Name: Trabajar con Tejidos Humanos para la Investigación del Cáncer Traslacional (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Aprenda métodos de procesamiento de tejidos humanos para investigación oncológica traslacional. Optimice la extracción de datos de muestras quirúrgicas limitadas y mejore el análisis de mutaciones, vías activadas y subtipos de células inmunes.

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Este trabajo fue apoyado por las contribuciones filantrópicas de la Fundación Conmemorativa John G. y Marie Stella Kenedy (Subvención #0727033) y la Alianza para la Investigación del Melanoma. Los autores desean agradecer al Banco Institucional de Tejidos (ITB) del MD Anderson Cancer Center de la Universidad de Texas por coordinar la distribución y recolección de tejidos y facilitar la investigación traslacional, así como al Dr. Ignacio Wistuba, al Dr. Víctor Prieto, al Departamento de Patología del MD Anderson Cancer Center y al Programa Moon Shot de Melanoma. Por último, los autores desean expresar su reconocimiento a todos los pacientes y familiares afectados por el melanoma.

Declaración de ética: Este protocolo está aprobado por el MD Anderson Cancer Center de la Universidad de Texas.
1. Adquisición de muestras
<ol>
	<li>Recoja muestras de tejido de investigación del tumor sobrante y del tejido normal relacionado10-12. Almacene las muestras sobre hielo húmedo para evitar la autólisis.</li>
	<li>Enviar todos los tejidos, dispositivos médicos y cuerpos extraños extraídos durante un procedimiento quirúrgico al Departamento de Patología para el examen necesario con el fin de facilitar un diagnóstico patológico.</li>
	<li>Manejar el tejido asignado para la investigación de acuerdo con las políticas y procedimientos aplicables de investigación y almacenamiento de tejidos. 
	NOTA: La recolección de muestras biológicas implica la coordinación de patólogos, asistentes de patólogos, histotecnólogos y especialistas en obtención de tejidos.</li>
</ol>
2. Aseguramiento de la calidad de la patología (QA) 
<ol>
	<li>Complete y verifique los registros de los pacientes como una medida temprana de control de calidad y consulte a un patólogo para revisar los registros de diagnóstico del paciente (informes de patología, portaobjetos de tejido, etc.) y las muestras de tejido. Juzgar las muestras de tejido en función de las características morfológicas de interés, como el porcentaje de tumor, la necrosis, la interfase tejido-tumoral, etc. Esto está de acuerdo con las mejores prácticas de biorepositorios10-12.</li>
	<li>Después de la revisión inicial, realizar revisiones periódicas de los datos del repositorio biológico y las muestras de investigación durante toda la duración de la estadía del espécimen biológico.</li>
	<li>Vincule los resultados y las anotaciones de las investigaciones histopatológicas y de otro tipo con las muestras y proporcione estos datos a los investigadores a través de un sistema de software de biorepositorio patentado. 
	NOTA: Los procesos de control de calidad garantizan la integridad de los aspectos clínicos y técnicos de las operaciones de los biorepositorios.</li>
	<li>Realizar pruebas genéticas y moleculares para verificar y caracterizar las muestras para uso clínico.</li>
	<li>Recopile y analice datos basados en los comentarios de los investigadores que han estado utilizando las muestras para experimentos de laboratorio. Realice un seguimiento de las muestras mediante la tecnología de códigos de barras. Este sistema de seguimiento electrónico también se recomienda en las mejores prácticas de biorrepositorio10-12.</li>
</ol>
3. Procesamiento de muestras/tejidos 
<ol>
	<li>Guarde siempre las muestras de tejido fresco en hielo húmedo y procese lo más rápido posible para limitar los cambios inducidos por la extracción de la muestra de tejido de su entorno natural. Procese las muestras de tejido tumoral normal y compatibles con el tumor por separado para evitar la contaminación cruzada. 
	NOTA: Con base en los protocolos de investigación, el procesamiento de muestras biológicas puede implicar la recolección de las muestras en uno o más tipos de medios.</li>
	<li>Antes de comenzar el proceso, prepare una placa de cultivo de Petri estéril, un bisturí, así como una aguja o pinzas para el procesamiento de tejidos. Asegúrese de que los tubos hayan sido preparados, etiquetados y dispuestos para limitar el tiempo de procesamiento de la muestra (Figura 2).</li>
	<li>Toda la información relevante de los tejidos, como el nombre del paciente, el número, el tratamiento, la fecha de la cirugía y otra información relevante que pueda ser apropiada para el estudio, debe ser fácilmente accesible en una base de datos institucional de tejidos. La información limitada del paciente debe conservarse en el laboratorio en papel o en hojas de cálculo. 
	NOTA: Solo recopile información de muestras biológicas relevante para la naturaleza de la investigación, es decir, investigación biomédica básica, investigación clínica, investigación traslacional, etc. Para obtener información específica de la enfermedad, el personal del repositorio biológico debe recopilar los datos que la bibliografía actual y las organizaciones gubernamentales consideren necesarios para garantizar un diagnóstico adecuado y una investigación significativa. Esto incluye, entre otros, los grados del tumor y la estadificación del cáncer.</li>
	<li>Planifique todos los experimentos posteriores deseados con anticipación, para decidir el tamaño de las secciones de tejido necesarias para cada tipo de análisis, así como la ubicación de las escisiones. Idealmente, aunque sea imposible, todos los análisis deben ser representativos de toda la sección de tejido para tener en cuenta la heterogeneidad del tejido y limitar el sesgo de los análisis posteriores. Coloque todos los elementos necesarios con anticipación como se muestra en la Figura 2.</li>
	<li>Coloque la muestra de tejido en la placa de cultivo de Petri abierta, plana contra la superficie. 
	NOTA: Permitir que solo el personal autorizado del repositorio biológico maneje muestras identificadas y revise los datos de salud identificados. Los investigadores deben acceder solo a los identificadores de pacientes según lo permitido por los consentimientos informados firmados y según lo regulado por el IRB. Todos los especímenes deben estar adecuadamente etiquetados y deben incluir, como mínimo, un número de identificación de tejido único y un tipo de tejido. No incluya ninguna PHI en las etiquetas, de acuerdo con las regulaciones de HIPAA.</li>
	<li>Inspeccione la muestra desde todos los ángulos para comprender mejor su estructura y dimensiones. Fije la muestra en el fondo de la placa con la aguja y proceda a dividir el tejido a lo largo de su eje más grande y mejor representativo.</li>
	<li>Corte un pequeño trozo de tejido y colóquelo en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml que contenga 1 ml de solución estabilizadora de ARN. Esta muestra puede colocarse en hielo durante el resto del proceso y almacenarse a 4 °C hasta que se necesite. 
	NOTA: Cuando se trabaja con ARN, siempre se deben usar guantes y se deben usar puntas de filtro sin ARNasa para limitar las posibilidades de degradación y contaminación del ARN.</li>
	<li>Coloque un casete de biopsia abierto y preetiquetado en la tapa de la placa de cultivo de Petri. Corte una rodaja de pañuelo de papel de no más de 3 a 5 mm de grosor y transfiérala al casete. Coloque el casete en formalina tamponada neutra (NBF) al 10% durante un mínimo de 72 horas. Transfiera el casete en etanol al 70% para su almacenamiento a largo plazo antes de la inclusión en parafina. 
	NOTA: El etiquetado de los casetes debe realizarse con lápiz o con los marcadores recomendados, ya que el uso de xileno durante el procesamiento borrará las etiquetas.</li>
	<li>Corta un pedazo de pañuelo y colócalo en un molde de pañuelo. Cubra la sección de tejido con un compuesto de temperatura óptima de corte (OCT) y congélela inmediatamente a -20 °C para la criosección. Esta sección de tejido puede almacenarse a -20 °C hasta que esté lista para la criosección.</li>
	<li>Cortar uno o varios trozos de tejido y transferirlos a un tubo de 50 ml que contenga tampón MACS (1x solución salina tamponada con fosfato (PBS), 0,5% de suero fetal bovino (FBS), 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)) para su posterior análisis por citometría de flujo. Para la citometría de flujo, pueden ser preferibles muestras más grandes, ya que las células pueden perderse durante la disociación del tumor, la fijación celular y la permeabilización cuando sea necesario. Generalmente, esta sección se puede tomar al final, una vez que se hayan procesado todas las demás piezas. La muestra tumoral representativa sobrante se puede utilizar para la citometría de flujo. Opcionalmente, este tubo puede almacenarse a 4 °C O/N o utilizarse para la tinción por citometría de flujo inmediatamente después de la digestión en una suspensión celular (consulte el Paso 4 - Tinción por citometría de flujo).</li>
	<li>Corte el resto del tejido en trozos no mayores que un tamaño máximo de 0,5 mm x 0,5 mm y transfiéralos a viales criogénicos para su congelación inmediata en nitrógeno líquido. Estas muestras congeladas pueden utilizarse para futuros análisis y fines de colaboración. 
	NOTA: Se debe tener especial cuidado al trabajar con nitrógeno líquido, ya que el contacto directo puede causar lesiones graves. Los ojos deben protegerse con gafas de seguridad, con protectores laterales o con un protector facial. También se deben usar guantes criogénicos para protegerse de las quemaduras por nitrógeno líquido causadas por salpicaduras y contacto directo. Los guantes deben ajustarse correctamente, pero deben estar lo suficientemente sueltos como para quitarlos rápidamente en caso de que el nitrógeno líquido salpique en ellos.</li>
</ol>
4. Tinción por citometría de flujo
<ol>
	<li>Homogeneización de tejidos
	<ol>
		<li>Prepare el medio de digestión con DMEM (40 ml), DNasa I (50 U/ml) y colagenasa I (2 mg/ml). Coloque el tumor fresco o almacenado en O/N en el tampón MACS en la tapa de una placa de Petri y sumérjalo en un medio de digestión. 
		NOTA: Existen diferentes métodos de digestión, cada uno con ventajas (es decir, expresión de proteínas en la superficie celular, viabilidad). Asegúrese de tener el método adecuado para la aplicación posterior deseada.</li>
		<li>Sujeta el tumor al fondo del plato con una aguja y córtalo desde el exterior hasta el centro con un bisturí, hasta que el tumor tenga una textura pastosa. Transfiera la mezcla tumoral a un tubo de 50 ml, selle y colóquelo en una bolsa de plástico para evitar fugas. Transfiera el tubo a una incubadora y gírelo a 225 RPM, 37 °C, 1 hora.</li>
		<li>Filtre la suspensión de células tumorales a través de un filtro de células de 70 μm. Suspensión de la célula centrífuga a 250 x g, 4 °C, 5 min. Vuelva a suspender el pellet celular en 1 ml de tampón FACS (500 ml de PBS, 1 ml de EDTA de 0,5 M de caldo, 10 ml de FCS o FBS).</li>
		<li>Cuente las células con un hemocitómetro y vuelva a suspender a una concentración de 1x107 células/ml. Transfiera 100 μl por pocillo (106 células) en una placa inferior redonda de 96 pocillos para la tinción.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Viabilidad y tinción de anticuerpos
	<ol>
		<li>Añadir 200 μl de solución de tinción de viabilidad a cada pocillo y mezclar. Incubar durante 30 minutos, a 4 °C, en la oscuridad. Centrifugar las células a 250 x g, 4 °C, 5 min, y aspirar el sobrenadante.</li>
		<li>Añadir la mezcla de anticuerpos a la concentración recomendada/titulada (según el fabricante) para los antígenos de superficie en 200 μl de tampón FACS. Incubar las células a 4 °C, 30 min, en la oscuridad. Centrifugar las células a 250 x g, 4 °C, 5 min, y aspirar el sobrenadante.</li>
		<li>Lavar con 200 μl de tampón FACS, centrifugar las células a 250 x g, 4 °C, 5 min, y aspirar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en 200 μl de tampón FACS y proceda a la citómetro de flujo para su adquisición y análisis. 
		NOTA : Si realiza tinción por citometría de flujo intracelular, realice las etapas de fijación y permeabilización y la tinción intracelular entre las etapas 4.2.2 y 4.2.3. Si se realiza la tinción de citocinas, las células deben preactivarse antes de la tinción, según se recomienda, y se debe utilizar un inhibidor del transporte y la secreción de proteínas intracelulares, como la monensina, durante la activación para garantizar la retención de los factores solubles. Las células fijas pueden almacenarse a corto plazo (una semana) a 4 °C en la oscuridad antes de su adquisición en un citómetro de flujo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Biology.+Fixing+problems+with+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell Biology. Fixing problems with cell lines.</a> Science. 346, 1452-1453 (2014).</li>
<li>van der Worp, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+animal+models+of+disease+reliably+inform+human+studies%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Can animal models of disease reliably inform human studies.</a> , PLoS Med. 7, e1000245 (2010).</li>
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<li>Collection, Storage, Retrieval and Distribution of Biological Materials for Research. , 3rd ed., International Society for Biological and Environmental Repositories. Available from:
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<li>NCI Best Practices for Biospecimen Resources. , 2nd ed., Office of Biorepositories and Biospecimen Research. Available from:
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<li>Ruffell, B., et al. Leukocyte composition of human breast cancer. Proc. of the Ntnl. Aca. of Sci. 109, 2796-2801 (2012).</li>
<li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShapiro%2C+HM+%22Practical+flow+cytometry%22">Practical flow cytometry</a>. , John Wiley & Sons. (2005).</li>
<li>Baker, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+phosphoprotein+as+a+biological+marker+of+tumor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Stability of phosphoprotein as a biological marker of tumor signaling.</a> Clin. Cancer Res. 11, 4338-4340 (2005).</li>
<li>Jacobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+processing+considerations+for+detecting+copy+number+changes+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">Sample processing considerations for detecting copy number changes in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2012, 1195-1202 (2012).</li>
<li>Chung, J. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+in+tissue+handling+and+processing+that+impact+RNA+obtained+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Factors in tissue handling and processing that impact RNA obtained from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> J. Histochem. Cytochem. 56, 1033-1042 (2008).</li>
<li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+procedure+for+protein+extraction+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues+for+reverse+phase+protein+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">An efficient procedure for protein extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues for reverse phase protein arrays.</a> Proteome Sci. 10, 1477-5956 (2012).</li>
<li>Feldman, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+mRNA+amplification+for+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Advantages of mRNA amplification for microarray analysis.</a> Biotechniques. 33, 906-914 (2002).</li>
<li>Francino, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+real-time+PCR+assay+for+diagnosis+and+monitoring+of+canine+leishmaniosis%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Advantages of real-time PCR assay for diagnosis and monitoring of canine leishmaniosis.</a> Vet Parasitol. 137, 214-221 (2006).</li>
<li>Grunberg-Manago, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Messenger+RNA+stability+and+its+role+in+control+of+gene+expression+in+bacteria+and+phages%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Messenger RNA stability and its role in control of gene expression in bacteria and phages.</a> Annu. Rev. Genet. 33, 193-227 (1999).</li>
<li>Lesnik, E. A., Freier, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+thermodynamic+stability+of+DNA%2C+RNA%2C+and+DNA%3ARNA+hybrid+duplexes%3A+relationship+with+base+composition+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Relative thermodynamic stability of DNA, RNA, and DNA:RNA hybrid duplexes: relationship with base composition and structure.</a> Biochemistry. 34, 10807-10815 (1995).</li>
<li>MacBeath, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarrays+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Protein microarrays and proteomics.</a> Nat Genet. 32, 526-532 (2002).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.

En última instancia, los métodos de procesamiento deben estar dictados por la hipótesis deseada y los ensayos técnicos anticipados que se realizarán (Figura 1). La siguiente sección sirve como una descripción general para describir los posibles ensayos que se pueden realizar en dichas secciones de tejido. No es de ninguna manera una descripción exhaustiva, pero está destinado a ayudar a guiar los métodos de procesamiento de muestras y la elección de ensayos posteriores mediante la descripción de técnicas...

La investigación médica se ha beneficiado enormemente del estudio tanto de líneas celulares humanas como de modelos animales. Las líneas celulares permiten un mejor control de los componentes de un sistema, así como el uso de células del organismo adecuado. El trabajo con células humanas, aunque más representativo, presenta una instantánea drásticamente simplificada de los mecanismos que pueden ser responsables de la salud y la enfermedad, ya que las líneas celulares pueden no recapitular el impacto de otras células, componentes estromales y órganos que puedenafectar las respuestas. Por otro lado, los modelos animales, aunque no son del todo precisos en la reproducción de enfermedades humanas y heterogeneidad genética, ofrecen más información al permitir la entrada de sistemas animales completos en la mayoría de los modelos2,3.
Dejando a un lado las deficiencias, ambos métodos tienen sus beneficios y son complementarios. Sin embargo, el objetivo principal sigue siendo estudiar las células y los órganos humanos, en un sistema multiorgánico de cuerpo completo. En consecuencia, la investigación traslacional ha dado grandes pasos para facilitar el estudio de los órganos y tejidos humanos extraídos de los pacientes, con el fin de comprender mejor los mecanismos subyacentes a la enfermedad. La investigación traslacional ofrece la ventaja de estudiar el resultado de tratamientos y enfermedades en todo el cuerpo y en células apropiadas, proporcionando así lo mejor de ambos mundos entre el trabajo celular y animal4.
La investigación traslacional tampoco está exenta de defectos. Los especímenes recolectados de pacientes humanos, una vez retirados del huésped, se someten inmediatamente a isquemia y otros factores externos de los que, de otro modo, estarían protegidos. Esto puede dar lugar a cambios moleculares y genéticos inducidos por el estrés, y causar sesgos en estudios posteriores. Por lo tanto, se ha puesto mucho esfuerzo en la extracción y el procesamiento de tejidos a través de métodos estrictos para preservar mejor la integridad de los órganos y las células para los estudios posteriores5. Es importante destacar que las aplicaciones futuras deben considerarse detenidamente a la hora de seleccionar los métodos de procesamiento de muestras humanas, ya que ciertos métodos pueden ser perjudiciales para los componentes celulares y las vías de señalización, sin afectar a otros.
Para cualquier investigación que involucre tejidos humanos, se deben abordar los problemas regulatorios. Después de los informes Tuskegee y Belmont, hubo una creciente aceptación del hecho de que la investigación biomédica estaba asociada con riesgos inherentes que a menudo resultaban en dilemas éticos inevitables6. Se reconoció la necesidad de normas nacionales y el gobierno federal creó las Juntas de Revisión Institucional (IRB) como medio para defender los principios del Informe Belmont (Respeto a las personas, Beneficencia, Justicia).
El IRB de cualquier institución es un comité de médicos, investigadores y miembros de la comunidad que son responsables de proteger a los participantes en la investigación. Requiere que se obtenga el consentimiento voluntario de todos los participantes de los estudios de investigación biomédica, y que este consentimiento se documente en un formulario de consentimiento informado. El proceso de consentimiento informado tiene como objetivo proporcionar información adecuada a un participante, de modo que se pueda tomar una decisión informada sobre si inscribirse o no en un estudio, o continuar participando. En este sentido, el documento de consentimiento informado debe tener buena legibilidad y estar redactado en un lenguaje que pueda ser fácilmente comprensible (nivel de lectura de6º a8º grado) por la población objetivo. Se debe reducir al mínimo la posibilidad de coerción o influencia indebida, y se debe dar al sujeto tiempo suficiente para considerar la participación. El participante también debe poder ejercer su derecho a retirar el consentimiento en cualquier momento durante el curso del estudio sin penalización. El consentimiento informado voluntario es un requisito previo obligatorio para la participación de un sujeto en la investigación y también tiene efecto legal7.
De acuerdo con las regulaciones para la protección de sujetos humanos 21 CFR 50.25 (<a href="http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html">http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html</a>8), los participantes del estudio deben ser informados del propósito de la investigación, los procedimientos involucrados en la investigación, las alternativas a la participación, todos los riesgos y molestias previsibles (incluyendo no solo lesiones físicas, sino también posibles lesiones psicológicas, sociales o daño económico, incomodidad o inconveniencia), beneficios de la investigación para la sociedad y posiblemente para el individuo, tiempo durante el cual se espera que el sujeto participe, persona a contactar para obtener respuestas a preguntas o en caso de una lesión o emergencia relacionada con la investigación, declaración que indique que la participación es voluntaria y que la negativa a participar no tendrá ninguna consecuencia ni ninguna pérdida de beneficios, como un compromiso en la atención clínica regular que el participante Por lo demás, tiene derecho a recibir como resultado de sus diagnósticos y, finalmente, una declaración sobre el derecho del sujeto a la confidencialidad y el derecho a retirarse del estudio en cualquier momento sin ninguna consecuencia. Las muestras de tejido de los participantes que retiren su consentimiento durante el transcurso del estudio no deben almacenarse en bancos y deben agotarse inmediatamente. La renuncia a uno o más elementos del consentimiento informado puede obtenerse del IRB para algunos proyectos de investigación que prácticamente no podrían realizarse sin una alteración de los elementos requeridos o para estudios en los que los elementos requeridos no son aplicables. Se debe tener mucho cuidado para garantizar la confidencialidad de los datos. La Ley de Portabilidad y Responsabilidad de Seguros Médicos (HIPAA, por sus siglas en inglés) es una ley federal que impide el uso o la divulgación de "Información Médica Protegida" (PHI, por sus siglas en inglés) sin el consentimiento por escrito de los participantes. La PHI incluye, pero no se limita a, información de salud transmitida o mantenida en cualquier forma o medio, e incluye campos que podrían usarse para identificar a una persona9.
A través de este trabajo, nuestro objetivo es delinear el protocolo que se debe seguir durante el procesamiento de tejidos, incluida la obtención y el almacenamiento, y enfatizar la importancia de seguir estas pautas estrictas para minimizar los sesgos que pueden resultar debido a las tensiones a las que se somete un tejido durante la extracción. También nos esforzamos por proporcionar una breve descripción general de los ensayos o análisis posteriores (Figura 1) que se podrían realizar en dichos especímenes para que los lectores puedan hacer un juicio calificado sobre qué ensayo (s) se adapta mejor a sus necesidades.

<table><tbody><tr><td>Agujas</td><td>BD</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>Bisturíes desechables de acero inoxidable</td><td>Miltex</td><td>4-410</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Casetes de biopsia</td><td>Thermo Fisher</td><td>58931</td><td></td></tr><tr><td>Solución estabilizadora de ARN</td><td>Ambion</td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Tubos Eppendorf</td><td>Phenix</td><td>MAX-815</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 50 ml</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalina tamponada neutra</td><td>Productos médicos</td><td>StatLab 28600-5</td><td></td></tr><tr><td>Contenedores de formalina</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-032-059</td><td></td></tr><tr><td>Solución de temperatura de corte óptima (OCT)</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura Finetek</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa I</td><td>Roche</td><td>11088793001</td><td></td></tr><tr><td>70&mu; Filtros de células m</td><td>BD Bioscience</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Placas inferiores redondas de 96 pocillos</td><td>Corning</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tinción Vivo/Muerto</td><td>Life Technologies</td><td>L34957</td><td></td></tr></tbody></table>

trabajar con tejidos humanos para la investigación del cáncer traslacional

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

La investigación médica para beneficio humano se ve obstaculizada en gran medida por la necesidad de tejidos y sujetos humanos. Sin embargo, al obtener el consentimiento para los especímenes humanos, las muestras preciosas deben manipularse con el mayor cuidado para garantizar la integridad de los órganos, tejidos y células en el más alto grado. Desafortunadamente, el procesamiento de tejidos, por definición, requiere la extracción de tejidos del huésped, un cambio que puede causar un gran estrés celular y tener importantes repercusiones en los análisis posteriores. Estas tensiones podrían dar lugar a que el espécimen ya no sea representativo del sitio del que se extrajo. Por lo tanto, se debe seguir un protocolo estricto mientras se procesan estos especímenes para garantizar la representatividad. También se deben tener en cuenta los ensayos deseados para garantizar que se utilice una técnica óptima para el procesamiento de la muestra. A continuación se describe un protocolo para la recuperación de tejidos, el procesamiento y diversos análisis que se pueden realizar en el tejido procesado con el fin de maximizar la producción posterior a partir de muestras de tejido limitadas.

Los resultados mostrados a continuación ilustran la estrategia de selección por citometría de flujo para la fenotipificación inmune amplia en un tumor de melanoma procesado. El día de la tinción, la muestra de tejido se digirió y homogenizó mediante incubación con colagenasa I y DNasa I durante 60 min a 37 °C con rotación de 225 RPM. Tras la digestión, la suspensión celular se filtró a través de un filtro celular de 70 µm para eliminar restos celulares, y las células se marcaron con anticuerpos fluorescentes para citomet...

La investigación traslacional del cáncer depende de la extracción de tejidos humanos. Se ha trabajado mucho en la optimización de los métodos de extracción para el análisis ex vivo. Aquí, describimos los métodos de procesamiento de tejidos que permiten la máxima salida de datos a partir de muestras limitadas.

Trabajar con Tejidos Humanos para la Investigación del Cáncer Traslacional

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

El objetivo general de este procedimiento es maximizar la calidad y cantidad de datos extraídos de muestras de tejido. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación traslacional del cáncer, como qué mutaciones están presentes, qué vías están activadas y qué subtipos de células inmunitarias infiltran los tumores humanos. La principal ventaja de esta técnica es que se puede generar una gran cantidad de datos a partir de una única resección quirúrgica de tejido humano.Uno de los pasos más críticos antes del procesamiento de la muestra es garantizar la calidad de la muestra y validar la presencia de tumor viable mediante evaluación patológica, tal como se describe en el texto del protocolo. Toda la información relevante sobre la muestra o el tejido, como el nombre del paciente, número, tratamiento y fecha de la cirugía, debe estar fácilmente accesible en una base de datos institucional de tejidos. Las muestras de tejido fresco siempre deben almacenarse sobre hielo húmedo y procesarse lo más rápidamente posible para limitar los cambios inducidos por la extracción de la muestra de tejido de su entorno natural. Las muestras de tejido tumoral y tejido normal apareado deben procesarse por separado.Para evitar la contaminación cruzada, prepare un plato de cultivo estéril, un escalpelo, así como una aguja o pinzas para el procesamiento del tejido. Con el fin de limitar el tiempo de procesamiento de la muestra, disponga todos los elementos necesarios de antemano, tal como se muestra aquí. Coloque la muestra de tejido en el plato de cultivo abierto, en posición plana contra la superficie.Inspeccione la muestra desde todos los ángulos para comprender mejor su estructura y dimensiones. Fije la muestra al fondo del recipiente con la aguja y proceda a bisecar el tejido a lo largo de su eje más largo y representativo. Corte un pequeño trozo de tejido y colóquelo en un tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga un mililitro de solución estabilizadora de ARN.Coloque esta muestra sobre hielo durante el resto del proceso y almacénela a cuatro grados Celsius hasta que sea necesaria. Coloque un casete de biopsia abierto y previamente etiquetado sobre la tapa del recipiente de cultivo de Petri. Corte una porción de tejido que no tenga más de tres a cinco milímetros de grosor y transfiérala al casete.Coloque el casete en formalina tamponada al 10 % durante un mínimo de 72 horas. A temperatura ambiente, corte un trozo de tejido y colóquelo en un molde para tejidos. Cubra la sección de tejido con compuesto de temperatura óptima para corte y congélelo inmediatamente a menos 20 grados Celsius hasta que esté listo para la criosección.Recorte uno o varios fragmentos de tejido y transfiéralos a un tubo de 50 mililitros que contenga tampón max. Los tejidos pueden usarse frescos o almacenarse durante la noche a cuatro grados Celsius para análisis de citometría de flujo. Corte el resto del tejido en fragmentos que no superen un tamaño máximo de 0,5 milímetros por 0,5 milímetros y transfiéralos a viales criogénicos.Congele inmediatamente los tejidos en nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo. Para comenzar este procedimiento, prepare el medio de digestión con DM EMD NS one y colagenasa. Coloque un tumor fresco o almacenado durante la noche en tampón máx en la tapa de una placa de Petri y sumérjalo en el medio de digestión.Fije el tumor al fondo del recipiente con una aguja y corte desde el exterior hacia el centro con un bisturí hasta que el tumor tenga una textura similar a la de una pasta. Transfiera la mezcla de tumor a un tubo de 50 mililitros y selle el tubo para evitar fugas. Coloque el tubo en un incubador y agite a 225 RPM a 37 grados Celsius durante una hora.Después de una hora, filtre la suspensión de células tumorales a través de un filtro celular de 70 micrómetros, centrifugue la suspensión celular a 250 ×g y cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Reuspenda el sedimento celular con un mililitro de tampón fax. Después de contar las células utilizando un hemocitómetro, resuspenda las células a una concentración de uno por diez a la séptima células por mililitro.Transfiera 100 microlitros o 10 a la seis células a cada pocillo de una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Añada 200 microlitros de la solución de tinción de viabilidad a cada pocillo y mezcle. Incube durante 30 minutos a cuatro grados Celsius en la oscuridad. Después de 30 minutos, centrifugue las células a 250 Gs y cuatro grados Celsius durante cinco minutos.Aspire el sobrenadante. Añada la mezcla de anticuerpos a la concentración titulada recomendada para antígenos de superficie en 200 microlitros de tampón fax. Incube las células a cuatro grados Celsius en la oscuridad durante 30 minutos.Centrifugar las células a 250 G y cuatro grados Celsius durante cinco minutos y aspirar el sobrenadante. Lavar con 200 microlitros de tampón fax y centrifugar las células nuevamente. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 200 microlitros de tampón fax. Las células ya están listas para su análisis mediante citometría de flujo. Estos resultados representativos muestran la estrategia de selección por citometría de flujo para la fenotipificación inmune amplia en muestras de tumor de melanoma procesadas como se ha demostrado y almacenadas durante la noche en tampón max a cuatro grados Celsius, que muestran una mortalidad extremadamente limitada.Además, se demuestra el procesamiento del tejido. Permite la fenotipificación amplia multicolor de subpoblaciones de células inmunitarias en melanoma, como células B, células T CD cuatro, células T CD ocho, células T gamma delta, células K, células dendríticas, macrófagos, mastocitos, basófilos, neutrófilos y eosinófilos, una vez dominada. Esta técnica puede realizarse en cuatro horas si se lleva a cabo correctamente.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

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Hemos desarrollado una base de colágeno en el ensayo in vitro, que promueve la proliferación y la invasión de las muestras de todos los subtipos de cáncer de mama. Tomografía óptica de proyección, una técnica de tres dimensiones se utilizó la microscopía para visualizar y cuantificar la expansión del tumor. Este ensayo puede ser utilizado para cuantificar la respuesta al fármaco de las muestras tumorales individuales.

A largo plazo la cultura de muestras humanas del cáncer de pecho y su análisis mediante tomografía óptica de proyección

Se describen los métodos para crear los tejidos tumorales 3D humanos como sistemas de prueba. Estas tecnologías se basan en un descelularizado Biológica vascularizado Andamios (BioVaSc), las células humanas primarias y una línea de células tumorales, que pueden ser cultivadas bajo condiciones estáticas, así como en condiciones dinámicas en un biorreactor de flujo.

Ingeniería de tejidos de un humano 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema de Prueba de Tumores

Los análisis en profundidad de los proteomas de las células cancerosas facilitan la identificación de nuevas dianas farmacológicas y biomarcadores de diagnóstico. Describimos un flujo de trabajo experimental para el análisis cuantitativo de (fosfo-)proteomas en subpoblaciones de células cancerosas derivadas de tumores líquidos y sólidos. Esto se logra combinando estrategias de enriquecimiento celular con espectrometría de masas cuantitativa basada en Super-SILAC.

Misa cuantitativa espectrometría de perfiles de los proteomas de células del cáncer derivados de líquidos y tumores sólidos

Protocolos se describen para el estudio de la migración de células de cáncer de mama, la proliferación y la colonización en un sistema modelo de explante de tejido óseo humano.

Métodos de explantes de tejidos El cultivo fémur humano para el Estudio de la colonización de la célula del cáncer de pecho de la Niche metastásico

Aquí, presentamos un protocolo utilizar inyección guiada por ultrasonido de las células de (ES) el sarcoma de Ewing y neuroblastoma (NB) (estableció líneas celulares y células tumorales derivados del paciente) en sitios biológicamente relevantes para crear modelos preclínicos fiables para el cáncer investigación.

Utilización de ultrasonido guiado implantación celular dirigida de tejido para el establecimiento de xenoinjertos de tumores metastásicos biológicamente relevantes

Los biobancos son recursos cruciales para la investigación biomédica y el Biobanco de Medicina Traslacional y Digital del Instituto Europeo de Oncología es un modelo en este campo. Aquí, proporcionamos una descripción detallada de los procedimientos operativos estándar de los biobancos para la gestión de diferentes tipos de muestras biológicas humanas.

Biobanco para Medicina Traslacional: Procedimientos Operativos Estándar para el Manejo Óptimo de Muestras

Este protocolo describe la generación de ratones del sistema inmune humano (HIS) para estudios de inmunooncología. Las instrucciones y consideraciones en el uso de este modelo para probar inmunoterapias humanas en tumores humanos implantados en este modelo se presentan con énfasis en la caracterización de la respuesta del sistema inmune humano al tumor.

Prueba de inmunoterapia contra el cáncer en un modelo de ratón humanizado con tumores humanos

Los organoides tumorales han revolucionado la investigación del cáncer y el enfoque de la medicina personalizada. Representan un modelo tumoral clínicamente relevante que permite a los investigadores estar un paso por delante del tumor en la clínica. Este protocolo establece organoides tumorales a partir de muestras frescas de tejido tumoral pancreático y xenoinjertos derivados de pacientes de origen adenocarcinoma de páncreas.

Establecimiento de organoides tumorales derivados del cáncer de páncreas y fibroblastos a partir de tejido fresco

Este protocolo presenta un modelo de tumor en un chip fisiológicamente relevante para realizar investigaciones básicas y traslacionales de alto rendimiento sobre el cáncer humano, avanzando en la detección de fármacos, el modelado de enfermedades y los enfoques de medicina personalizada con una descripción de los procedimientos de carga, mantenimiento y evaluación.

Establecimiento de un modelo fisiológico de microtumor vascularizado humano para la investigación del cáncer

Este protocolo describe el procedimiento para disociar rápidamente muestras de tumores humanos y de ratón para la secuenciación de ARN de una sola célula.

Disociación de muestras de tejido tumoral humano y de ratón para la secuenciación de ARN de una sola célula

Aquí se muestra un método único para resecar quirúrgicamente tumores de carcinoma escamoso oral establecido en la cavidad oral.

Modelo de resección tumoral relevante para traslacionalmente para modelos preclínicos de murino de carcinoma escamoso oral

Aprenda métodos de procesamiento de tejidos humanos para investigación oncológica traslacional. Optimice la extracción de datos de muestras quirúrgicas limitadas y mejore el análisis de mutaciones, vías activadas y subtipos de células inmunes.

Trabajar con Tejidos Humanos para la Investigación del Cáncer Traslacional

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