Modelado Encefalopatía del Prematuro El uso prenatal hipoxia-isquemia con lipopolisacárido intraamniótica en ratas

El objetivo general de este procedimiento quirúrgico es proporcionar un modelo reproducible de lesión cerebral asociada con un parto extremadamente prematuro, a través de la inducción de hipoxia sistémica transitoria, isquemia e inflamación intraamniótica en el útero, isquemia e inflamación intraamniótica en ratas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la patogénesis de la lesión cerebral perinatal que surgen de procesos intrauterinos, facilitando el desarrollo de estrategias terapéuticas dirigidas. La principal ventaja de esta técnica es que induce la lesión sistémica que imita las agresiones intrauterinas tanto de infección como de hipoxia, isquemia produciendo déficits neurológicos funcionales en la rata madura.

Este modelo es particularmente adecuado para diseccionar los mecanismos de lesión relacionados con la inflamación. Dado que la hipoxia, la isquemia y los estímulos infecciosos se pueden evaluar individualmente o como una lesión combinada, la demostración del procedimiento correrá a cargo de Lindsey Chan, técnica de nuestro laboratorio. Antes de comenzar el procedimiento, use cortaúñas para animales pequeños para eliminar todo el vello de la región abdominal inferior de un día embrionario.

18 rata preñada en un patrón rectangular, teniendo cuidado de no cortar los pezones o generar erupción de navaja. A continuación, con bastoncillos de algodón estériles, frote la piel con tres aplicaciones alternas de povidona yodada y etanol al 70%. Cuando la piel esté seca, confirme la profundidad adecuada de la anestesia con los dedos de los pies, pellizque y cubra al animal.

A continuación, utilice un bisturí para hacer una incisión de tres centímetros en la línea media del animal, seguida de una disección roma de la capa de piel de la fascia abdominal con unas tijeras. Usar fórceps y tijeras quirúrgicas. Eleve la capa de la fascia abdominal y haga una incisión a través del codo lineal avascular.

Cuando la cavidad peritoneal esté expuesta, coloque una gasa quirúrgica en el exterior de la incisión y humedezca la gasa con solución salina estéril. Luego, usando pinzas romas y presión externa sobre el abdomen, retire suavemente los cuernos uterinos de la cavidad peritoneal y coloque los cuernos sobre la gasa humedecida. Teniendo cuidado de evitar el enredo y el contacto con los intestinos, use solo el tejido muscular entre los sacos amnióticos individuales para organizar los fetos.

Luego, usando una disección roma, exponga y aísle las cuatro arterias uterinas. Teniendo cuidado de no dañar los vasos maternos cuando las arterias han sido aisladas. Coloque una pinza para aneurisma de rata de calibre 30 en cada vaso Antes de aplicar las pinzas, es importante asegurarse de que todo el tejido circundante esté completamente limpio.

Al colocar los clips, asegúrelos con las pinzas romas y luego colóquelos en paralelo. Observar el cese del pulso es fundamental para asegurar la isquemia completa de la hipoxia cuando se han colocado todos los clips. Confirmar el cese de los pulsos proximal y distal y el oscurecimiento de los vasos uterinos, incluso en las placentas individuales.

A continuación, cubra todo el campo quirúrgico con una gasa e irrigar el tejido con solución salina estéril. Cada 10 minutos durante una hora después de 60 minutos, retire la gasa y vuelva a regar el campo. Cuando los cuernos y los vasos uterinos estén adecuadamente humedecidos, use fórceps para retirar suavemente cada clip de aneurisma, teniendo cuidado de no causar trauma en el vaso y mantener la integridad del tejido.

Luego riegue a fondo los cuernos y el campo. Una última vez, teniendo cuidado de retirar los hilos sueltos de gasa de los sacos amnióticos. Para tratar a los fetos con LPS, use pinzas romas para estabilizar y rotar cada saco amniótico de modo que la base de cada saco amniótico individual sea visible.

A continuación, cargue una jeringa de insulina ultrafina de 0,3 mililitros con una aguja de calibre 31 de ocho milímetros adjunta con solución de LPS e inyecte 100 microlitros de la solución justo antes de cada placa placentaria. A medida que se retira la aguja, aplique presión directa sobre el saco amniótico para detener cualquier fuga de líquido. La inserción de una aguja ultrafina de calibre 31 en la base del saco amniótico es fundamental para la administración adecuada de LPS sin permitir que se escape ningún líquido amniótico.

Después de irrigar los cuernos uterinos tres veces con solución salina estéril, use fórceps para devolver los cuernos a la cavidad peritoneal. A continuación, utilice una sutura de seda de tres pulgadas para aproximar los bordes de la capa fascial muscular sin suturar en o a través de un saco, seguido de un cierre de la piel con otra sutura de seda 3.0 corrida. A continuación, utilice una aguja de calibre 26 por vía subcutánea.

Inyecte un mililitro de bupivacaína al 0,125% alrededor de los bordes de la herida. Seque la rata con una toalla según sea necesario, inyecte 0,1 miligramos por kilogramo de buprenorfina en la nuca. Coloque al animal en una jaula casera limpia con monitoreo hasta que se recupere por completo.

Tras la administración de isquemia sistémica transitoria e hipoxia sistémica en el día embrionario 18, como se acaba de demostrar, la tinción con het y eosina revela importantes anomalías histopatológicas tanto en la placenta como en el cerebro. De hecho, la placenta examinada en los días embrionarios 19 y 21 se emite macroscópicamente con microhemorragia y necrosis en toda la decidua y el laberinto. También se observa un importante infiltrado inflamatorio y un aumento de la vascularización.

Los cerebros examinados en el segundo día postnatal revelaron una pérdida de masa ventricular, así como de la sustancia blanca y de la neurona de la subplaca en comparación con la hipoxia sistémica transitoria, la isquemia y el LPS también disminuyeron significativamente la expresión de la proteína cotransportadora de cloruro de potasio dos, un cotransportador de cloruro central para el desarrollo de la inhibición GABAérgica en la corteza en el día postnatal 15. lo cual es consistente con el deterioro de la regulación positiva del desarrollo observado durante el período postnatal crítico de la maduración del circuito. Después de ver este video, debe tener una comprensión sólida de cómo realizar esta cirugía en ratas embarazadas y cómo inducir isquemia transitoria de hipoxia prenatal a través de la oclusión de la arteria uterina con inflamación en el útero a través de la inyección intraamniótica de solución de lipopolisacárido. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en 90 minutos si se realiza correctamente.