Evaluación de perigenital Sensibilidad y Prostática mástil activación celular en un modelo de ratón de la separación materna neonatal

El objetivo general del siguiente experimento es determinar el impacto del estrés temprano en la vida en el sistema urogenital midiendo la sensibilidad mecánica perigenital y la activación de los mastocitos dentro de la próstata en ratones machos C 57 negros seis que se sometieron a la separación materna neonatal. Esto se logra realizando primero la separación materna neonatal en camadas de crías de seis ratones negros C 57 para inducir estrés temprano en la vida durante 20 días consecutivos. El segundo paso es medir la sensibilidad mecánica perigenital mediante la aplicación de una serie de monofilamentos de Von Fre en la región perigenital.

A continuación, se realiza la tinción con azul de toluidina acidificado en secciones de criostato de próstata de ratón. Con el fin de cuantificar la activación de los mastocitos. Los resultados muestran que la separación materna neonatal aumenta la sensibilidad mecánica perigenital y la activación de los mastocitos protésicos según nuestros análisis conductuales e histológicos.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la prostatitis autoinmune experimental, es que incorpora la exposición al estrés durante el desarrollo temprano, lo que precipita una sintomatología más adelante en la vida, similar a lo que se observa en los pacientes con prostatitis crónica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del dolor pélvico crónico, como el impacto del estrés en los primeros años de vida en el comportamiento, y proporcionar evidencia histológica de estados de dolor alterados. Aunque este método puede proporcionar información sobre la prostatitis crónica, también se puede aplicar a otros síndromes de dolor funcional como la cistitis intersticial, el síndrome de la vejiga dolorosa, la vulvodinia, la fibromialgia o las migrañas.

Incluso se puede aplicar a otras comorbilidades psicológicas comunes como la ansiedad y la depresión Al día siguiente del nacimiento, retire a la madre de la jaula de casa y colóquela en un recipiente secundario limpio. Frote un puñado de ropa de cama entre las manos limpias y enguantadas para mantener el aroma de la jaula de casa, y luego transfiera una profundidad de uno a dos centímetros de la ropa de cama de la jaula de casa a un altavoz de vidrio de dos litros limpio y debidamente etiquetado. Además, aproximadamente a la mitad de cualquier material de cama de enriquecimiento adicional que esté presente en la jaula de la casa, como los nidos o el papel arrugado, al altavoz de vidrio a continuación, coloque a todos los cachorros de una sola camada en el vaso de precipitados preparado e inmediatamente coloque el vaso a 33 grados centígrados y 50% de humedad durante 180 minutos.

Durante el período de incubación separado, retire la madre del recipiente secundario y devuélvala a la jaula de origen. Regrese la jaula doméstica a su ubicación de alojamiento apropiada dentro del vivero. Al final del período de separación, recupere la jaula de la casa y retire la madre, colocándola en un contenedor secundario limpio.

Luego, retire el vaso de precipitados de la incubadora y deje caer un puñado de ropa de cama entre las manos limpias y enguantadas para mantener el aroma de la jaula doméstica mientras manipula a los cachorros. Mueva suavemente a las crías individualmente del vaso de precipitados a la jaula de inicio y devuelva cualquier enriquecimiento y ropa de cama que quede en el vaso de precipitados a la jaula de inicio. Una vez que se hayan devuelto todas las crías, mueva la madre del contenedor secundario a la jaula doméstica y devuélvala a su ubicación de alojamiento adecuada dentro del vivero.

Repita todo este procedimiento para cada camada que se someta a la separación materna neonatal todos los días hasta el día 21 postnatal. A continuación, desteta a las crías y colócalas en las mismas condiciones que los ratones de control durante todo el experimento. Prepare el área de prueba colocando una almohadilla absorbente debajo de una mesa superior de malla de alambre elevada de 55 centímetros de altura.

La mesa debe proporcionar suficiente espacio para permitir que el investigador se acerque desde la parte inferior sin asustar a los ratones. Coloque hasta 12 ratones de ocho semanas de edad individualmente debajo de cámaras de plástico perforado transparente en la parte superior de la mesa de malla de alambre. Coloca un objeto pesado encima de las cámaras para evitar que los ratones se escapen.

Sostenga la base de un monofilamento de marco von de tres puntos y 22 gramos y exponga el monofilamento retraído. Coloque la sonda de modo que el monofilamento quede orientado verticalmente. Cuando el ratón está alerta, inmóvil y su peso corporal se distribuye uniformemente entre las patas traseras.

Aplícalo en el lado izquierdo o derecho del escroto, evitando la línea media hasta que se observe una ligera curvatura en el filamento. Sostenga el monofilamento en su lugar durante 10 segundos o hasta que el animal muestre una respuesta positiva, como un tirón o salto enérgico o un comportamiento de lamido o mordida dirigido hacia el monofilamento. Si un ratón no se mueve ni muestra ninguna respuesta positiva durante la aplicación de monofilamento de diez segundos, registre una prueba de respuesta negativa todos los ratones utilizando el mismo tamaño de filamento y luego cambie al siguiente monofilamento apropiado.

Continúe probando cada mouse usando el siguiente monofilamento más grande o más pequeño, según corresponda, para cuatro aplicaciones adicionales. Después de observar la primera respuesta positiva, diseccionar y luego criocortar, fijó el tejido prostático de ratones de nueve semanas de edad en secciones criogénicas de siete micras de grosor. A continuación, prepare una solución madre de azul de toluidina al 1% añadiendo un gramo de azul de toluidina O a 100 mililitros de etanol al 70% y agite la mezcla hasta que se disuelva.

Almacene la solución madre a temperatura ambiente durante un máximo de tres semanas. En otro vaso de precipitados, agregue un gramo de cloruro de sodio a 100 mililitros de agua colocados encima de una placa para revolver. Ajuste el pH de la solución salina con ácido clorhídrico 12 molar hasta lograr un rango de pH de 0,5 a 1,0.

A continuación, prepare una solución de trabajo de azul toine acidificado al 0,25% combinando ocho mililitros de la solución de caldo azul de Udine y 32 mililitros de la solución ácida de cloruro de sodio al 1%. Cátelo hacia arriba y hacia abajo para asegurar la incorporación total de la solución madre azul de odido y mezcle con un vórtice, prepare la solución de trabajo fresca para cada lote de portaobjetos. Lave las secciones de tejido sumergiendo individualmente los portaobjetos durante aproximadamente un segundo en un tubo cónico de 50 mililitros que contenga un volumen suficiente de PBS para sumergir completamente el tejido.

Deje que los portaobjetos se sequen al aire sobre una toalla de papel. A continuación, coloque los portaobjetos en un frasco de pie de vidrio que contenga suficiente solución de trabajo azul de toluidina al 0,25% para garantizar que las secciones de tejido estén completamente sumergidas. Incube los portaobjetos durante 10 a 15 minutos mientras está en una plataforma de balancín a 15 RPM.

A continuación, sumerja las diapositivas en PBS durante aproximadamente un segundo para eliminar el exceso de azul udine alto y coloque las diapositivas en una caja de diapositivas de modo que las diapositivas queden de lado. Para permitir el drenaje. Seque los portaobjetos en un horno a 37 grados centígrados durante un mínimo de dos horas o toda la noche a temperatura ambiente.

Una vez secos, sumerja los portaobjetos en etanol al 95% durante aproximadamente un segundo y luego deje que la sección se seque por completo. Repita este procedimiento de una a 10 veces hasta que el tejido se seque más azul que morado. A continuación, sumerja los portaobjetos en etanol al 100% durante aproximadamente un segundo y deje que la sección se seque por completo.

Repita este procedimiento de una a 10 veces hasta que el tejido esté oscuro a azul medio, pero no morado. Por último, fija la mancha incubando los portaobjetos en xileno al 100% durante tres minutos. Deje que se sequen y luego cubra, deslice los portaobjetos con glicerol PPS o un medio de montaje permanente a base de xileno.

Drene el exceso de medios y guarde los portaobjetos terminados a temperatura ambiente. Cuando se probaron con una serie graduada de monofilamentos Von Frame, separación materna neonatal de ocho semanas de edad, los ratones mostraron alodinia mecánica perigenital en comparación con sus contrapartes naïve. Esto se evidencia como una reducción significativa en el umbral de retirada mecánica que provocó una respuesta conductual positiva.

Se puede ver evidencia adicional de síndrome de dolor pélvico crónico histológicamente que se muestra aquí secciones de criostato de tejidos prostáticos que se tiñeron con azul de toluidina acidificado para observar los gránulos de triptasa alojados dentro de los mastocitos. Se observó un porcentaje significativamente mayor de mastocitos granulados en secciones de próstata de ratones de separación neonatal. En comparación con los ratones ingenuos Al realizar la separación materna neonatal, es importante recordar mantener el olor de la jaula doméstica para evitar el rechazo de las crías por parte de la madre que sigue este procedimiento.

Otros métodos, como las pruebas de campo abierto o la preferencia de líquidos de dos opciones, se pueden utilizar para evaluar la evidencia conductual de los trastornos comórbidos del estado de ánimo. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo evaluar la sensibilidad mecánica perigenital y la activación prostática de los mastocitos como evidencia conductual e histológica de prostatitis crónica y ratones después de la separación materna neonatal.