Selección de alto rendimiento de las Variaciones obstinación en lignocelulósica Biomasa: Total lignina, lignina Monómeros y enzimática Azúcar de lanzamiento

El objetivo general de este procedimiento es medir los recalcitrantes de la pretratamiento termoquímico y de la hidrólisis enzimática entre variantes relacionadas de biomasa. Esto se logra primero preparando las muestras de biomasa para su análisis mediante reducción de tamaño y extracción de almidón y azúcares solubles. El segundo paso consiste en dispensar la biomasa con alta precisión en placas de reactores de alto rendimiento compatibles termoquímicamente.

Las muestras se pretratan en un reactor de vapor. A continuación, las muestras se digieren con una celulasa comercial estándar durante tres días para hidrolizar la celulosa y la hemicelulosa. El paso final consiste en la determinación de la glucosa y xilosa liberadas durante la hidrólisis enzimática mediante los ensayos GO pod y XDH.

En última instancia, la cuantificación de alto rendimiento de glucosa y xilosa se utiliza para determinar la liberación relativa de azúcares entre muestras, expresada en gramos de azúcar por gramo de biomasa inicial. La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos a escala de laboratorio, como el pretratamiento y la hidrólisis enzimática a escala de banco, es que puede realizarse simultáneamente en cientos o incluso miles de muestras. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la conversión de biomasa, como cuáles cultivares o variantes son más susceptibles de convertirse en azúcares y en productos posteriores.

Por lo tanto, las implicaciones de esta técnica pueden extenderse hacia la comprensión de la estructura y función de la pared celular, ya que las mutaciones que generamos en la vía biosintética de la pared celular pueden cribarse para detectar cambios químicos estructurales. Este método puede proporcionar información sobre los componentes recalcitrantes de la pared celular vegetal. Asimismo, puede aplicarse a otros componentes de la conversión de la biomasa, como estudios de actividad enzimática y sinergia.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque implica conjuntos grandes de muestras de variantes de biomasa que deben manipularse de forma idéntica y simultánea a escala de miligramos. Por ello, se requiere robótica y equipo especializados. Para comenzar el procedimiento, coloque aproximadamente 250 miligramos de biomasa previamente molida procedente de una bolsa antiestática con código de barras en una bolsita numerada; enrolle cuidadosamente la bolsita asegurándose de doblar los extremos sobre la biomasa para evitar pérdidas durante la desnaturalización y la extracción. A continuación, cierre cada bolsita envolviéndola con alambre de cobre recubierto de estaño y registre el número de la bolsita para cada muestra con código de barras.

Añada 500 mililitros de una solución de enzima desamidante previamente preparada a un recipiente de plástico. Luego, añada 120 bolsitas de té a la solución enzimática tamponada para un protocolo de procesamiento por lotes. Después de la incubación en un agitador, enjuague y remoje la biomasa en varios litros de agua desionizada durante 30 minutos, tras un enjuague exhaustivo de la biomasa desamidata.

Para eliminar las sales del tampón, coloque las bolsitas de té en una columna de calcetín para la extracción. Configure el reflujo del calcetín utilizando etanol al 95% y extraiga las muestras durante 24 horas. Una vez completada la extracción, desenrolle las bolsitas de té y devuelva la biomasa seca al tubo original con código de barras.

Bolsas antiestáticas Transfiera al menos 50 miligramos de la biomasa seca a un depósito con código de barras. Escanee los códigos de barras de las bolsas antiestáticas y del depósito receptor para garantizar un seguimiento preciso de las muestras. Después de cargar los depósitos en un robot de pesaje sólido, pese robóticamente cinco miligramos de las muestras secas en acero inoxidable resistente a ácidos.

Las placas de 96 pocillos pesan tres réplicas de cada muestra distribuidas alrededor de la placa para minimizar cualquier variación localizada. A continuación, agregue 250 microlitros de agua desionizada a cada pocillo y selle las placas con cinta de politetrafluoroetileno (POLYTETRAFLUOROETHYLENE) o PTFE con respaldo adhesivo de silicona. Utilizando una punta de soldador de un octavo de pulgada, atraviese la cinta de PTFE en cada puerto de vapor.

Para cada placa, sujete firmemente las placas con juntas de PTFE reforzado con vidrio de 0,031 pulgadas de espesor entre las placas, y placas vacías en la parte superior e inferior de la pila. Someta las muestras a un pretratamiento utilizando un reactor de vapor ajustado a 180 grados Celsius durante 17,5 minutos. Al finalizar, enfríe las placas del reactor hasta 50 grados Celsius inundándolas con agua desionizada.

Cuando las placas estén frías, centrifúgelas en un rotor de cubeta oscilante a 1700 GS durante 20 minutos. Luego retire la película superior.

Añada 40 microlitros de la solución stock de enzima al 8% previamente preparada a cada pocillo después de volver a sellar con cinta de PTFE nueva. Coloque la placa sellada en una sujeción magnética para placas. Mezcle suavemente las muestras mediante inversión al menos 15 veces e incube a 50 grados Celsius durante 70 horas. Tras la incubación, se mezclan y centrifugan las placas de reactor.

Luego, se utiliza un robot de manipulación de líquidos para realizar la cuantificación de glucosa y xilosa mediante ensayos colorimétricos ligados a enzimas, deshidrogenasa de xilosa, o XDH para la xilosa y glucosa oxidasa, peroxidasa, o GO PO D para la glucosa. La plataforma se configura con reservorios de reactivo GO PO D y XDH, así como agua para dilución y soportes de puntas de 200 microlitros con 96 canales para cada reactivo. Estas puntas se reutilizan para múltiples placas de reactor.

La plataforma también contiene puntas de un solo uso de 200 microlitros para la eliminación de agua y la adición de estándares de azúcar, así como estándares de azúcar ya preparados. A partir de los viales HPLC del carrusel de almacenamiento, el robot introduce tres placas microtituladoras transparentes, una para realizar la dilución de la mezcla de hidrólisis y una para cada uno de los ensayos XDH y GoPod. La pinza mueve las cuatro placas a posiciones en la plataforma.

Se llevan a bordo desde el carrusel puntas de 100 microlitros de un solo uso de 96 canales para usar en la transferencia desde el reactor a la placa de dilución y desde la dilución a las placas XDH y go pod. Utilizando la pipeta de ocho canales con alcance variable, se retira el agua que se agregó antes del pretratamiento de los tres pozos en cada esquina de la placa de reactor para evitar la transferencia cruzada a la placa de dilución. Dado que estos 12 pozos se utilizan para patrones de azúcar usando la cabeza de pipeteo de 96 canales.

Con los tres puntas en cada esquina eliminados, se añaden 180 microlitros de agua a los pocillos de la placa de dilución. Después de cambiar las puntas, se transfieren los reactivo XD, H y go pod desde sus respectivos reservorios a sus placas de ensayo correspondientes. Utilizando la cabeza de pipeteo de 96 canales.

Mientras esto ocurre, los patrones de azúcar se añaden a los tres pozos de cada esquina de la placa de dilución. Utilizando la cabeza de pipetaje de ocho canales, después de cambiar a puntas más pequeñas, se emplea la cabeza de pipetaje de 96 canales para transferir 20 microlitros del sobrenadante de hidrólisis a la placa de dilución, y la placa se mezcla mediante tri. La muestra debe aspirarse cerca de la parte superior del líquido para limitar la contaminación de las puntas por partículas de biomasa.

Después de mezclar, se transfieren secuencialmente 20 microlitros. Utilizando la cabeza de pipeteo de 96 canales hacia las placas XDH y go pod. Después de que cada una se mezcla mediante el agitador, las puntas de muestra, el reactor y las placas de dilución se devuelven a un estante de desecho en el carrusel; las placas XDH y go pod se retiran hacia un estante de carrusel separado y se dejan reposar durante una hora antes de leerlas en el espectrofotómetro, utilizando un lector de placas de 96 pocillos con luz ultravioleta visible.

Establezca la longitud de onda medida a 510 nanómetros y registre la absorbancia frente a un blanco de reactivo. A continuación, ajuste la longitud de onda medida en el lector de placas a 340 nanómetros y registre la absorbancia utilizando una espátula pequeña. Dispense aproximadamente cuatro miligramos de la biomasa preparada en un vaso de acero inoxidable de 80 microlitros diseñado para el muestreador automático del espectrómetro de masas.

Utilizando un perforador estándar, produzca manualmente discos de filtro de vidrio a partir de hojas de fibra de vidrio tipo ad y cargue las muestras en los porta-muestras del muestreador automático usando pinzas; cargue las muestras aleatoriamente en los pocillos para evitar sesgos debidos a la deriva del espectrómetro a lo largo del tiempo. Después de realizar la calibración e ingresar los parámetros apropiados en el espectrómetro de masas, inicie la adquisición de datos y espere al menos 60 segundos para obtener datos suficientes para la recolección de espectros de fondo. Finalmente, inicie el método del muestreador automático utilizando un flujo de gas portador de helio de 0,9 litros por minuto.

Un ejemplo de tendencias es un estudio de los compuestos recalcitrantes en 755 variantes naturales de álamo muestreadas en el noroeste del Pacífico. Los resultados indican que a medida que aumenta la relación entre la jeringa y la guía, el compuesto recalcitrante disminuye hasta una relación de aproximadamente dos, momento en el cual la mejora del compuesto recalcitrante se estabiliza. Aquí se pueden observar valores atípicos en los que el gen PT cuatro CL uno fue regulado a la baja.

En álamo, varios de los cien cultivares analizados muestran claramente un aumento en los compuestos recalcitrantes, evidenciado por la reducción en la liberación de azúcares. Diferentes variedades de paja de trigo cultivadas en varios lugares y cosechadas tras diversas variaciones en las condiciones de crecimiento dieron lugar a 20 poblaciones distintas basadas en combinaciones de las variables anteriores. Estos conjuntos de muestras se distinguen fácilmente e indican variables positivas y negativas.

Para la pirólisis de materiales recalcitrantes, se puede utilizar la espectrometría de masas con haz molecular para evaluar los cambios en la composición de la pared celular. Los fragmentos espectrales de masas se asignan a diferentes monómeros de lignina. Al comparar una muestra con alto contenido de lignina frente a otra con alto contenido de carbohidratos, las diferencias en los datos espectrales son evidentes.

Se ilustra aquí el uso de datos de espectrometría de masas, junto con un análisis de componentes principales. El gráfico de cargas de los componentes principales puede ayudar a identificar qué características químicas se explican en el gráfico de clasificación de puntuaciones, así como a esclarecer qué características cambian entre los grupos de muestras. Una vez dominada, esta técnica puede utilizarse para analizar miles de muestras por semana si se realiza adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante ser lo más constante posible y comparar únicamente muestras dentro de un conjunto relacionado.

Así, tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que otros investigadores trabajaran en métodos de cribado de alto rendimiento y otras áreas relacionadas con la recalcitrancia de la pared celular vegetal, utilizando elementos como líquidos iónicos y pretratamientos alcalinos. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar, manipular y analizar adecuadamente grandes conjuntos de muestras de biomasa a escala microscópica para detectar diferencias en la recalcitrancia, mediante la reducción de tamaño y extracción, el pretratamiento termoquímico y la hidrólisis enzimática. Tenga presente que trabajar con alta presión, vapor y equipos automatizados es extremadamente peligroso, y que deben tomarse todas las precauciones de seguridad, como el uso de equipo de protección personal, así como la instalación de dispositivos de seguridad interconectados en todo el equipo durante la realización de estos procedimientos.