Generación del paciente con cáncer de próstata Derivado modelos de xenoinjertos de células tumorales circulantes

Este manuscrito detalla un método utilizado para generar xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer de próstata (PDX) a partir de células tumorales circulantes (CTC). La generación de modelos PDX a partir de CTCs proporciona un modelo experimental alternativo para estudiar el cáncer de próstata; Es el tumor más comúnmente diagnosticado y una causa frecuente de muerte por cáncer en los hombres.

El objetivo general del siguiente protocolo es generar cáncer de próstata. Xenoinjerto derivado por el paciente de células tumorales circulantes. Esto se logra recolectando primero sangre periférica de pacientes con cáncer de próstata avanzado.

Como segundo paso, se aísla el compartimento de las células mononucleares de la sangre, que contiene las células tumorales circulantes. A continuación, las células mononucleares se tiñen con un anticuerpo CD 45 ZI Para seleccionar las células tumorales circulantes mediante citometría de flujo, las células se inyectan en ratones inmunocomprometidos. Los resultados muestran la generación de xenoinjertos de cáncer de próstata basados en la inyección de células tumorales circulantes aisladas por citometría de flujo de la sangre periférica de pacientes con cáncer de próstata.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del cáncer de próstata mediante la generación de nuevos modelos experimentales que se pueden utilizar para la caracterización molecular del cáncer de próstata y el desarrollo de nuevos biomarcadores. Williams, un estudiante del laboratorio, y Omada, un investigador del departamento de oncología aquí en Mount Sinai, demostrarán el procedimiento para comenzar a recolectar sangre completa de pacientes seleccionados con cáncer de próstata metastásico, ya que tienen el potencial de tener un alto número de células tumorales circulantes en su sangre periférica. Usando una pipeta serológica de 10 mililitros, transfiera la sangre entera a un tubo cónico de poliestireno de 50 mililitros, junto con la solución salina equilibrada de Hank.

En una proporción de uno a uno, pipetee suavemente la mezcla para homogeneizarla. A continuación, agregue 15 mililitros de una solución de paquete de llamada FI a un tubo cónico de poliestireno vacío de 50 mililitros. Pipetee suavemente 20 mililitros de sangre entera diluida, utilizando el ajuste más bajo en la parte superior de la solución para formar una capa superior distintiva.

A continuación, centrifugar el tubo a 400 Gs durante 30 minutos. A temperatura ambiente, ajuste la desaceleración de la centrífuga al nivel más bajo para evitar que se mezclen las soluciones después de la separación. Después de la centrifugación, identifique la franja delgada, blanca y gris de las células mononucleares de sangre periférica y las células tumorales circulantes intercaladas entre la capa superior de plasma y la solución de separación.

En la parte inferior del tubo, recoja con cuidado las células de la franja gris blanca y transfiéralas a un tubo de poliestireno de 50 mililitros. Con una pipeta de transferencia de plástico, agregue Hank's. Equilibre la solución salina a las células aisladas para un volumen total de 10 mililitros.

Centrifugar la mezcla de nuevo a 400 Gs durante 10 minutos a temperatura ambiente. Para lavar las células, retire el sobrenadante y repita este lavado. Da un paso más.

Después del segundo lavado, deseche el sobrenadante. Suspenda el pellet restante en cinco mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos e incube la solución durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, centrifugar la muestra a 400 Gs durante tres minutos a temperatura ambiente y eliminar el tampón de lisis desechando el sobrenadante.

Finalmente, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de PBS suplementado con un 10% de suero bovino fetal antes de la tinción. Cuantifique el número de células viables utilizando el método estándar de exclusión de azul trian en un hemo, citómetro o contador de células automatizado. Luego diluya las células a 1 millón de células por mililitro en PBS con 10% de FBS y colóquelas en hielo durante una hora.

Para bloquear la unión inespecífica, distribuya la suspensión celular en dos tubos separados. Etiquete un tubo para las células de control y otro para las células de tinción CD 45 en el tubo de control. Agregue IgG un Kappa Zi en una dilución de uno a 250 hasta una concentración final de 10 nanogramos por mililitro.

En el tubo de tinción CD 45. Añadir el anticuerpo primario conjugado CD 45 ZI a la misma concentración de 10 nanogramos por mililitro e incubar las suspensiones celulares en hielo durante 30 minutos. A continuación, centrifuga las células a 400 G durante tres minutos a cuatro grados centígrados y luego desecha el snat.

Lave las células dos veces suspendiendo cada pellet en PBS estéril suplementado con 10% de FBS, seguido de una centrifugación a 400 Gs durante tres minutos a cuatro grados centígrados. Después de lavar el resus, suspenda las células en una solución de un mililitro de PBS que contenga 10 microgramos por mililitro de tinte moteado. Filtre la solución final a través de tapas de filtro de 35 micrómetros en tubos de poliestireno de 12 milímetros por 75 milímetros para excluir cualquier grupo de células o desechos.

A continuación, excluya las células CD 45 positivas y las células muertas de la suspensión mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia para eliminarlas como se describe en el protocolo de texto adjunto. Mezcle la suspensión de células tumorales de próstata clasificadas con proteínas de la matriz extracelular en una proporción de uno a uno y coloque la mezcla en hielo. A continuación, anestesiar la boca de un hombre de ocho a 10 semanas de edad con inmunodeficiencia de acuerdo con las directrices institucionales utilizando iso flúor inhalado al 5% en un litro por minuto de oxígeno.

Asegúrese de que la anestesia sea adecuada comprobando si hay pérdida de reflejo corneal y toal en el ratón. Extraiga 250 microlitros de la suspensión celular con una aguja de calibre 25 y una jeringa de un mililitro. A continuación, inyecte todo el volumen de la suspensión celular de la matriz extracelular por vía subcutánea en ambos flancos superiores de los tumores del monitor de ratón realizando la palpación semanal de los sitios de inyección del ratón para el crecimiento de las densidades nodulares subcutáneas.

Sobre la base del método de selección negativa utilizado en este protocolo, es necesario excluir las células muertas mediante la tinción DAPI. Como se muestra aquí, el porcentaje de células CD 45 negativas de las células viables restantes es variable y depende de la carga tumoral del paciente, pero se separan fácilmente de las células CD 45 positivas. Cuando se utiliza la compuerta adecuada, después de la implantación de la suspensión de células tumorales de próstata, las densidades nodulares subcutáneas se harán visibles en ambos flancos del ratón.

Cada densidad nodular representa el crecimiento del xenoinjerto y puede apreciarse como algo distinto del tejido sano, ya que sobresale de la musculatura dorsal del ratón y tiene una textura más firme. Los modelos de xenoinjertos derivados de pacientes generados a partir de células tumorales circulantes recapitulan los tumores de próstata humanos según se observa mediante tinción de hemat, toin y eosina, y mediante inmunohistoquímica para marcadores celulares específicos de la próstata, como el receptor de andrógenos y el antígeno de membrana prostático específico después de generar los xenoinjertos. Se pueden realizar otros protocolos, como el perfil de expresión de genes o proteínas, para explorar los mecanismos celulares y moleculares que contribuyen a la agresividad del cáncer de próstata.