio o de datos indeseables o emplean reactivos tóxicos. Desarrollo de los modelos es un proceso continuo, donde los nuevos datos se incorpora en el modelo a través del tiempo para aumentar la robustez del modelo. Otra considración es el ahorro de costes y la disminución de los tiempos de análisis experimentales de los métodos de alto rendimiento propuestos. Si el método es bastante rápida, pero muy costoso, puede que no sea una técnica viable para muchos laboratorios a adoptar. Los métodos ilustrados en este manuscrito son variantes de técnicas estandarizadas, modificados para amplificar las capacidades de rendimiento. Estos protocolos miden cuantitativamente los rasgos de biomasa de interés sin necesidad de la elaboración de modelos predictivos. Este es un atributo clave de estas técnicas, ya que los métodos de predicción, mientras que exhiben fuertes correlaciones con el estándar de análisis utilizados para desarrollar los modelos, no son tan precisos como medir realmente la cantidad de interés para las muestras. Considerando que los métodos utilizados son esencialmente reducido versiones de los métodos estándar de análisis a escala de laboratorio, la exactitud y la precisión se negocian para la velocidad y el rendimiento. Sobre todo, este resultado se debe a errores mayores en pequeña pipeta de volumen y un peso; así como una mayor samplia heterogeneidad como tamaño de la muestra disminuye. Mientras que los grandes conjuntos de muestras pueden ser examinados y comparados, el gran cuidado debe ejercerse cuando se hacen comparaciones entre campañas separadas y con los resultados a escala de laboratorio. Las mayoría de los pasos que consumen tiempo implican la manipulación física de la biomasa. Muestras de molienda puede tardar varios minutos por muestra, incluyendo la limpieza de la fábrica entre las muestras. Carga manual, la descarga, y tolvas de limpieza y llenado y vaciado de bolsas de té y bolsas de muestras también es muy intensivo en mano de obra. Si bien cada paso puede tardar un minuto o más, haciendo miles de muestras pueden tomar muchas horas o incluso días. Los robots pueden cargar un plato típico reactor con la biomasa en aproximadamente de 3 a 4 horas o 6 para placas de 8 días -1 -1 robot. Esta situación depende de los parámetros de precisión utilizados, así como el tipo y la cantidad de biomasa a ser probado. Llenar placas de reactores con agua, ácido diluido, o enzima se hace rápidamente usando un robot de manipulación de líquidos. Pretratamiento de una pila de placas (de 1 a 20 placas de reactores) tarda entre 1 y 3 horas cuando el conjunto, enfríe y desmontaje incluido. Hidrólisis enzimática tarda 3 días y el análisis de azúcar requiere alrededor de 1 hora de tiempo de preparación más 10 minutos por plato reactor para completar el ensayo y leer los resultados. Un programa semanal de establecidos días previos al tratamiento y análisis de capacidad para un horario de trabajo razonable, minimizando extraña horas y los fines de esfuerzos para el componente humano de la prueba y permite el procesamiento ~ 800 a 1000 muestras por semana de manera continua. El rendimiento máximo depende de varios factores, sobre todo de cómo están disponibles para hacer el trabajo manual tanto de hardware (robots, placas de reactores, etc.) y la cantidad de &quot;software&quot; (es decir, la dotación de personal). El límite superior práctico es 2500 a 3000 muestras / semana; sin embargo, que la producción requiere un funcionamiento 7 días a la semana y varios becarios y técnicos de los estudiantes. En comparación, 3.000 muestras por HPLC requerirían aproximadamente 125 días de samanálisis PLE más la mano de obra adicional de pesaje manualmente muestras en los reactores y las muestras de filtrado antes del análisis.

<table><tbody><tr><td>Estación de trabajo automatizada Biomek FX</td><td>Beckman Coulter</td><td>Biomek FX</td><td>Manipulador de líquidos automatizado</td></tr><tr><td>Molino Wiley</td><td>Thomas Scientific</td><td>3375E15 (Modelo 4), o 3383L20 (Mini-molino)</td><td></td></tr><tr><td>bolsas antiestáticas</td><td>Minigrip*</td><td>MGST4P02503</td><td>2.5x3", múltiples proveedores disponibles</td></tr><tr><td>alambre de cobre estañado</td><td>McMaster-Carr</td><td>8871K84</td><td>0.016" de diámetro, bolsitas de té de alambre dobladas y atirantadas</td></tr><tr><td>Bolsitas de</td><td>té Herbco press n' brew</td><td>3.5x5 pulgadas</td><td></td></tr><tr><td>gluco-amilasa</td><td>Novozymes</td><td>Spirizyme Fuel&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>alfa-amilasa</td><td>Novozymes</td><td>Liquozyme SC DS</td><td></td></tr><tr><td>acetato de sodio trihidrato</td><td>cualquier proveedor</td><td></td> de productos químicos grado de <td>reactivo</td></tr><tr><td>ácido acético</td><td>cualquier proveedor</td><td></td> de productos químicos <td>grado de reactivo</td></tr><tr><td>190 prueba (95%) etanol</td><td>cualquier proveedor</td><td></td> de productos químicos <td></td></tr><tr><td>tolvas de</td> grado de reactivo <td>Freeslate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96- pozo C-276 Placas Hastelloy</td><td>Aspen Machining (Lafayette, Colorado)</td><td>N/A (hecho a medida)</td><td></td></tr><tr><td>Punta de soldador de 1/8"</td><td>Cinta</td> de teflón con respaldo adhesivo de silicona Sears <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>3M</td><td>5180</td><td>3" de ancho (rollos de 36 yardas)</td></tr> <tr><td>solución enzimática</td><td>Novozymes</td><td></td><td>Cellic CTec2</td></tr><tr><td>ácido cítrico monohidratado</td><td>cualquier proveedor</td><td></td> de productos químicos<td></td></tr><tr><td>citrato trisódico dihidratado</td><td>cualquier producto</td><td></td><td></td>químico</tr><tr><td>proveedor desechable, poliestireno placas de 96 pocillos</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>o equivalente; múltiples proveedores disponibles</td></tr><tr><td>glucosa oxidasa/peroxidasa&nbsp;</td><td>Megazyme</td><td>K-Gluc</td><td>Megazyme D-glucosa kit de ensayo</td></tr><tr><td>xilosa deshidrogenasa</td><td>Megazyme</td><td>K-Xilosa</td><td>Megazyme D-xilosa kit de ensayo</td></tr><tr><td>de glucosa solución estándar</td><td>Megazyme</td><td>K-Gluc</td><td>Megazyme D-glucosa kit de ensayo</td></tr> de <tr><td>xilosa solución estándar</td><td>Megazyme</td><td>K-Xilosa</td><td>Megazyme D-xilosa kit de ensayo</td></tr> de <tr><td>acero inoxidable Frontier</td><td>Laboratories</td><td>Láminas de fibra de vidrio PY1-EC80F</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pall</td><td>66227</td><td>Hojas de 8x10"; círculos perforados con perforadora estándar</td></tr><tr><td>Materia prima de biomasa entera de bagazo de caña</td><td>de azúcar NIST</td><td>8491</td><td></td></tr><tr><td>Álamo oriental (álamo) Materia prima de biomasa entera</td><td>NIST</td><td>8492</td><td></td></tr><tr><td>Pino de Monterey Materia prima de biomasa entera</td><td>NIST</td><td>8493</td><td></td></tr><tr><td>Trigo Materia prima de biomasa entera de paja</td><td>NIST</td><td>8494</td><td></td></tr></tbody></table>

selección de alto rendimiento de las variaciones obstinación en lignocelulósica biomasa: total lignina, lignina monómeros y enzimática azúcar de lanzamiento

High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

La conversión de biomasa lignocelulósica en combustibles, productos químicos y otras materias primas se ha explorado como un posible camino hacia las reducciones en el uso de fuentes de energía no renovables. Con el fin de identificar qué plantas, de un grupo diverso, tienen los rasgos químicos deseados para aplicaciones posteriores, se deben comparar atributos, como el contenido de celulosa y lignina, o la liberación de azúcar monomérica después de una sacarificación enzimática. Los protocolos experimentales y de análisis de datos de los métodos estándar de análisis pueden llevar mucho tiempo, lo que limita el número de muestras que se pueden medir. Los métodos de alto rendimiento (HTP) alivian las deficiencias de los métodos estándar y permiten el cribado rápido de las muestras disponibles para aislar aquellas que poseen los rasgos deseados. Este estudio ilustra las tuberías de liberación de azúcar HTP y espectrometría de masas de haz molecular por pirólisis empleadas en el Laboratorio Nacional de Energía Renovable. Estas tuberías han permitido la evaluación eficiente de miles de plantas, al tiempo que han disminuido el tiempo y los costos experimentales a través de la reducción de la mano de obra y los consumibles.

El efecto combinado del pretratamiento termoquímico y posterior enzima de sacarificación se mide como una función de la masa de glucosa y xilosa liberado al final del ensayo. Los resultados se reportan en términos de miligramos de glucosa y xilosa liberados por gramo de biomasa. Esto está en marcado contraste con los datos reportados a partir de ensayos a escala de banco, que generalmente se reporta como por ciento de rendimiento teórico basado en análisis de la composición del material de partida. Como todavía no es pr...

Se evalúan la estructura de la pared celular de la planta y los rasgos químicos para identificar las materias primas ideales para biocombustibles y biomateriales. Los métodos estándar tienen limitaciones cuando se aplican a grandes conjuntos de datos. Estos métodos de pretratamiento de alto rendimiento, sacarificación enzimática y espectrometría de masas de haz molecular de pirólisis comparan un gran número de muestras de biomasa con una disminución del tiempo y el costo experimental.

Selección de alto rendimiento de las Variaciones obstinación en lignocelulósica Biomasa: Total lignina, lignina Monómeros y enzimática Azúcar de lanzamiento

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

El objetivo general de este procedimiento es medir los recalcitrantes de la pretratamiento termoquímico y de la hidrólisis enzimática entre variantes relacionadas de biomasa. Esto se logra primero preparando las muestras de biomasa para su análisis mediante reducción de tamaño y extracción de almidón y azúcares solubles. El segundo paso consiste en dispensar la biomasa con alta precisión en placas de reactores de alto rendimiento compatibles termoquímicamente.Las muestras se pretratan en un reactor de vapor. A continuación, las muestras se digieren con una celulasa comercial estándar durante tres días para hidrolizar la celulosa y la hemicelulosa. El paso final consiste en la determinación de la glucosa y xilosa liberadas durante la hidrólisis enzimática mediante los ensayos GO pod y XDH.En última instancia, la cuantificación de alto rendimiento de glucosa y xilosa se utiliza para determinar la liberación relativa de azúcares entre muestras, expresada en gramos de azúcar por gramo de biomasa inicial. La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos a escala de laboratorio, como el pretratamiento y la hidrólisis enzimática a escala de banco, es que puede realizarse simultáneamente en cientos o incluso miles de muestras. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la conversión de biomasa, como cuáles cultivares o variantes son más susceptibles de convertirse en azúcares y en productos posteriores.Por lo tanto, las implicaciones de esta técnica pueden extenderse hacia la comprensión de la estructura y función de la pared celular, ya que las mutaciones que generamos en la vía biosintética de la pared celular pueden cribarse para detectar cambios químicos estructurales. Este método puede proporcionar información sobre los componentes recalcitrantes de la pared celular vegetal. Asimismo, puede aplicarse a otros componentes de la conversión de la biomasa, como estudios de actividad enzimática y sinergia.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque implica conjuntos grandes de muestras de variantes de biomasa que deben manipularse de forma idéntica y simultánea a escala de miligramos. Por ello, se requiere robótica y equipo especializados. Para comenzar el procedimiento, coloque aproximadamente 250 miligramos de biomasa previamente molida procedente de una bolsa antiestática con código de barras en una bolsita numerada; enrolle cuidadosamente la bolsita asegurándose de doblar los extremos sobre la biomasa para evitar pérdidas durante la desnaturalización y la extracción. A continuación, cierre cada bolsita envolviéndola con alambre de cobre recubierto de estaño y registre el número de la bolsita para cada muestra con código de barras.Añada 500 mililitros de una solución de enzima desamidante previamente preparada a un recipiente de plástico. Luego, añada 120 bolsitas de té a la solución enzimática tamponada para un protocolo de procesamiento por lotes. Después de la incubación en un agitador, enjuague y remoje la biomasa en varios litros de agua desionizada durante 30 minutos, tras un enjuague exhaustivo de la biomasa desamidata.Para eliminar las sales del tampón, coloque las bolsitas de té en una columna de calcetín para la extracción. Configure el reflujo del calcetín utilizando etanol al 95% y extraiga las muestras durante 24 horas. Una vez completada la extracción, desenrolle las bolsitas de té y devuelva la biomasa seca al tubo original con código de barras.Bolsas antiestáticas Transfiera al menos 50 miligramos de la biomasa seca a un depósito con código de barras. Escanee los códigos de barras de las bolsas antiestáticas y del depósito receptor para garantizar un seguimiento preciso de las muestras. Después de cargar los depósitos en un robot de pesaje sólido, pese robóticamente cinco miligramos de las muestras secas en acero inoxidable resistente a ácidos.Las placas de 96 pocillos pesan tres réplicas de cada muestra distribuidas alrededor de la placa para minimizar cualquier variación localizada. A continuación, agregue 250 microlitros de agua desionizada a cada pocillo y selle las placas con cinta de politetrafluoroetileno (POLYTETRAFLUOROETHYLENE) o PTFE con respaldo adhesivo de silicona. Utilizando una punta de soldador de un octavo de pulgada, atraviese la cinta de PTFE en cada puerto de vapor.Para cada placa, sujete firmemente las placas con juntas de PTFE reforzado con vidrio de 0,031 pulgadas de espesor entre las placas, y placas vacías en la parte superior e inferior de la pila. Someta las muestras a un pretratamiento utilizando un reactor de vapor ajustado a 180 grados Celsius durante 17,5 minutos. Al finalizar, enfríe las placas del reactor hasta 50 grados Celsius inundándolas con agua desionizada.Cuando las placas estén frías, centrifúgelas en un rotor de cubeta oscilante a 1700 GS durante 20 minutos. Luego retire la película superior.Añada 40 microlitros de la solución stock de enzima al 8% previamente preparada a cada pocillo después de volver a sellar con cinta de PTFE nueva. Coloque la placa sellada en una sujeción magnética para placas. Mezcle suavemente las muestras mediante inversión al menos 15 veces e incube a 50 grados Celsius durante 70 horas. Tras la incubación, se mezclan y centrifugan las placas de reactor.Luego, se utiliza un robot de manipulación de líquidos para realizar la cuantificación de glucosa y xilosa mediante ensayos colorimétricos ligados a enzimas, deshidrogenasa de xilosa, o XDH para la xilosa y glucosa oxidasa, peroxidasa, o GO PO D para la glucosa. La plataforma se configura con reservorios de reactivo GO PO D y XDH, así como agua para dilución y soportes de puntas de 200 microlitros con 96 canales para cada reactivo. Estas puntas se reutilizan para múltiples placas de reactor.La plataforma también contiene puntas de un solo uso de 200 microlitros para la eliminación de agua y la adición de estándares de azúcar, así como estándares de azúcar ya preparados. A partir de los viales HPLC del carrusel de almacenamiento, el robot introduce tres placas microtituladoras transparentes, una para realizar la dilución de la mezcla de hidrólisis y una para cada uno de los ensayos XDH y GoPod. La pinza mueve las cuatro placas a posiciones en la plataforma.Se llevan a bordo desde el carrusel puntas de 100 microlitros de un solo uso de 96 canales para usar en la transferencia desde el reactor a la placa de dilución y desde la dilución a las placas XDH y go pod. Utilizando la pipeta de ocho canales con alcance variable, se retira el agua que se agregó antes del pretratamiento de los tres pozos en cada esquina de la placa de reactor para evitar la transferencia cruzada a la placa de dilución. Dado que estos 12 pozos se utilizan para patrones de azúcar usando la cabeza de pipeteo de 96 canales.Con los tres puntas en cada esquina eliminados, se añaden 180 microlitros de agua a los pocillos de la placa de dilución. Después de cambiar las puntas, se transfieren los reactivo XD, H y go pod desde sus respectivos reservorios a sus placas de ensayo correspondientes. Utilizando la cabeza de pipeteo de 96 canales.Mientras esto ocurre, los patrones de azúcar se añaden a los tres pozos de cada esquina de la placa de dilución. Utilizando la cabeza de pipetaje de ocho canales, después de cambiar a puntas más pequeñas, se emplea la cabeza de pipetaje de 96 canales para transferir 20 microlitros del sobrenadante de hidrólisis a la placa de dilución, y la placa se mezcla mediante tri. La muestra debe aspirarse cerca de la parte superior del líquido para limitar la contaminación de las puntas por partículas de biomasa.Después de mezclar, se transfieren secuencialmente 20 microlitros. Utilizando la cabeza de pipeteo de 96 canales hacia las placas XDH y go pod. Después de que cada una se mezcla mediante el agitador, las puntas de muestra, el reactor y las placas de dilución se devuelven a un estante de desecho en el carrusel; las placas XDH y go pod se retiran hacia un estante de carrusel separado y se dejan reposar durante una hora antes de leerlas en el espectrofotómetro, utilizando un lector de placas de 96 pocillos con luz ultravioleta visible.Establezca la longitud de onda medida a 510 nanómetros y registre la absorbancia frente a un blanco de reactivo. A continuación, ajuste la longitud de onda medida en el lector de placas a 340 nanómetros y registre la absorbancia utilizando una espátula pequeña. Dispense aproximadamente cuatro miligramos de la biomasa preparada en un vaso de acero inoxidable de 80 microlitros diseñado para el muestreador automático del espectrómetro de masas.Utilizando un perforador estándar, produzca manualmente discos de filtro de vidrio a partir de hojas de fibra de vidrio tipo ad y cargue las muestras en los porta-muestras del muestreador automático usando pinzas; cargue las muestras aleatoriamente en los pocillos para evitar sesgos debidos a la deriva del espectrómetro a lo largo del tiempo. Después de realizar la calibración e ingresar los parámetros apropiados en el espectrómetro de masas, inicie la adquisición de datos y espere al menos 60 segundos para obtener datos suficientes para la recolección de espectros de fondo. Finalmente, inicie el método del muestreador automático utilizando un flujo de gas portador de helio de 0,9 litros por minuto.Un ejemplo de tendencias es un estudio de los compuestos recalcitrantes en 755 variantes naturales de álamo muestreadas en el noroeste del Pacífico. Los resultados indican que a medida que aumenta la relación entre la jeringa y la guía, el compuesto recalcitrante disminuye hasta una relación de aproximadamente dos, momento en el cual la mejora del compuesto recalcitrante se estabiliza. Aquí se pueden observar valores atípicos en los que el gen PT cuatro CL uno fue regulado a la baja.En álamo, varios de los cien cultivares analizados muestran claramente un aumento en los compuestos recalcitrantes, evidenciado por la reducción en la liberación de azúcares. Diferentes variedades de paja de trigo cultivadas en varios lugares y cosechadas tras diversas variaciones en las condiciones de crecimiento dieron lugar a 20 poblaciones distintas basadas en combinaciones de las variables anteriores. Estos conjuntos de muestras se distinguen fácilmente e indican variables positivas y negativas.Para la pirólisis de materiales recalcitrantes, se puede utilizar la espectrometría de masas con haz molecular para evaluar los cambios en la composición de la pared celular. Los fragmentos espectrales de masas se asignan a diferentes monómeros de lignina. Al comparar una muestra con alto contenido de lignina frente a otra con alto contenido de carbohidratos, las diferencias en los datos espectrales son evidentes.Se ilustra aquí el uso de datos de espectrometría de masas, junto con un análisis de componentes principales. El gráfico de cargas de los componentes principales puede ayudar a identificar qué características químicas se explican en el gráfico de clasificación de puntuaciones, así como a esclarecer qué características cambian entre los grupos de muestras. Una vez dominada, esta técnica puede utilizarse para analizar miles de muestras por semana si se realiza adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante ser lo más constante posible y comparar únicamente muestras dentro de un conjunto relacionado.Así, tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que otros investigadores trabajaran en métodos de cribado de alto rendimiento y otras áreas relacionadas con la recalcitrancia de la pared celular vegetal, utilizando elementos como líquidos iónicos y pretratamientos alcalinos. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar, manipular y analizar adecuadamente grandes conjuntos de muestras de biomasa a escala microscópica para detectar diferencias en la recalcitrancia, mediante la reducción de tamaño y extracción, el pretratamiento termoquímico y la hidrólisis enzimática. Tenga presente que trabajar con alta presión, vapor y equipos automatizados es extremadamente peligroso, y que deben tomarse todas las precauciones de seguridad, como el uso de equipo de protección personal, así como la instalación de dispositivos de seguridad interconectados en todo el equipo durante la realización de estos procedimientos.

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Investigación

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Entorno

La biomasa vegetal es uno de los principales de carbono-neutral recurso renovable que podría ser utilizado para la producción de biocombustibles. La biomasa vegetal se compone principalmente de las paredes celulares, un material compuesto estructuralmente complejos denomina lignocelulosa. Aquí se describe un protocolo para un análisis exhaustivo del contenido y la composición de la lignina polifenólicos.

Análisis Integral de la composición de las paredes celulares vegetales (biomasa lignocelulósica) Parte I: La lignina

Un método basado en la microscopía confocal de Raman que se presenta ofrece sin etiquetas de visualización de la lignina en las paredes celulares vegetales y comparación de lignificación en los diferentes tejidos, muestras o especies.

Sin etiquetas In situ Imágenes de lignificación de las paredes celulares vegetales

Este protocolo describe una pantalla de alto rendimiento para la actividad celulolítica de una biblioteca metagenómica expresado en Escherichia coli. La pantalla es la solución de base y altamente automatizado, y utiliza una olla de la química en microplacas de 384 y con la lectura final como una medida de la absorbancia.

Una pantalla de alto rendimiento para Biominería actividad de celulasa de bibliotecas metagenómicas

Se describe un método de bajo costo, de alto rendimiento para la detección de hongos en la actividad...

Cribado de alto rendimiento de la actividad endoglucanasa por hongos en Escherichia coli</em

Un método simple, rápido para determinar el potencial de la sacarificación de un gran número de muestras de biomasa vegetal se describe. La plataforma automatizada para este análisis consiste en la preparación de la biomasa vegetal para su análisis en placas de 96 pozos y la realización posterior de pretratamiento, hidrólisis y la cuantificación de los azúcares liberados.

De alto rendimiento de sacarificación de ensayo para materiales lignocelulósicos

Una interferencia de ARN de doble cadena (dsRNAi) técnica se emplea para regular a la baja la coenzima A reductasa cinamoilo maíz gen (ZmCCR1) a un menor contenido de lignina de la planta. La lignina regulación a la baja de la pared celular se visualiza mediante análisis microscópicos y se cuantifica por el método de Klason. Se analizan los cambios de composición de la hemicelulosa y la celulosa cristalina.

La lignina Down-regulación de<em&gt; Zea mays</em&gt; Vía dsRNAi y Análisis de lignina Klason

Técnicas de evolución y de aislamiento de adaptación se describen y se demostraron para producir derivados de la cepa Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 que son capaces de consumir rápidamente azúcares hexosa y pentosa mixtos en enzima sacarificadas hidrolizados undetoxified y acumular más de 40 g / L de etanol.

Las técnicas para la Evolución de la robusta levaduras que fermentan la pentosa para la bioconversión de lignocelulosa en etanol

Se describe un ensayo de alto rendimiento para el cribado enzimático. Este kit de ensayo multiplexado y listo para usar se compone de sustratos Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) preseleccionados y sustratos C insolubles complejos C hromogenicB iomass (ICB). Las enzimas diana son endoenzimas degradadoras de polisacáridos y proteasas.

La selección de alto rendimiento de los hidratos de carbono-El uso de enzimas que degradan la novela insoluble cromogénico sustrato de ensayo Kits

OrganoCat es un método para el pretratamiento y fraccionamiento de lignocelulosa en condiciones suaves en lignina, azúcares fermentables y pulpa de celulosa. En un sistema de disolvente bifásico biogénico de agua y 2-metiltetrahidrofurano con ácido 2,5-furancarboxílico como catalizador, los productos OrganoCat se separan in situ para una recuperación directa del producto.

Fraccionamiento de biomasa lignocelulósica mediante el proceso OrganoCat

El pretratamiento profundo a base de solvente y asistido por microondas eutéctico es un proceso verde, rápido y eficiente para el fraccionamiento lignocelulósico y la recuperación de lignina de alta pureza.

Extracción ultrarrápida de lignina de residuos lignocelulósicos mediterráneos inusuales

Este protocolo presenta un flujo de trabajo estándar de cribado de alto rendimiento para microorganismos industriales. Consiste en construir una biblioteca mutante mediante mutagénesis ARTP, realizar cribado positivo de gotas con microfluidica automatizada y, posteriormente, verificar los resultados. La fiabilidad del flujo de trabajo se validó mediante el cribado de cepas de B. coagulans de alto rendimiento.

Cribado de alto rendimiento de mutantes de Bacillus coagulans hiperproductores de ácido L-láctico utilizando una plataforma microfluídica automatizada de gotas

Aprenda métodos de alto rendimiento para evaluar la recalcitrancia de biomasa lignocelulósica mediante pretratamiento termoquímico e hidrólisis enzimática. Esta técnica permite identificar materiales óptimos para biocombustibles.

Selección de alto rendimiento de las Variaciones obstinación en lignocelulósica Biomasa: Total lignina, lignina Monómeros y enzimática Azúcar de lanzamiento (Video) | JoVE Journal

Selección de alto rendimiento de las Variaciones obstinación en lignocelulósica Biomasa: Total lignina, lignina Monómeros y enzimática Azúcar de lanzamiento

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